云南师范大学微生物综合性实验报告.docx

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云南师范大学微生物综合性实验报告

本科学生综合性实验报告

学号

姓名

学院生命科学学院

专业、班级

实验课程名称培养基的配制，灭菌，土壤微生物的稀释分离纯化，放线菌的分离及形态观察

教师及职称

开课学期2012年至2013学年学期

填报时间2012年12月10日

云南师范大学教务处编印

一、实验设计方案

实验序号：

实验五，六，七

实验名称：

培养基的配制，灭菌，和实验室基本技能，土壤微生物的

稀释分离纯化，放线菌的分离及形态观察

实验时间：

星期五，8.9节

实验室：

睿智三的123

（一）、试验目的

1培养基的配制，灭菌， 目的

1.1了解并掌握培养基的配制、分装方法

1.2掌握各种实验室灭菌方法及技术。

2土壤微生物的稀释分离纯化目的

1.1学习从土壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。

3放线菌的分离及形态观察目的

3.1学习并掌握观察放线菌的基本方法

3.2初步了解放线菌的形态特征 

（三）、实验设备及材料

培养基的配制，灭菌器皿及材料

天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。

药品试剂 

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。

土壤微生物的稀释分离纯化、实验材料和用具

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和普通变形菌（Proteus vulgaris）斜面菌种。

已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶，49.5mL无菌水（带玻璃珠）1瓶，4.5mL无菌水6管，80%乳酸，10%酚液，95%乙醇。

无菌培养皿12套，1mL无菌移液管10支，土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头（用75%乙醇浸泡）、玻璃刮。

放线菌的分离及形态

菌种：

放线菌平板插片培养物

染色剂：

石炭酸复红染液，乳酸石炭酸棉兰固色液

仪器及其他用具：

镊子，解剖针，显微镜，酒精灯，载玻片，擦镜纸

（四）、实验方法步骤及注意事项  

（1）培养基的制备

流程

称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。

 步骤

1  称量药品

根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。

蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。

.2  溶解

用量筒取一定量（约占总量的1/2）蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。

待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。

如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。

.3  调节pH

根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。

测定pH可用pH试纸或酸度计等。

.4  溶化琼脂

固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。

琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。

注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

.5  过滤分装

先将过滤装置安装好。

如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。

过滤后立即进行分装。

分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，

     引起污染。

液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。

固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。

.6  包扎标记

培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。

在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等

 7灭菌

上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。

普通培养基为121℃20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。

培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。

（2）土壤微生物的稀释分离纯化、

取土壤  取表层以下5—10cm处的土样，放入无菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。

2．制备稀释液（要无菌操作）

（1）制备土壤悬液：

称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底力最好），振荡5～10min，使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。

（2）稀释：

用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液（图3-1）。

二）平板制作及划线分离方法。

1．倒平板  按无菌操作要求，在火焰旁操作

2．划线分离  使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落

3放线菌的分离及形态

操作步骤 

用接种铲将平板上的菌苔连同培养基切下一小方块（宽2-3mm）——菌面朝上放在载玻片上——另取一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻按压，使培养物（气生菌丝、孢子丝和孢子）粘附（“印”）在载玻片的中央——将有印记的一面朝上——火焰固定——染色（1min）——水洗——干燥——油镜观察 

印片法：

将要观察的放线菌的菌落或菌苔，先印在载玻片上，经染色后观察孢子丝的形态、孢子的排列及其形状等。

注意事项

1．一般土壤中，细菌最多，放线菌及霉菌次之，而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中，故从土壤中分离细菌时，要取较高的稀释度，否则菌落连成一片不能计数。

2．在土壤稀释分离操作中，每稀释10倍，最好更换一次移

液管，使计数准确。

3．放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多。

4．培养基不能反复高温灭菌，否则会破坏其中的营养成分。

5.培养基灭菌后必须在35-370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。

6.在插片法和玻璃纸法操作过程中，注意在移动附着有菌种的盖玻片或玻璃纸时勿碰动菌丝体，必须菌丝朝上，以免破坏菌丝体的形态。

7.在印片过程中，用力要轻，切不要错动，染色水洗时水流要缓，以免破坏孢子丝的形态。

8.倒平板要厚一些，接种时划线要密。

9、插片时要有一定角度并与划线垂直。

10、观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。

11、如果用0、1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。

二、实验报告

（1）．对实验现象、实验结果的分析及其结论

1培养基的制备原则和要求是什么？

培养基是根据各类微生物生长繁殖的需要，用人工方法把多种物质混合而成的营养物。

一般用来分离、培养菌类。

常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基和厌氧培养基。

在制备培养基时，应掌握如下原则和要求：

（一）培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质。

所用的化学药品必须纯净，称取的份量务必准确。

（二）培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。

按各种培养基要求准确测定调节pH值。

多数细菌生长的适宜pH值为7.2～7.6，呈弱碱性。

2灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？

防止有杂菌引起试验误差也会对实验菌种产生干扰

 3.配制培养液时应注意：

①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；　　

②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；　　

4.什么平板划线分离法平板划线法？

平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表点击此处添加图片说明面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。

有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。

其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

5.你所做的划线法没有得到单菌株的原因?

（1）使用的细菌原液浓度太大

（2）划线接种过多

（3）挑取的菌落过多

（4）运动性强的细菌也有可能连成一片

6.在不同的平板上你可分离哪些类群的微生物？

大肠杆菌，枯草芽孢杆菌

一般都比较小，菌落与培养基结合不紧密，用接种针容易挑取，多数表面较光滑，湿润，较粘稠，易挑取，质地均匀，色泽多样。

3．实验总结

通过本次综合性的实验，我学会了制备培养基，还学会了用一些简单的方法来稀释土壤微生物到我们所需要的浓度。

还学习到了分离，纯化微生物。

使我们尽可能地得到单菌株，这样更有利于我们在油镜下观察微生物的形态特征。

我们会学习了一种新的操作方法，那就是无菌操作。

无菌操作要求我们在实验时要认真，每一步到要按照试验步骤，这样才能保证实验效果达到最好。

而且在操作时不能粗细大意，不然的话，将会破坏无菌的环境。

我们还学习了放线菌的分离及观察，在油镜下找到放线菌的各种形态是十分重要的，也是本次试验的主要目的。

通过综合性试验，是我们了解到了更多的方法去学习微生物，也是我们把理论知识和我们真正观察到的特征在一起对比，是我们更加理解了理论知识，也是理论知识不再那么空洞，而达到了与实际相结合着去学习，也是我感觉到了微生物虽然平常我们看不到，摸不到，闻不到，但学习起来还是有趣的，它并没有我们想象的那么难。

反而我们因看到一些微小的生物而感到很快乐。

是我们学习微生物的兴趣得到了提高，我们也就更加愿意自主的去学习微生物，使我们更想通过我们的观察，通过我们的思考，通过我们的上网查阅资料去了解更多关于微生物的知识。

此外在本次试验中，我们首次学习了无菌操作，这是我们以前从未接触过的一种新的操作方法。

本以为会很难，可慢慢的尝试着去做，逐渐的感觉到真的是熟可以生巧，只要你五尽心的做，不怕失败，不怕错，一次次的从实验中找到自己的不足，那么你每次试验都是成功的，因为你看到了你的缺点，你找到了你还需要努力的地方，只要你不断的完善自己，那么总有一天，你会很成功的做实验，你会觉得做实验其实根本没有我们想象中的难，努力的付出，就一定会有

收获。

在实验中也遇到了一些困难，比如有些实验为真正的达到实验目的，所以在以后的实验中还需努力。

由于是首次接受微生物的实验，所以做起来并不是一切都那么顺利，有些操作步骤还是不能掌握，这些都告诉我们以后还是要尽量的动手去做实验，错不怕错，只要愿意去尝试就可以了，就代表在不断的进步。

6．参考文献

沈萍，范秀容，李广武，微生物学实验（M）版3版

北京:

高等教育出版社，1999

沈萍，微生物学（M）版2版

北京:

高等教育出版社，2006

沈萍，微生物遗传学（M）版

武汉大学出版社，1995

肖敏，沈萍，微生物学学习指导与习题解析（M）

北京:

高等教育出版社，2005

杨文博微生物学实验（M）

北京:

化学工业出版社，2004

陈金春，陈国强，微生物学学习指导（M）

北京:

清华大学出版社，1989

卫扬保，微生物生理学（M）

北京:

高等教育出版社，1989

教师评语及评分：

签名：

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