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实验三苦参生物碱的提取与鉴识

实验三苦参生物碱的提取与鉴识之蔡仲巾千创作

布景

苦参,又名苦骨（见《本草纲目》川）、川参（见《贵州民间方药集》、凤凰爪（见翌广西中兽医药植））、牛参（见《湖南药物志》）,陶宏景谓:

“叶极似槐叶,花黄色,子作荚,根味至苦恶。

”李时珍谓:

“苦以味名,参以功名。

”lz]始载于（（神农本草经》,列为中品。

为豆科（Leg姗z'n口sae）植物苦参（￡叩加rafla。

escensAz't.）的干燥根。

分布于我国南北各地Is],春秋两季采挖,除去根头及小支根,洗净,干燥、或趁鲜切片,干燥。

苦参性味苦寒,归心、肝、胃、大肠、膀肤经。

功能清热燥湿、祛风杀虫、利尿通淋。

用于热痢、便血、黄疽尿闭、赤白带下、阴肿阴痒、湿疹、湿疮、皮肤癌痒、疥癣麻风等诸多病症。

苦参中含有多种有效成分,目前已知的主要有生物碱类、黄酮类、挥发油类化合物,还含有少量醒类、皂试类及氨基酸等其它化合物。

下面分别介绍各类化合物的主要成分。

国内外学者从苦参根、苦参茎和叶及其花【4一l0]中共分离出26种生物碱。

苦参生物碱大多数是哇诺里西咤类（quinolizidine一type）,极少数为双呱陡类（dipiperidine--tyPe）。

喳诺里西陡生物碱多数为苦参碱型生物碱,另有两种金雀花碱型（eytisine一type）生物碱,两种无叶豆碱型（Sparteine一type）生物碱,一种羽扇豆碱型（lupinine一type）生物碱。

包含苦参碱（matrine）,氧化苦参碱（oxymatrine）,槐果碱（sophoearpine）、氧化槐果碱（N一oxysophoearpine）、异槐果碱（isosoph。

Carpine）、异苦参碱（isomatrine）、7,11一去氢苦参碱（7,11一dehydromatrine）、槐胺碱（Sophoramine）、异槐胺碱（isosophoramine）、新槐胺碱（neosophoramine）、■'3一去氢槐胺碱（■`3一dehydrosophoramine）、■`一去氢槐胺碱（■7-dehydrosophoramine）、槐醇（sophoranol）,9。

一经基槐胺碱（9。

一hydroxysophoramine）、5。

9。

一二轻基苦参碱（5。

ga一dehydroxymatrine）、氧化槐醇（sophoranolN一oxide）、雀花碱（lupanine）、臭豆碱（anagyrine）、膺靛叶碱（baptifoline）、Mamanine,Kuraramine、1sokuraramine等。

从苦参根和狭叶苦参根分离的黄酮类化合物己有29种[ll,'2],多数为二氢黄酮和二氢黄酮醇类,少数为黄酮类、异黄酮类、查耳酮类和紫檀素类,其中仅有两种化合物为试,取代基除了罕见的轻基、甲氧基外,多数化合物还具有异戊烯基（取代基A

王秀坤等!

`4】对苦参中的挥发油成分进行了分析,采取苦参粗粉与水共蒸馏,乙醚处理,无水硫酸钠脱水干燥,回收乙醚得油状物,再经气相色谱、质谱分析,共鉴定出47个成分。

鉴定出的化合物以二十烷烃为主成分,占58.12%。

就结构类型看,以烯烃为主,其次为烷烃和醇类,尚含酸醛酮酚等。

从苦参根中还分离得到一系列2一烷基色酮的衍生物I`5]、一种醒类化合物和两种三砧皂试l`6】。

王秀坤等llvl对苦参中的游离氨基酸成分进行了分析与鉴定,鉴定出巧种氨基酸,并计算了各成分的含量。

发现苦参中总游离氨基酸含量为162.51mg/l00ml,其中含量最高的为脯氨酸,107.51mg/l00ml,其次为天冬氨酸29.64mg/100ml。

张俊华等I`s]用色谱等方法分

离,波谱等方法鉴定苦参中化学成分结构,分离得到5个化合物,分别为蔗糖、二十四碳酸、日一谷肖醇、芥子酸十六酷,伞形花内酷,均为首次从苦参中获得,其中芥子酸十六酷为新化合物。

1.本实验通过从苦参中提取苦参生物碱，考察盐酸的浓度和渗漉速度对提取产率的影响

掌握渗漉法和离子交换提取生物碱的原理、方法与工艺过程，并熟悉用柱层析法分离生物碱。

利用苦参生物碱具有弱碱性，可与强酸结合成易溶于水的盐的性质，将总碱从药材中提取出来。

结合动态连接提取工艺过程，实现生物碱充分溶出。

然后，加碱碱化，即可得到苦参生物总碱。

渗滚法（percolation）的提取过程类似多次浸取过程,浸出液可以达到较高浓度,浸出效较好。

此法常温操纵不需加热,溶剂用量少,过滤要求较低,使分离操纵过程简化,尤其适用于热敏性、易挥发且有效成分含量较低或贵重药材提取。

采取0.5%的硫酸溶液对中药材黄连用渗辘法提取,收集7倍量渗媲液即可包管生物碱的提取率,与回流法比较,渗辘法提取物含杂质少、提取率高、使用溶剂量少即l。

渗渡法的操纵技术要求较高,否则会影响提取效率,当提取物为薪性、不容易流动的成分时,不宜使用该法。

鉴识:

将70g聚苯乙烯磺酸型树脂（交联度3%），放入烧杯中，加200ml80℃的蒸馏水溶胀

30分钟，倾出蒸馏水后加入2mol/L盐酸300ml，充分搅拌，放置半小时（静态转型），后

装入树脂柱（2cm×100cm），并使全部酸水溶液通过树脂柱（动态转型），流出液的速度以液

滴不成串为宜。

后用蒸馏水洗至中性，待用。

注意从装柱到洗涤过程中始终坚持液面高

于树脂床。

（1）动态连续提取

①取苦参粗粉200g加一定浓度的盐酸，拌匀，放置30min,使生药膨胀。

②然后装入渗漉桶中，边加边压，层层加紧，全部装完后，药面压平，盖一层滤纸，滤纸上压一些洗净的玻璃塞。

③加入一定浓度的HCl溶液经过药面，以4~5mL/min的速度渗漉，收集渗漉液至无明显的生物碱反应为止，收集渗漉液约2500mL。

（2）交换

①将收集的渗漉液置于阳离子交换树脂进行交换，如交换液有为交换的生物碱时，仍可以继续交换，直至流出液无生物碱反应为止。

②将树脂倾入烧杯中，用蒸馏水洗涤数次，除去杂质，于布氏漏斗中抽干，倒入唐磁盘中晾干。

（3）总生物碱的洗脱

①将晾干的树脂，加浓氨水适量，搅匀，使湿润度适宜，树脂充分膨胀，盖好放置20min。

②装入索氏提取器中，加三氯甲烷300mL在水浴上回流洗脱，提至尽生物碱为止。

③回收三氯甲烷，得棕色粘稠物。

④加无水丙酮适量，加热溶解，过滤，减压蒸干。

需要时重复此操纵，以脱除粗生物碱中的水，再在无水丙酮中重结晶。

3．氧化苦参碱的分离

（1）柱色谱法取100目色谱用氧化铝50g，用漏斗缓慢加入色谱柱内（1cm×24cm，干法装柱），取苦参0.2g，加入适量氧化铝，搅匀，研细，装入色谱柱顶端，先用50ml三氯甲烷通过色谱柱，再用三氯甲烷-甲醇（9:

1）洗脱，流速为1mL/min。

每10mL为一份（约收集15份），经薄层层色谱鉴定，相同流出成分合并，在水浴上挥发去溶剂，剩余物加无水丙酮溶解，放置，析出结晶为氧化苦参碱。

（2）溶解度差别法将苦参总碱溶于少量三氯甲烷中，加入10倍量乙醚，放置后有沉淀析出，过滤吸出的沉淀，滤液浓缩后再溶于少量三氯甲烷中，加入乙醚放置，再过滤析出沉淀，合并两次的沉淀物，用丙酮重结晶，即为氧化苦参碱。

取自制苦参总生物碱约0.1g加1%盐10ml使溶解,过滤,取滤液分置于三支试管中,进行以下试验:

（1）碘化铋钾试验:

于上述一支试管中加入碘化铋钾试剂1~2滴,立即有桔红色沉淀发生.

（2）碘化汞钾试验:

于上述另一支试管中加入碘化汞钾试剂2~3滴,有白色沉淀发生.

（3）碘－碘化钾试验:

于上述第三支试管中加入碘一碘化钾试剂2~3滴,有褐色或棕褐色沉淀发生.

5．苦参生物碱的薄层层析鉴定

（1）氧化铝薄层层析法

吸附剂:

中性氧化铝（Ⅱ级,过160目筛）,干法铺板（软板）.样品:

a.自制苦参碱乙醇溶液;

b.苦参碱尺度品乙醇溶液;

c.自制氧化苦参碱乙醇溶液;

d.氧化苦参碱尺度品乙醇溶液;

e.自制苦参总生物碱乙醇溶液

展开剂:

①氯仿－甲醇（19:

1）展开三次;

②氯仿－甲醇－浓氨水（5:

0.6:

0.2）

显色剂:

喷雾改良碘化铋钾试剂,观察黑点颜色,并与尺度品对照

（2）硅胶薄层层析法

吸附剂:

2%氢氧化钠溶液制备的硅胶G硬板,于110℃烘干半小时.

样品:

同

（1）项下

展开剂:

a.先以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－水（2:

4:

2:

1）展开,展距约8cm,取出,晾干,再以甲苯－丙酮－乙醇－浓氨试液（20:

20:

3:

1）展开,展距第一次相同;

b.氯仿－甲醇－乙醚（44:

0.6:

3）

显色剂:

喷雾改良碘化铋钾试剂和亚硝酸钠乙醇液,观察黑点颜色,并与尺度品对照

1.叙述酸水法及离子交换法提取纯化生物碱的原理。

2.应如何检查

（1）渗漉液中是否含有生物碱？

（2）渗漉液中生物碱是否被交换在树脂上？

（3）离子交换树脂是否已饱和？

3.简述索氏提取器提取原理及特点。

4.在收集渗漉液的过程中，溶液的颜色有何变更？

在回流提取中，有何现象发生？

5.制备性薄层色谱的特点是什么？

1.胡晶红，苦参生物碱的提取和氧化苦参碱的纯化，山东大学硕士学位论文，2007

2.A．Uenoetal．Chem．Pharm．Bull．1978，26，1832

3.陈德昌．中药化学对照品工作手册．北京：

中国医药科技出版社，2000：

142

4.杨云等．天然药物化学成分提取分离手册．北京：

中国中医药出版社，2003：

454

另外的方案

浸渍法（maceration）可在常温或加热的条件下浸泡药材获取有效成分,操纵简单易行,但所需时间长,溶剂用量大,有效成分浸出率低。

常温浸渍是较为经常使用的生物碱提取方法,如秦学功等圈]考察了苦豆子种子中生物的冷浸工艺条件,室温下用稀盐酸提取苦豆籽中的苦参总生物碱,研究分歧条件下的总碱浸出率,最高可达3.7%以上。

陈月圆等Ivol以小聚碱为指标,对黄柏中的总生物碱提取方法进行了优化,分别用水、乙醇和酸作为溶剂,使用乙醇为溶剂的提取率为84.4%,远高于其它两种溶剂。

回流法（circumfluence）是以乙醇等易挥发的有机溶剂为溶媒,对浸出液加热蒸馏,其中挥发性溶剂馏出后再次冷凝,重新回到浸出器中继续介入浸取过程,多采取索氏提取器完成。

此法操纵简便,提取率较高。

龙德清等Ivll用酸性醇回流法提取魔芋中总生物碱,得到最佳的工艺条件为在pH值2一3的酸性醇中回流3h,总生物碱含量为0,39%。

回流法操纵时间较长,且整

个过程处于加热状态,不适用于热敏性生物碱的提取。

渗滚法（percolation）的提取过程类似多次浸取过程,浸出液可以达到较高浓度,浸出效果较好。

此法常温操纵不需加热,溶剂用量少,过滤要求较低,使分离操纵过程简化,尤其适用于热敏性、易挥发且有效成分含量较低或贵重药材提取。

采取0.5%的硫酸溶液对中药材黄连用渗辘法提取,收集7倍量渗媲液即可包管生物碱的提取率,与回流法比较,渗辘法提取物含杂质少、提取率高、使用溶剂量少即l。

渗渡法的操纵技术要求较高,否则会影响提取效率,当提取物为薪性、不容易流动的成分时,不宜使用该法。

随着科学的发展,针对传统提取过程中存在的能耗大、有效成分损耗大杂质较多、效率较低等问题,一些新技术应用于生物碱提取工艺中,在传统方法的基础上利用新技术的强化作用或流体在超临界状态下进行萃取大大提高了提取效率,降低了过程能耗,因其显著优势而成为研究热点。

超声辅助提取（ultrasound一assistedextraetion,UAE）的3个理论依据是超声波热学机理、超声波机械机制和空化作用`侧。

利用超声技术可以缩短提取时间、提高提取率,而且无需加热,提高了热敏性生物碱的提取率且对其生理活性基本没有影响,溶剂使用量相对较少,可以降低成本。

郭孝武曰】对比研究了超声、回流和浸泡3种方式提取益母草中总生物碱的产率,超

声可以使益母草茎组织形态结构发生变更,造成茎内组织细胞损伤,促使益母草总生物碱快速提取,缩短了提取时间。

超声提取4Omin比回流提取Zh产率高42.86%,而所得总生物碱无化学结构改变。

国外对于超声提取生物碱也有研究,A.pjilani等175】利用超声技术在分歧溶剂系统中提取阿托品（atropine）,得到最有效的提取溶剂系统为CH30H/CH3CN（80:

20）,提取

率为1.01%。

微波萃取又称微波辅助提取（mierowave一assistedextraCti。

n,MAE）,利用介电损耗和离子传导的原理,根据分歧结构物质吸收微波能力的差别,对某些组分选择性加热,可使被萃取物质从体系中分离进入萃取剂附l。

郭锦棠等脚l对微波与索氏回流方法提取生物碱进行了研究,发现联合微波与索氏提取法对黄连中盐酸小聚碱的提取效果优于单独索氏提取。

高姗[vs]利用微波萃取,采取正交试验优化了十大功劳叶中小璧碱的提取条件。

Feizhang等f79]对比分歧方法提取博落回（Macleayaeordata（wsnd）R.Br.）中的血根碱和白屈菜赤碱,得出微波萃取比浸渍、超声辅助提取等更为有效。

相对于

传统方法,微波萃取质量稳定、产量大,选择性高、节省时间且溶剂用量少、

能耗较低。

但微波萃取受萃取溶剂、萃取时问、萃取温度和压力的影响,选

择分歧的参数条件,往往得到分歧的提取效果。

超临界流体萃取（Supercriticalfluidsextraetion,SCFE）是20世纪

90年代发展起来的一项新型提取技术,利用超临界流体（SupercritiCal

fluids,SCF）为萃取剂,从液体或固体中萃取目标组分。

SCF特有的理化性

质[s0l[“`]使其具有比液体溶解能力大、比气体易于扩散和运动且传质速率远

高于液相过程的特点,目前普遍采取的SCF为C02。

超临界流体萃取具有以下

优势:

（1）萃取率高;

（2）选择性高,分离完全;（3）工艺简单,操纵费用低;（4）

操纵温度低,适于热敏性物质提取;（5）COZ无毒、不容易燃,平安性高且价

格低廉。

目前利用超临界流体萃取技术提取天然成分已成为研究热点。

张立

伟等[sz]利用超临界coZ流体萃取苦参中的总生物碱,提取率为惯例方法的

2.4倍,耗时为惯例方法的1/3。

LiuB等1831从防己科植物青藤中用超临界coZ

流体提取汉防己碱,在萃取过程中是否加入甲醇改性剂的提取率不同巨大,

分别为7.47mg/g和0.17mg/g。

经过溶剂提取后的生物碱溶液除生物碱及盐类之外还存在大量其它脂

溶性或水溶性杂质,需要进一步纯化处理,将生物碱成分从中分离出来。

通

常使用的是有机溶剂萃取、色谱和树脂吸附,随着新技术如分子印迹、膜分

离技术的发展和应用,大大简化了过程、提高了纯化效率。

有机溶剂萃取（organieSolventextraetion）是利用提取物中各成分在

两种互不相溶的溶剂中分配系数分歧达到分离的方法,萃取时组分在两相溶

剂中的分配系数越大分离效率越高,分离效果越好。

对于亲脂性生物碱,利

用非极性和低极性有机溶剂如苯、乙醚、氯仿等与水进行液液萃取;对于水

溶性生物碱,利用极性较大的有机溶剂如乙酸乙酷、丁醇等与水溶液萃取。

有时可用多种溶剂配制成两相互不相溶的溶剂进行萃取[s']。

有机溶剂萃取

是生物碱纯化的经典技术,应用广泛,具有操纵简单、容易放大的优点,但

分离效率和纯度较低,使用大量有机溶剂,操纵平安性欠安。

色谱法（chrolnatography）也称层析法,是一种物理分离方法,可以用于

分离纯化和鉴定中药有效成分。

色谱法包含纸色谱、薄层色谱和柱色谱,其

中经常使用吸附柱色谱纯化生物碱成分,一般使用吸附剂为硅胶和氧化铝。

利用5102·xH20作为吸附剂,约90%以上的分离纯化工作均可使用此法。

硅胶是中性无色颗粒,性能稳定,分离效率与其粒度、孔径及概况积等因素

煎煮法（dec0Ction）是中药最早、最经常使用的制剂方法之一,适用于有效

成分能溶于水,且对加热不敏感的药材,能够提取出相对较多的有效成分。

黄际薇等脚]采取酸水煎煮,以苦参碱和氧化苦参碱的提取率为指标,用正交

试验法优选了山豆根的提取工艺。

M.G.ortega等!

0sl考察了使用煎煮法从石

松属药材植物HuperziaSaururus中提取生物碱,取809干燥粉碎后的药材,

用600ml沸水煎煮2次,每次时间为lh,合并提取液后碱化,然后用氯仿萃

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有关1851。

硅胶柱色谱使用范围广,可作为极性和非极性生物碱的纯化,成本

低、操纵方便。

张兰兰等186}研究了钩吻总生物碱中钩吻素子的提取与分离,

经过溶剂回流提取后,用碱性硅胶柱层析分离钩吻素子取得了很好的效果。

以A12仇作为吸附剂的层析分离法,根据氧化铝制备和处理方法差别,分

为碱性、中性和酸性3种,其中碱性和中性的氧化铝适用于分离酸性较大、

活化温度较高的生物碱类成分。

有文献报导粉防己生物碱经粗提后用A12仇

层析方法正向分离非酚性粉防己碱与粉防己诺林碱有较好的效果187]。

需要注

意的是A1203的粒度对分离效率有显著影响,一般粒度范围在100~160目,低

于100目则分离效果差,高于160目则溶液流速太慢。

树脂吸附包含离子交换树脂（ion一exchangeresin）和大孔树脂（macro

一porousresin）。

树脂吸附解脱了传统纯化法得到的制剂大、黑、粗,使

用不方便且溶剂用量大的缺点,因其具有的诸多优势而成为应用日益广泛的

纯化技术。

离子交换树脂主要通过静电引力和范德华力选择吸附,根据自己特性分

为多种类型。

针对生物碱的性质选用强酸型阳离子交换树脂,将酸化的生物

碱提取液通过树脂,使生物碱盐的阳离子交换到树脂上而与其它成分和杂质

分离。

经过离子交换后的树脂用氨水碱化得到游离态生物碱,等树脂晾干后

根据生物碱的亲脂或亲水性质用相应的溶剂进行提取得到总生物碱。

王洪新

等lss]分别用动态法和静态法筛选离子交换树脂用于纯化苦豆子中的生物碱,

考察了pH值、助溶剂等因素对纯化效果的影响,对苦参生物碱生产具有指导

意义。

大孔树脂是在离子交换树脂基础上,自20世纪60年代初开发出的一类新

型高聚物吸附剂,其纯化机理是利用特殊吸附剂一一大孔树脂的吸附性和分

子筛结合的原理,选择性吸附中药提取液中有效成分,去除杂质。

树脂经过

洗脱、浸泡、冲洗等过程处理后再生可重复使用。

目前多数生物碱成分的纯

化都可采取此技术,相对于盐析、沉淀等传统技术,大孔树脂吸附具有以下

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3个优点:

（l）溶剂用量少;

（2）产品质量高,稳定性好;（3）生产周期短、设

备简单。

这些优良的性能使大孔树脂吸附在近年来受到越来越多的关注1501。

聂其霞等100]比较了醇沉、大孔树脂吸附和吸附澄清3种方法对黄连解毒汤中

小巢碱含量的影响,发现大孔树脂法为最佳的纯化方法。

分子印迹技术（moleeularimprintingteehnology,MIT）是20世纪末出

现的一种高选择性分离技术,通过印迹、聚合、去除印迹分子3步制备分子

印迹聚合物（MIPs）,以其特定的分离机理而具有极高的选择性,可以作为高

度专一的固相萃取资料[0ll。

黄晓冬等脾】制备了辛可宁（cinchonine）分子印

迹聚合物手性整体柱,可在Zmin内实现非对映异构体辛可宁和辛可尼丁

（cinchonidine）分离。

目前MIT分离生物碱的技术尚属研究阶段,需要在热

力学及动力学性质、MIPS制备、降低成本等方面作进一步探索。

膜分离技术（membraneseparationtechnology,MST）是一项新兴的高效

分离技术,分离过程以选择透过性膜作为分离介质,通过在膜两侧施加某种

推动力（如压力差、化学位差、电位差等）,使原料液中组分选择性通过膜。

以压力差为推动力的膜分离过程包含微滤、超滤、纳滤、反渗透,根据筛分

原理使某些组分选择性透过,实现提纯和浓缩193】。

以电位差为推动力的膜分

离过程主要是电渗析,利用带电离子在电场下的移动和离子交换膜的选择透

过性实现分离、提纯,所用离子交换膜的分离原理与离子交换树脂相同。

与

惯例的离心、沉降、过滤、萃取等传统技术相比,膜分离技术的优势表示为:

（1）分离过程无相变,高效节能环保;

（2）分离设备简便易操纵;（3）周期短、

平安性高四】。

膜分离技术作为一项新型分离、提纯手段,对于我国中药财产

的技术改造和现代化发展具有重大意义。

超滤（ultrafiltration,UF）的孔径范围为1~100nm,截留相对分子质

量为103~106。

一般来说生物碱的相对分子质量多在1000以下,而提取液中

的一些蛋白质、多肤、多糖等无效成分相对分子质量大于104,因此超滤技

术可以作为纯化生物碱的有效手段。

马向阳等娜J用中空纤维膜对苦豆子盐

酸提取物中的生物碱进行了超滤纯化的研究,结果标明超滤可以有效去除苦

山东大学硕士学位论文

%。

李淑丽等哪}比较了超滤与醇沉法对黄连解毒汤中有效成分小聚碱的纯

化效果,试验结果标明超滤能够更多去除料液中的杂质,生物碱有效回收率

为95%,明显高于醇沉法73%的有效回收率。

分歧的膜会对生物碱提取发生

影响,黄罗生等四l探讨了分歧截留相对分子质量的超滤膜对四逆汤中乌头总

碱的影响,结果标明乌头总碱的损失与超滤膜截留相对分子质量成反比。

微滤（miCr。

filtration,MF）的孔径在102一lo4nm,一般作为纯化的前

处理过程,可以起到很好的过滤杂质的效果,高红宁等[0s,99珠日用无机陶瓷微

滤膜对苦参水提取液进行处理,微滤后可以得到澄清透明液体,固形物去除

率为39.5%,与醇沉法相当,生物碱保存率在79.72%,结合大孔树脂法精

制苦参中氧化苦参碱,保存率为78.88%,高于醇沉法,保存更多有效成分

和更完全去除杂质。

膜分离技术相对其它分离技术具有显著的优势,但也存

在一些鱼待解决的问题,如膜在使用过程中的抗污染能力不强,通量衰减造

成性能下降,使用寿命短等,尚需在膜资料的选择、优化预处理和清洗方

法上作进一步的研究。