发酵工程知识总结及考试重点.docx

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发酵工程知识总结及考试重点

绪论

发酵工程：

是一门以微生物、动植物细胞为生物作用剂进行产品工业化生产的系统工程。

涉及范围包括发酵工艺和发酵设备两大部分。

主要研究内容有菌种选育与构建、大规模培养基和空气的灭菌、大规模细胞培养过程、细胞生长和产物形成动力学、生物反应器的优化设计和操作、生物反应过程的参数检测和计算机应用、发酵产品的分离纯化过程中的技术问题。

发酵工程原理是指导发酵产品研究与开发，发酵工厂设计与建设以及发酵生产实践的理论。

初级代谢：

初级代谢为许多生物都具有的生物化学反应，例如能量代谢及氨基酸、蛋白质、核酸的合成等，均称为初级代谢。

初级代谢产物是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。

次级代谢：

次级代谢是在一定的生长时期（一般是稳定生长期），微生物以初级代谢产物为前体合成的对微生物本身的生命活动没有明确功能的物质的过程。

第二章

自然选育：

在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。

引起自然突变的原因有两个：

多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。

杂交育种：

是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。

诱变育种：

指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。

原生质体融合育种：

把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称为原生质体）。

两个亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两个亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。

在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。

如何从一个菌种得到另一个菌种

如从生产菌种获得缺陷型：

①诱变剂处理：

采用辐射、化学试剂等因素处理细菌。

②淘汰野生型：

抗生素法或菌丝过滤法。

③检出缺陷型：

用一个培养皿即可检出，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的有逐个捡出法和影印检出法。

④鉴定缺陷型：

可借生长谱法进行。

一、如何从土壤中筛选芽孢杆菌（微生物）？

采样---预处理---增殖培养---纯种分离---菌落选择---初筛---复筛---野生菌株---性能鉴定（生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）---菌种保藏

1采样用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样10～25 g，装入事先准准备好的塑料袋内扎好、编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件。

悬液稀释预处理从土壤中分离芽孢杆菌时,由于芽孢具有耐高温特性,100℃很难杀死,要在121℃才能彻底死亡。

分离培养基营养成分、PH、选择性抑制剂培养注意温度、PH、氧气需求及培养时间

菌落选择铺菌法、复印法复筛生长速率、底物消耗、产物合成的测定。

菌种保藏原理、常用方法

原则：

菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。

一般可以通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于休眠状态，抑制其繁殖能力。

常用方法：

（1）斜面冰箱保藏法：

三个月。

（2）石蜡油封存法：

六个月。

（3）沙土管保藏法：

产孢子或芽孢的微生物。

1年左右。

可适用于不能利用石蜡又作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物。

1年左右，（4）真空冷冻干燥保藏法：

5年左右。

需要一定设备，要求比较严格。

保护剂：

脱脂牛奶、血清等。

（5）液氮超低温保藏法：

或超低温冰箱保藏法，通常在微生物孢子或营养细胞培养物中加入20%的甘油，将其保存在液氮或-80℃冰箱中，可保藏数年而不死。

第三章

前体：

指某些化合物加入发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物中去，而自身结构并没有明显变化，产物的产量却因前体的加入而有较大的提高。

最早在青霉素发酵中发现在玉米浆提高了青霉素产量，后研究发现是因为玉米浆中含有苯乙胺所致。

抑制剂：

某些化合物可以抑制特定代谢途径的进行，而使另一种代谢途径活跃，从而获得人们所需产物的积累。

如生产甘油加抑制剂亚硫酸钠，它与代谢过程中的乙醛生成加成物。

这样使乙醇代谢途径中的乙醛不能成为NADH2（还原型辅酶I）的受氢体，而使NADH2在细胞中积累，从而激活α－磷酸甘油脱氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮取代乙醛作为NADH2的受氢体而还原为α－磷酸甘油，其水解后即形成甘油。

促进剂：

指那些既不是营养物质又不是前体，但却能提高产量的添加剂，如加巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌推迟自溶，延长分泌期。

培养基主要营养成份及其生理功能

培养基的成分大致可分为碳源、氮源、生长因子、无机盐及微量元素、水和能源。

碳源，细胞及其产物的碳架结构和能量的来源。

氮源，主要用于构成菌体细胞物质（如氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物等的氮素来源。

生长因子，微生物代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成。

无机盐元素：

P、S、Ca、Mg、Na、K、Fe、Cl等。

P：

核酸、ATP辅酶、代谢中间体的组成成分。

在代谢途径的调节方面，起着重要作用，有利于糖代谢的进行。

S：

蛋白质、辅酶、生物素、谷光甘肽等组成成分。

硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基。

Fe：

细胞色素、过氧化氢酶的组成成分。

Mg、Ca：

酶的辅基、激活剂。

K、Na：

调节渗透压。

虽不参与细胞的组成，但它们与维持细胞的渗透压有关，故是微生物发酵培养基的必要成分。

微量元素：

Zn、Co、Mn、Cu等，主要是酶的辅基和激活剂。

水分，是营养物质，因为离开水生命活动即停止；参与代谢活动，如水解与合成多糖、蛋白质等均有水参加反应；是环境条件，许多反应需要在水中进行；是细胞物质的连续相；此外，水的比热大，可容纳、传导代谢活动中的能量而保护细胞物质不被破坏。

能源，为微生物提供生长代谢所需的能源。

在应用中，培养基的碳源常常就是其能源，但这并非适用于所有的微生物，微生物根据其生理类群的不同，其能源物质也不同，有时能源物质是独立于碳源之外的。

发酵工业中常用碳源及其优缺点

碳源，是组成培养基的主要成分之一。

即细胞及其产物的碳架结构和能量的来源。

常用的碳源有糖类、油脂、有机酸、低碳醇、烃类。

在特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解产物或氨基酸等也可被某些菌种作为碳源使用。

（1）糖类：

a．速效碳源，如葡萄糖、蔗糖、糖蜜等。

优点：

易于利用。

缺点：

高浓度会造成抑制，利用过程中产酸速度快，使pH下降。

葡萄糖是碳源中最易利用的糖，几乎所有的微生物都能利用葡萄糖。

但是过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，如丙酮酸、乳酸、乙酸等导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。

b.长效碳源，如淀粉、糊精等，它们一般都要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。

可以克服葡萄糖代谢过快的弊端。

优点是长效，边糖化边利用，不会造成高浓度抑制，且价格较便宜。

缺点是增大培养基的粘度且有些微生物不具有淀粉酶和糖化酶，不能利用这类碳源。

另外，麦芽也被广泛使用在啤酒工业中。

农产品，如玉米粉、甘薯粉、土豆粉等。

优点是价格便宜成本低。

缺点是成分复杂携带杂质影响某些产品的提取。

（2）油脂：

能被许多微生物用作碳源和能源，这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶。

在脂肪酶的作用下，油脂被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步氧化成CO2和H2O,并释放出大量的能量。

如豆油，菜子油、葵花油、猪油鱼油等。

优点是高还原态能源和碳源，同时也是消沫剂。

缺点是脂肪的分解利用，可造成有机酸积累，使培养液pH下降。

（3）有机酸盐：

如乙酸盐、柠檬酸盐等，也可做速效碳源，缺点是成本较高，利用后pH上升。

有机酸盐的氧化常伴随着碱性物质的产生，使pH上升。

（4）醇类：

如乙醇，低浓度是可被少数微生物作碳源，缺点是成本高。

甲醇已做为某些生产单细胞蛋白的工厂的主要碳源。

（5）烃类：

石油微生物的碳源，其他微生物一般不能利用。

近年来随着石油工业的发展，微生物工业的碳源也有所扩大，一些烃类物质已用于发酵工业中。

培养基主要无机盐及其生理功能

P：

核酸、ATP辅酶、代谢中间体的组成成分。

在代谢途径的调节方面，起着重要作用，有利于糖代谢的进行，能促进微生物的生长。

S：

蛋白质、辅酶、生物素、谷光甘肽等组成成分。

硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基，

Fe：

细胞色素、过氧化氢酶的组成成分，是菌体有氧氧化必不可少的元素。

Mg、Ca：

酶的辅基、激活剂。

K、Na：

调节渗透压。

虽不参与细胞的组成，但它们与维持细胞的渗透压有关，故是微生物发酵培养基的必要成分。

Cl：

在一般微生物中不具有营养作用，但对一些噬盐菌来讲是有用的。

如何使培养基有一个适当的PH缓冲能力

开发一个菌株的培养基配方：

（1）研究思路与原则：

A）要研究一个新选菌株的最佳培养基配方和最适培养条件，必须先要了解该菌的营养类型和生态类型。

B）根据上述考察结果，确定培养基的类型和划定培养条件的范围。

C）进行培养基成分与培养条件的选择：

（a）要根据供试菌的营养需要，包括生长需要和合成产物的需要。

（b）比例范围，如C：

N比。

（c）培养基物态。

（d）pH缓冲能力。

（e）培养温度。

（f）溶氧。

（g）原料价格、来源、加工方式。

考虑生态条件时，既要考虑生长，也要考虑产物合成；既要考虑到产量，也要考虑到产品的提取与后加工。

（2）研究方案设计：

（A）选择因子与水平，先选因子后选水平（B）选择适宜的正交表，或者响应面方法，如爬坡法。

（C）填写表格，配制培养基，准备培养条件。

（D）建立检验指标与方法。

（3）操作及注意事项：

摇瓶规格要一致，培养基要准确。

不能染菌。

种子液要混匀，加量要准确。

检验结果要准确。

（4）计算与分析：

确定培养基配方与环境条件控制指标。

（5）验证试验与适当调整

如何使培养基有一个适当的PH缓冲能力？

生理酸性、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配，以使pH值在发酵过程中不易超过一定范围。

（在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，如不及时调节，就会抑制甚至杀死其自身，因而在设计培养基时，就要考虑培养基成分对pH的调节能力。

如：

借磷酸缓冲液进行调节；用CaCO3或NaHCO3来调节）

第四章

灭菌：

所谓灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或除掉物料及其器皿中所有的生命体。

而消毒则是指杀死病原微生物的过程。

分批灭菌：

是指将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定温度后维持一段时间，再冷却到发酵所需温度的灭菌方式。

连续灭菌：

是指在发酵罐外连续不断地进行加热，维持和冷却，同时把灭完菌的培养基通入已灭过菌的发酵罐的灭菌方式。

对数残留定律：

在微生物死亡过程中的任一时刻，活菌数的减少速率与该时刻残留的活菌数成正比，这就是微生物死亡的对数残留定律。

微分式为：

-dN/dτ=kN；积分式为：

τ=（2,303/k）log（N0/Ns）N0开始灭菌时的活菌数Ns灭菌结束时残留菌数。

分批灭菌的简要步骤

分批灭菌的操作要点

a）配料：

分批灭菌在所用的发酵罐中进行，将培养基在配制罐中配好后，通过专用管道输入发酵罐中。

b）升温阶段：

开动搅拌系统，先用夹套或蛇管预热（尾气开），当温度升温到90-100℃时，停止搅拌，三路进气（空气管、取样管、出料管），同时三路排气（尾气管、补料管、接种管）。

升温过程应尽可能快一些，以利于营养物质的保持。

注意辅助设备的灭菌：

空气过滤器、流加管道与流加液贮罐等。

c）保温阶段：

温度达到预定温度后，关小进汽、排汽阀门，按照罐温变化情况调节各路