PCR仪常见问题及回答.docx
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PCR仪常见问题及回答
PCR仪常见问题及回答
1.cDNA产量的很低
可能的原因:
*RNA模板质量低
*对mRNA浓度估计过高
*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
*同位素磷32过期
*反应体积过大,不应超过50μl
2.扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系
*与反应起始时RNA的总量及纯度有关
*建议在试验中加入对照RNA
*第一链的反应产物在进行PCR扩增时,在总的反应体系中的含量不要超过1/10
*建议用Oligo（dT）或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。
由于RNA模板存在二级结构,如环状结果,有可能导致GSP无法与模板退火;或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
*目的mRNA中含有强的转录中止位点,可以试用以下方法解决:
a.将第一链的反应温度提高至50℃。
b.使用随机六聚体代替Oligo（dT）进行第一链反应。
3.产生非特异性条带
*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。
如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带,则需要用DNaseI重新处理样品。
*在PCR反应中,非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。
在低于引物Tm2至5℃的温度下进行退火,降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
*由于mRNA剪切方式的不同,根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。
4.产生弥散（smear）条带
*在PCR反应体系中第一链产物的含量过高
*减少引物的用量
*优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数
*在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时,其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增,一般会显示为弥散背景。
5.产生大分子量的弥散条带
*大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的
*对于长片段的PCR,建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:
10（或1:
100-1:
200）
6.在无反转录酶的情况下,对照RNA获得扩增结果
*通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。
由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。
建议可将第一链cDNA稀释1:
10、1:
100、1:
1000倍以消除DNA污染所造
成的影响。
*有可能是引物二聚体的条带
7.扩增产物滞留在加样孔中
*有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。
建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。
*另外,在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃,可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。
8.SSⅢ与SSⅡ有何不同?
*具有更高的热稳定性（达50℃）
*具有更长的半衰期（达220分钟）
*对PCR无抑制
*干冰运输
*Tdt活性更低
9.为什么有人更喜欢用SSⅢ而不是ThermoScript?
ThermoScript如果保存不当会引起活性很快降低,SSⅢ则更稳定。
10.为什么使用基因特异性引物（GSP）?
GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。
OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录;随机引物用于mRNA片段的逆转录。
11.什么情况下需要使用RNaseH?
在第一轮PCR中RNA/DNA杂合体不能正常变性时
12.根据不同的目的选择不同的系统:
目的建议
RT与PCR使用不同的引物
或需要灵活选择PCRDNA聚合酶两步法RT-PCR系统
高灵敏度一步法或两步法RT-PCR系统
高特异性含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统
或具有高保真PlatinumTaq酶的一步法RT-PCR系统
高保真度含有PfxTaq酶的两步法RT-PCR系统
长的反转录结果通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果
含Elongase酶的一步法RT-PCR系统
二、Generacer
1.如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）?
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物,您在设计引物时需要注意以下几点要求:
*50-70%的GC含量,以提高引物熔点（Tm）
*23-28个碱基长度,以提高引物特异性
*降低3’端GC含量,将引物非特异性结合的可能性降至最低
2.为什么得不到RACE产物?
*加入Hela对照
*低质量的RNA模板
*逆转录失败,SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
*目的基因丰度太低,可以通过提高PCR的循环次数来解决,建议使用巢式PCR
*目的基因没有表达,可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太长而不适合进行反转录,建议使用GeneRacer试剂盒中的OligodT来得到全长cDNA,使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
*cDNA模板属于困难模板,可以通过以下方法解决:
优化PCR反应参数及反应体系;降低退火温度;使用5-10%的DMSO帮助通过高GC含量区;使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
3.RACE的PCR结果有杂带
RACEPCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因:
*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
*RNA降解。
*PCR管或试剂污染。
注意:
杂带一般是因为没有优化PCR条件,可以加入阴性对照来确定。
4.得不到全长的5’RACEPCR产物
*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板,可以同GeneRacerRNAOligo连接。
一定要小心操作,保证RNA无降解。
*CIP脱磷酸不完全,可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。
*PCR产生了杂带,并不是真正的连接产物,可以使用上述建议优化PCR。
二、Generacer
1.如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）?
使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物,您在设计引物时需要注意以下几点要求:
*50-70%的GC含量,以提高引物熔点（Tm）
*23-28个碱基长度,以提高引物特异性
*降低3’端GC含量,将引物非特异性结合的可能性降至最低
2.为什么得不到RACE产物?
*加入Hela对照
*低质量的RNA模板
*逆转录失败,SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成
*目的基因丰度太低,可以通过提高PCR的循环次数来解决,建议使用巢式PCR
*目的基因没有表达,可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因
*目的基因太长而不适合进行反转录,建议使用GeneRacer试剂盒中的OligodT来得到全长cDNA,使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
*cDNA模板属于困难模板,可以通过以下方法解决:
优化PCR反应参数及反应体系;降低退火温度;使用5-10%的DMSO帮助通过高GC含量区;使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
3.RACE的PCR结果有杂带
RACEPCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因:
*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
*RNA降解。
*PCR管或试剂污染。
注意:
杂带一般是因为没有优化PCR条件,可以加入阴性对照来确定。
4.得不到全长的5’RACEPCR产物
*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板,可以同GeneRacerRNAOligo连接。
一定要小心操作,保证RNA无降解。
*CIP脱磷酸不完全,可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。
*PCR产生了杂带,并不是真正的连接产物,可以使用上述建议优化PCR。
三、PCR
在进行PCR时:
*请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物,也没有加入过量的Mg++
*请确保您使用了恰当的退火温度
*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶
四、引物
1.应该选择哪种纯化方法?
取决于实验目的和引物的长度
2.为什么我订购了50nmol,但是收到却只有40nmol?
50nmol是起始量
3.怎样制备100μM的储液?
体积（μl）=质检报告上的nmol数目×10
4.怎样设计引物?
*一般长度20-30bp;
*至少50%的GC含量;
*避免引物二聚体和二级结构;
*引物对的Tm值应该接近。
5.引物序列有插入或缺失?
*使用上游和下游引物多测几个克隆。
*请选择正确的纯化方法。
6.PCR无结果?
*请检查引物设计是否正确;
*请检测OD读数是否正确;
*做一个阳性对照和一个阴性对照
PCR常见问题总汇
PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。
常见问题如下:
一、假阴性,不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及,④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:
①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。
⑤模板核酸变性不彻底。
在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活:
需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物:
引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:
①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。
Mg2浓度:
Mg2离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变:
通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。
物理原因:
变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异:
如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的。
二、假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。
引物设计不合适:
选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列。
靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。
需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染:
这种污染有两种原因:
一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。
这种假阳性可用以下方法解决:
操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。
可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法
来减轻或消除。
三、出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现,其原因:
一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。
二是Mg2离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。
其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有:
必要时重新设计引物。
减低酶量或调换另一来源的酶。
降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。
适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性,65℃左右退火与延伸）。
四、出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。
其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。
其对策有:
1、减少酶量,或调换另一来源的酶。
2、减少dNTP的浓度。
适当降低Mg2浓度。
增加模板量,减少循环次数。
克隆PCR产物
1）克隆PCR产物的最优条件是什么?
最佳插入片段:
载体比需实验确定。
1:
1（插入片段:
载体）常为最佳比,摩尔数比1:
8或8:
1也行。
应测定比值范围。
连接用5ul2X连接液,50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶,插入片段共10ul。
室温保温1小时,或4℃过夜。
在这2种温度下,缺T-凸出端的载体会自连,产生蓝斑。
室温保温1小时能满足大多数克隆要求,为提高连接效率,需4℃过夜。
2）PCR产物是否需要用凝胶纯化?
如凝胶分析扩增产物只有一条带,不需要用凝胶纯化。
如可见其他杂带,可能是积累了大量引物的二聚体。
少量的引物二聚体的摩尔数也很高,这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆,而非目的插入片段。
为此需在克隆前做凝胶纯化。
3）如果没有回收到目的片段,还需要作什么对照实验?
A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落,表明氨苄失效,或污染上带有氨苄抗型的质粒,或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒,计算菌落生长数,测定转化效率。
例如,将1ug/ul质粒1:
100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。
用SOC稀释到1000ul后,用100ul铺板。
培养过夜,产生1000个菌落。
转化率为:
产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。
具体而言转化用10ngDNA,用SOC稀释到1000u后含10ngDNA,用1/10铺板,共用1ngDNA。
转化率为:
1000克隆X10（3次方）ng/铺板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落,感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照,或PCR产物,产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ug感受态细胞）,表明载体失去T。
可能是连接酶污染了核酸酶。
T4DNA连接酶（M1801,M1804,M1794）质量标准好无核酸酶污染,不应用其它来源的T4DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-TEasy载体,连接pGEM-T正对照,转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤,可得100个菌落,其中60%应为白斑,如产生>20-40蓝斑,没有菌落或少有菌落,连接有问题。
4）对照实验结果好,却没有回收到目的片段,实验出了什么问题?
A）连接用室温保温1小时,能满足大多数克隆,为提高效率,需4℃过夜。
B）插入片段带有污染,使3`-T缺失,或抑制连接,抑制转化。
为此,将插入片段和pGEM-T正对照混合,再连接。
如降低了对照的菌落数,插入片段需纯化,或重新制备。
如产生大量的蓝斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-TEasy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。
用凝胶纯化的插入片段,因受UV过度照射,时有发生。
UV过度照射会产生嘧啶二聚体,不利于连接,DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-TEasy载体克隆所需。
加TaqDNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。
详情查pGEM-TpGEM-TEasy载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定,在扩增中产生缺失和重排,如发现插入片段高频率地产生缺失和重排,需用重组缺陷大肠杆菌菌株,如SURE细胞
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系:
10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10~100pmol
模板DNA0.1~2ug
TaqDNA聚合酶2.5u
Mg21.5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
PCR反应五要素:
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2
引物:
引物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则:
①引物长度:
15-30bp,常用为20bp左右。
②引物扩增跨度:
以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基:
GC含量以40-60%为宜,GC太少扩增效果不佳,GC过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性:
引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量:
每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高
会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U（指总反应体积为100ul时）,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1MNaOH或1MTris。
HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装,-20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制）,如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低）,就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
dNTP能与Mg2结合,使游离的Mg2浓度降低。
模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是:
溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。
Mg2浓度Mg2对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。
Mg2浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性,使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置:
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因（长度为100~300bp时）可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。
①变性温度与时间:
变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下,93℃~94℃min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性,就会导致PCR
失败。
②退火（复性）温度与时间:
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃~60℃,可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸,GC含量约50%的引物,55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:
Tm值（解链温度）=4（GC）+2（AT）
复性温度=Tm值-（5~10℃）
在Tm值允许范围内,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30~60sec,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:
TaqDNA聚合酶的生物学活性:
70~80℃150核苷酸/S/酶分子
70℃60核苷酸/S/酶分子
55℃24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时,DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为72℃,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般1Kb以内的DNA片段,延伸时间1min是足够的。
3~4kb的靶序列需3~4min;扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增
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