有机污染物高效液相色谱分析技术紫外可见光检测器分析酚类化合物.docx
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有机污染物高效液相色谱分析技术紫外可见光检测器分析酚类化合物
有机污染物高效液相色谱分析技术-
（1）紫外-可见光检测器分析酚类化合物
一、实验目的
1、掌握高效液相色谱分析法中的基本原理（包括分配分离原理、紫外-可见光检测器检测原理）；
2、基本了解高效液相色谱（1200LC）组成结构，硬件操作及掌握化学工作站的开机，关机，参数设定，数据采集及分析的基本操作；
3、了解紫外-可见光检测器的基本原理及其适用X围；
4、掌握高效液相色谱定性、外标定量方法。
二、实验原理
液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。
高效液相色谱仪以液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。
与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。
对于酚类化合物的测定，其基本原理是这样的：
先用固相小柱吸附水中酚类化合物，然后用溶剂洗脱，经氮吹气浓缩至一定体积后，用反相高压液相色谱法分析。
在反相色谱柱上以甲醇/（水+乙酸）为流动相把经预处理的酚类化合物分离，用紫外检测器，测定各种酚的峰高或峰面积，以外标法定量。
分配色谱原理：
主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。
1、高效液相色谱的组成结构及各部分作用
（1）四元泵：
混合、脱气作用。
四元泵真空脱气机由一个四通道（有四个管状塑料膜）真空箱和一个真空泵构成。
打开真空脱气机的电源开关后，控制电路即开启真空泵，真空泵运行使真空箱内产生部分真空。
真空度由压力传感测定，根据传感器信号，真空脱气机通过运行或关闭真空泵来维持真空度。
（2）自动进样器
（3）柱温箱：
（4）UV-VIS检测器
（5）C18色谱柱：
分离样品中的各个物质。
流动相——真空在线脱气机——四元比例阀——主动输入阀——泵头——出口单向阀——压力阻尼器（侧压力）——泵头——排液阀——自动进样器（其冷凝水排水管必须高于收集瓶，不能浸在液体里。
其下有一控温模块，定量环标配100ul，一般进样量5ul-50ul较好）——柱温箱——紫外监测器（流通池）——荧光检测器（一定要荧光串联在紫外之前，因其流通池耐压20bar，紫外可耐压40bar）
2、工作过程
Agilent1200LC液相色谱仪的工作过程：
输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。
3、紫外-可见光（UV-VIS）检测器
基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。
很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用X围。
由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。
用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。
（Agilent1200UV-VIS检测波长X围为190nm-600nm）
4、外标法定量
外标法是色谱分析中一种简便的定量方法。
当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。
其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。
数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。
一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。
5、液相色谱分离模式
（1）正相色谱法
采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
（2）反相色谱法
一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
适用于分离非极性和极性较弱的化合物。
RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
表1正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法
反相色谱法
固定相极性
高～中
中～低
流动相极性
低～中
中～高
组分洗脱次序
极性小先洗出
极性大先洗出
三、仪器及试剂
1、仪器
Agilent1200HPLC（四元泵、自动进样器、柱温箱、UV-VIS检测器、C18色谱柱（4.6*150mm，5um）），稳压电源。
2、试剂
色谱级甲醇；Miniport超纯水；含3个酚类化合物的标准样品；实际测试水样（配制）
四、测定方法设置
（1）自动进样器：
“InjectionwithNeedleWash”，进样量10μL；
（2）泵参数：
流速1mL/min，运行时间11min，甲醇：
水=75:
25；
（3）柱温箱参数设定：
柱温箱35℃；
（4）VWD检测器参数设定：
检测波长220nm；
五、实验步骤
1、准备
（1）根据待测物要求配制多个浓度点标准样品，并对样品做好预处理。
标样浓度分别为4ppm，6ppm，8ppm，10ppm，12ppm；
（2）实验前流动相提前配好过滤脱气，并正确置换流动相；
（3）检查管路是否连接完整、检测器是否正常工作
（4）检查废液瓶是否够用。
2、样品分析
（1）打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接检测系统；
（2）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。
冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。
（3）配置仪器，打开工作界面，按操作要求赶流动相气泡：
首先打开排气阀—按PURGE键进行排气结束后—按STOP键停止—再拧紧排气阀—按PUMP键让泵运行；
（4）打开电脑打开在线工站选择对应的通道，输入实验信息方法、包括采样控制，积分和仪器条件，建立平衡柱子分析方法，保存并运行；
（5）然后点数据采集，先走基线，大约1个小时左右基线基本稳定（就是基本成直线，因为检测器打开后需要一定的稳定时间，检测器基本稳定泵里面的流动相同时也就置换好了），柱子平衡了，就可以进样了。
（6）脱机状态下建立样品分析方法，设置自动进样器方法，设置数据保存文件；
（7）运行所设置的序列方法，分析标准样品和实际样品。
具体可分为单个进样和序列进样；
（8）建立清洗及保存柱子的方法，并在样品分析结束后运行。
色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（乙睛/甲醇适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）。
（9）所有程序都结束后，关泵、关灯，退出程序，关闭电脑、机器；
3、数据处理
可在脱机状态下处理实验数据
（1）从“View”菜单中，点击“Dataanalysis”进入数据分析画面；
（2）从“File”菜单选择“Loadsignal”，选中您的数据文件名，则数据被调出；
（3）从“Integration”菜单中选择“IntegrationEvents”选项。
选择合适的“Slopesensitivity”，（4）“Peakwidth”，“Areareject”，“Heightreject”；
（5）从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项，则数据被积分；
（6）如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。
六、实验数据记录
1、标样数据记录
标样浓度
出峰时间
峰面积
峰高
峰宽
对称因子
峰面积%
4ppm
3.454
78.9
13.3
0.0927
0.785
19.762
4.097
88.3
13
0.1041
0.765
22.122
8.357
232
12.7
0.2969
0.984
58.116
6ppm
3.454
119.4
20
0.0928
0.783
20.533
4.096
127.3
19.4
0.1014
0.81
21.897
8.355
334.7
16.5
0.3386
0.979
57.57
8ppm
3.452
161
26.8
0.0933
0.777
20.314
4.1
171.6
25.9
0.1035
0.81
21.643
8.355
460.2
20
0.3862
1.09
58.043
10ppm
3.454
198
33
0.0932
0.779
20.639
4.097
212.4
32.1
0.1019
0.804
22.146
8.339
548.8
22.1
0.4219
1.21
57.214
12ppm
3.452
236.3
39.5
0.093
0.779
20.617
4.094
255
38.4
0.1038
0.796
22.253
8.335
654.7
24.7
0.4536
1.277
57.13
2、样品数据
时间
峰面积
峰高
峰宽
对称因子
峰面积%
3.453
237.4
39.5
0.0935
0.768
20.851
4.096
260.6
38.5
0.1037
0.776
22.883
8.401
640.7
25
0.4388
1.313
56.266
七、数据处理与实验报告
1、定性分析
物质定性分析的结果如表1所示。
表1物质定性分析结果
名称
分子式
分子量
结构
沸点/℃
物质保留时间/min
2-氯酚
C6H5ClO
128.56
174.5
3.454
2.4-二甲基酚
C8H10O
122.16
211-212
4.096
2.4.6-三溴苯酚
C6H3Br3O
330.7
244
8.355
2、定量分析
1）绘制标准曲线
五个标准样品中各物质的浓度及峰面积如表2所示。
表2标准样品中各物质浓度及其所对应的峰面积
目标化合物
4ppm
6ppm
8ppm
10ppm
12ppm
2-氯酚
78.9
119.4
161
198
236.3
2.4-二甲基酚
88.3
127.3
171.6
212.4
255
2.4.6-三溴苯酚
232
334.7
460.2
548.8
654.7
三种物质的标准曲线如下图所示。
绘制标准曲线时，以样品峰面积为横坐标，样品浓度为纵坐标。
2）计算未知样品各物质浓度
根据标准曲线拟合得到的线性方程，将未知样品测得的峰面积代入拟合方程，就可计算得到样品物质浓度的浓度。
计算得到未知样品的物质浓度结果见表3。
表3未知样品各物质浓度
目标化合物
2-氯酚
2.4-二甲基酚
2.4.6-三溴苯酚
对应峰面积
237.4
260.6
640.7
拟合浓度/ppm
11.99
12.29
11.64
3）反算标准样品浓度
本组所做标准样品浓度为4ppm，根据所做标线反算值如下表：
表46ppm标样反算结果
目标化合物
2-氯酚
2.4-二甲基酚
2.4.6-三溴苯酚
对应峰面积
119.4
127.3
334.7
反算浓度/ppm
3.94
4.05
3.96
可知，反算浓度与已知浓度接近，但仍存在一定误差；如需精确试验，应进一步减小误差。
八、思考与讨论
1、简述高效液相色谱分析的特点及应用X围。
高效液相色谱法有“四高一广”的特点：
1）高压：
流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。
2）分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
3）分离效能高。
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比气相色谱的分离效能高出许多倍。
4）紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级。
5）百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
此外，高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等特点。
高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。
在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。
高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。
高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极性的物质。
应用X围如下：
环保方面：
1、农药残留量分析：
含氯农药、有机磷农药、除虫剂等；2、致癌物质：
硝基呋喃及其代谢物、霉素、亚硝胺、苯并芘等；3、水质分析：
内分泌污染物等4、其它
生命方面：
1、蛋白质分析；2、肽类的分析；3、核酸；4、氨基酸；5、其它……
医药方面：
1、新药研发：
目标物的检测、纯度等；2、药品的预处理：
片剂，油膏，水剂等；3、体液：
血、尿、脊椎液、唾液等；4、抗菌素：
青霉素、甾族（激素）等
2、流动相使用前为什么要脱气？
流动相中溶解气体存在会引起以下情况：
1）气泡进入检测器，引起光吸收或电信号的变化，基线突然跳动，干扰检测；
2）溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应；
3）溶解气体还会引起某些样品的氧化降解，对分离和分析结果带来误差。
因此，使用前必须进行脱气处理。
3、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？
溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4-7）。
以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞：
（1）请严格执行溶剂过滤；
（2）请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液；
（3）如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.D:
在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气；
（4）避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。
堵塞后的处理法方法：
将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。
4、为什么溶剂和样品要过滤?
溶剂和样品过滤非常重要，特别是不知道其溶解性和未知成分检验的药品，像研发的中间反应试液，这项尤为重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。
色谱柱：
由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
仪器：
溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
过滤主要是去除样品中可能给输液泵和柱子造成损伤的杂质；任何颗粒物进入液相色谱系统后都会在柱子入口端被筛板挡住，最后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。
因此，要采取各种预防措施，包括操作步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或减少颗粒物进入HPLC系统中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并提高数据的可靠性。
5、高效液相色谱定性、定量的依据是什么？
根据标准样品的保留时间定性；根据标准样品的的标准曲线定量（外标法）。
外标法定量：
外标法是色谱分析中一种简便的定量方法。
当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。
其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。
数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。
一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。
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