试验十一谷物淀粉含量的测定旋光法.docx
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试验十一谷物淀粉含量的测定旋光法
17个植物生理实验指导
目录
植物材料的采集、处理与保存3
实验一拟南芥种植和形态观察8
实验二植物细胞的活体染色和死活的鉴定11
实验三植物细胞渗透势的测定（质壁分离法）13
实验四植物组织水势的测定（小液流法）16
实验五植物根系活力的测定（TTC法）18
实验六根系总吸收面积和活跃吸收面积的测定20
实验七离体叶绿体的制备以及完整度的测定22
实验八叶绿体色素的提取、分离和理化性质27
实验九植物叶片光合速率的测定（改良半叶法）31
实验十小篮子法（广口瓶法）测定植物的呼吸速率34
实验十一谷物淀粉含量的测定（旋光法）36
实验十二类似生长素对种子萌发的影响38
实验十三赤霉素对α-淀粉酶的诱导形成39
实验十四植物光周期现象的观察41
实验十五植物抗逆性的测定（电导仪法）42
实验十六脯氨酸含量的测定44
试验十七植物原生质体的分离和融合46
主要参考文献49
物材料的采集、处理与保存
植物生理实验使用的材料非常广泛，根据来源可划分为天然的植物材料（如植物幼苗、根、茎、叶、花等器官或组织等）和人工培养、选育的植物材料（如杂交种、诱导突变种、植物组织培养突变型细胞、愈伤组织、酵母等）两大类；按其水分状况、生理状态可划分为新鲜植物材料（如苹果、梨、桃果肉，蔬菜叶片，绿豆、豌豆芽下胚轴，麦芽、谷芽，鳞茎、花椰菜等）和干材料（小麦面粉，玉米粉，大豆粉，根、茎、叶干粉，干酵母等）两大类，因实验目的和条件不同，而加以选择。
植物材料的采集和处理，是植物生理研究测定中的重要环节。
在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对于如何正确地采集和处理样品却不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。
因此，必须对样品的采集、处理与保存给予足够的重视。
一、原始样品及平均样品的采取、处理
植物生理研究测定结果的可靠性（或准确性），首先取决于试材对总体的代表性，如果采样缺乏代表性，那么测定所得数据再精确也没有意义。
所以，样品的采集除必须遵循田间试验抽样技术的一般原则外，还要根据不同测定项目的具体要求，正确采集所需试材。
目前，随着研究技术的不断发展，应该不断提高采样技术的水平。
在作物苗期的许多生理测定项目中都需要采集整株的试材样品，在作物中后期的一些生理测定项目中，如作物群体物质生产的研究，也需要采集整株的试材样品，有时虽然是测定植株的部分器官，但为了维持器官的正常生理状态，也需要进行整株采样。
除研究作物群体物质生产外，对于作物生理过程的研究来说，许多生理指标测定中的整株采样，也只是对地上部分的采样，没有必要连根采样，当然对根系的研究测定例外。
采样时间因研究目的而不同，如按生育时期或某一特殊需要的时间进行。
除逆境生理研究等特殊需要外，所取植株应是能代表试验小区正常生育无损伤的健康植株。
为了保证植物材料的代表性，必须运用科学方法采取材料。
从大田或实验地、实验器皿中采取的植物材料，称为“原始样品”，再按原始样品的种类（如植物的根、茎、叶、花、果实、种子等）分别选出“平均样品”，然后根据分析的目的、要求和样品种类的特征，采用适当的方法，从“平均样品”中选出供分析用的“分析样品”。
（一）原始样品的取样法
1.随机取样
在试验区（或大田）中选择有代表性的取样点，取样点的数目视田块的大小而定。
选好点后，随机采取一定数量的样株，或在每一个取样点上按规定的面积从中采取样株。
2.对角线取样
在试验区（或大田）可按对角线选定五个取样点，然后在每个点上随机取一定数量的样株，或在每个取样点上按规定的面积从中采取样株。
（二）平均样品的取样法
1.混合取样法
一般颗粒状（如种子等）或已碾磨成粉末状的样品可以采取混合取样法进行。
具体的做法为：
将供采取样品的材料铺在木板（或玻璃板、牛皮纸）上成为均匀的一层，按照对角线划分为四等分。
取对角的两份为进一步取样的材料，而将其余的对角两份淘汰。
再将已取中的两份样品充分混合后重复上述方法取样。
反复操作，每次均淘汰50％的样品，直至所取样品达到所要求的数量为止。
这种取样的方法叫做“四分法”。
一般禾谷类、豆类及油料作物的种子均可采用这个方法采取平均样品，但注意样品中不要混有不成熟的种子及其他混杂物。
2.按比例取样法
有些作物、果品等材料，在生长不均等的情况下，应将原始样品按不同类型的比例选取平均样品。
例如对甘薯、甜菜、马铃薯等块根、块茎材料选取平均样品时，应按大、中、小不同类型的样品的比例取样，然后再将每一单个样品纵切剖开，每个切取1/4、1/8或1/16，混在一起组成平均样品。
在采取果实的平均样品时，如桃、梨、苹果、柑橘等果实，即使是从同一株果树上取样，也应考虑到果枝在树冠上的各个不同方位和部位以及果实体积的大、中、小和成熟度上的差异，按各自相关的比例取样，再混合成平均样品。
（三）取样注意事项
1.取样的地点，一般在距田埂或地边一定距离的株行取样，或在特定的取样区内取样。
取样点的四周不应该有缺株的现象。
2.取样后，按分析的目的分成各部分（如根、茎、叶、果等），然后捆齐，并附上标签，装入纸袋。
有些多汁果实取样时，应用锋利的不锈钢刀剖切，并注意勿使果汁流失。
3.对于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等样品，因含水分较多，容易变质或霉烂，可以在冰箱中冷藏，或进行灭菌处理或烘干以供分析之用。
4.选取平均样品的数量应当不少于供分析用样品的两倍。
5.为了动态地了解供试验用的植物在不同生育期的生理状况，常按植物不同的生育期采取样品进行分析。
取样方法系在植物的不同生育时期先调查植株的生育状况并区分为若干类型，计算出各种类型植株所占的百分比，再按此比例采取相应数目的样株作为平均样品。
二、分析样品的处理和保存
1．从田间采取的植株样品，或是从植株上采取的器官组织样品，在正式测定之前的一段时间里，如何正确妥善的保存和处理是很重要的，它也关系到测定结果的准确性。
一般测定中，所取植株样品应该是生育正常无损伤的健康材料。
取下的植株样品或器官组织样品，必须放入事先准备好的保湿容器中，以维持试样的水分状况和未取下之前基本一致。
否则，由于取样后的失水，特别是在田间取样带回室内的过程中，由于强烈失水，使离体材料的许多生理过程发生明显的变化，用这样的试材进行测定，就不可能得到正确可靠的结果。
为了保持正常的水分状况，在剪取植株样品后，应立即插入有水的桶中，对于枝条，还应该立即在水中进行第二次剪切，即将第一次切口上方的一段在水中剪去，以防输导组织中水柱被拉断，影响正常的水分运输。
对于器官组织样品，如叶片或叶组织，在取样后就应立即放入已铺有湿纱布带盖的瓷盘中，或铺有湿滤纸的培养皿中。
对于干旱研究的有关试材，应尽可能维持其原来的水分状况。
采回的新鲜样品（平均样品）在做分析之前，一般先要经过净化、杀青、烘干（或风干）等一系列处理。
（1）净化：
新鲜样品从田间或试验地取回时，常沾有泥土等杂质，应用柔软湿布擦净，不应用水冲洗。
（2）杀青：
为了保持样品化学成分不发生转变和损耗，应将样品置于105℃的烘箱中烘15min以终止样品中酶的活动。
（3）烘干：
样品经过杀青之后，应立即降低烘箱的温度，维持在70～80℃，直到烘至恒重。
烘干所需的时间因样品数量和含水量、烘箱的容积和通风性能而定。
在无烘箱的条件下，也可将样品置蒸笼中以蒸汽杀青，而后于阴凉通风处风干。
但在蒸汽杀青过程中，常有可溶性物质的外渗损失，因此，此法仅可作为测量大量样品干重时的变通方法，在进行成分分析时应尽量避免。
烘干时应注意温度不可过高，否则会把样品烤焦，特别是含糖较多的样品，在高温下更易焦化。
为了更精密地分析，避免某些成分的损失（如蛋白质、维生素、糖等），在条件许可的情况下最好采用真空干燥法。
此外，在测定植物材料中酶的活性或某些成分（如维生素C、DNA、RNA等）的含量时，需要用新鲜样品。
取样时注意保鲜，取样后应立即进行待测组分提取；也可采用液氮中冷冻保存或冰冻真空干燥法得到干燥的制品。
放在0～4℃冰箱中保存即可。
在鲜样已进行了匀浆，尚未完成提取、纯化，不能进行分析测定等特殊情况下，也可加入防腐剂（甲苯、苯甲酸），以液态保存在缓冲液中，置于0～4℃冰箱即可。
但保存时间不宜过长。
2．已经烘干（或风干）的样品，可根据样品的种类、特点进行以下处理：
（1）种子样品的处理：
一般种子（如禾谷类种子）的平均样品清除杂质后要进行磨碎，在磨碎样品前后都应彻底清除磨粉机（或其他碾磨用具）内部的残留物，以免不同样品之间的机械混杂，也可将最初磨出的少量样品弃去，然后正式磨碎，最后使样品全部无损地通过1mm筛孔的筛子，混合均匀作为分析样品贮存于具有磨口玻塞的广口瓶中，贴上标签，注明样品的采取地点、试验处理、采样日期和采样人姓名等。
长期保存的样品，贮存瓶上的标签还需要涂蜡。
为防止样品在贮存期间生虫，可在瓶中放置一点樟脑或对位二氯甲苯。
对于油料作物种子（如芝麻、亚麻、花生、蓖麻等）需要测定其含油量时，不应当用磨粉机磨碎，否则样品中所含的油分会吸附在磨粉机上将明显地影响分析的准确性。
所以，对于油料种子应将少量样品放在研钵内研碎或用切片机切成薄片作为分析样品。
（2）茎秆样品的处理：
烘干（或风干）的茎秆样品，均要进行磨碎，磨茎秆用的电磨与磨种子的磨粉机结构不同，不宜用磨种子的电磨来磨碎茎秆。
如果茎秆样品的含水量偏高而不利于磨碎时，应进一步烘干后再进行磨碎。
（3）多汁样品的处理：
柔嫩多汁样品（如浆果、瓜、菜、块根、块茎、球茎等）的成分（如蛋白质、可溶性糖、维生素、色素等）很容易发生代谢变化和损失，因此常用其新鲜样品直接进行各项测定及分析。
一般应将新鲜的平均样品切成小块，置于电动捣碎机的玻璃缸内进行捣碎。
若样品含水量不够（如甜菜、甘薯等）可以根据样品重加入0.1～1倍的蒸馏水。
充分捣碎后的样品应成浆状，从中取出混合均匀的样品进行分析。
如果不能及时分析，最好不要急于将其捣碎，以免其中化学成分发生变化而难以准确测定。
有些蔬菜（如含水分不太多的叶菜类、豆类、干菜等）的平均样品可以经过干燥磨碎，也可以直接用新鲜样品进行分析。
若采用新鲜样品，可采用上述方法在电动捣碎机内捣碎，也可用研钵（必要时加少许干净的石英砂）充分研磨成匀浆，再进行分析。
在进行新鲜材料的活性成分（如酶活性）测定时，样品的匀浆、研磨一定要在冰浴上或低温室内操作。
新鲜样品采后来不及测定的，可放入液氮中速冻，再放入﹣70℃冰箱中保存。
供试样品一般应该在暗处保存，但是，对于供光合、蒸腾、气孔阻力等的测定样品，在光下保存更为合理。
一般可将这些供试样品保存在室内光强下，但从测定前的0.5～1.0小时开始，应对这些材料进行测定前的光照预处理，也叫光照前处理。
这不仅是为了使气孔能正常开放，也是为了使一些光合酶类能预先被激活，以便在测定时能获得正常水平的值，而且还能缩短测定时间。
光照前处理的光强，一般应和测定时的光照条件一致。
测定材料在取样后，一般应在当天测定使用，不应该过夜保存。
需要过夜时，也应在较低温度下保存，但在测定前应使材料温度恢复到测定条件的温度。
对于采集的籽粒样品，在剔除杂质和破损籽粒后，一般可用风干法进行干燥。
但有时根据研究的要求，也可立即烘干。
对叶片等组织样品，在取样后则应立即烘干。
为了加速烘干，对于茎秆、果穗等器官组织应事先切成细条或碎块。
实验一拟南芥种植和形态观察
一、实验原理
拟南芥属（Arabidopsisthaliana）十字花科，被子植物门，双子叶植物纲。
二年生草本，高7～40厘米。
基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。
总状花序顶生，花瓣4片，白色，匙形。
长角果线形，长1～1.5厘米。
花期3～5月。
我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现。
拟南芥的优点是植株小（1个茶杯可种植好几棵）、每代时间短（从发芽到开花不超过6周）、结子多（每棵植物可产很多粒种子）、生活力强（用普通培养基就可作人工培养）。
拟南芥的基因组是目前已知植物基因组的1/80，这就使克隆它的的有关基因相对说来比较容易。
拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。
例如用含杀草剂的培养基来筛选，一般获得抗杀草剂的突变率是1/100000。
由于上述这些优点，所以，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料：
拟南芥种子
（二）试剂：
PNS营养液（1L）
母液
毫升
母液1
5
母液2
2
母液3
2
母液4
2.5
母液5
2.5
母液6
1
PNS营养液母液配方
母液1：
1M KNO3 101.1g
母液2：
1M Ca（NO3）2˙4H2O 236.15g
母液3：
1M MgSO4˙7H2O，246.48g
母液4：
20mM Fe.EDTA：
FeSO4 5.57g
EDTA 7.45g
注意先各自配成溶液，再混合。
母液5：
1M磷酸缓冲液（pH5.5）：
磷酸二氢钾 130.4g
磷酸氢二钾 9.12g
母液6：
MS微量元素
硼酸 0.434g
硫酸锰（MnSO4H2O） 1.7626g
CuSO4˙H2O 0.0798g
ZnSO4˙7H2O 0.172g
NaMoO4˙2H2O 0.0432g
NaCl 0.585g
CoCl˙6H2O 0.00129g
以上母液均配至1L，配制时使用灭菌的双蒸水。
配制后4℃冰箱中保存备用。
人工土：
3份蛭石，1份珍珠岩和1份黑土混合。
（三）仪器设备：
培养皿，镊子，托盘，保鲜膜，花盆，人工气候箱。
三、实验步骤
1.将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和PNS营养液的人工土中，并用保鲜膜罩上。
两天后光照，三天后揭膜。
2.人工培养室条件：
相对湿度80%，恒温20-240C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8h黑暗﹑16h光照培养。
四、实验结果
每隔三天观察生长情况，并适时浇水。
按照下表记录拟南芥的生长情况。
株高（cm）
叶片
花
果荚
收获
第1天
第4天
第7天
第10天
第13天
第16天
第19天
第22天
第25天
第28天
第31天
第34天
第37天
第40天
第43天
第47天
第50天
第53天
第56天
第60天
五、思考题
1.绘制拟南芥的株高的生长曲线。
2.为什么说拟南芥是模式植物？
3.拟南芥的特点？
实验二植物细胞的活体染色和死活的鉴定
一、原理
用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色称活体染色。
中性红（2-甲基-3-氨基-6-二甲氨基二氮杂蒽盐酸盐,3-氨基-6-二甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐，Neutralred,Neutralredchloride,Toluylenered,Aminodimethylaminotoluaminozine,3-Amino-6-dimethylamino-2-methylphenazinehydrochloride。
分子式：
C15H17ClN4；分子量：
288.78。
）是常用的活体染料之一。
深绿色、棕色或浅黑色结晶粉末。
溶解度为水4.0％，无水乙醇1.8％，乙二醇乙醚3.75％，乙二醇3.0％。
几乎不溶于二甲苯，其水溶液或乙醇溶液呈红色。
中性红是一种弱碱性染色剂，变色范围在pH6.4～8.0之间（由红变成黄）。
在中性或微碱性环境下，植物的活细胞原生质能大量吸收中性红并向液泡排泄，液泡一般呈酸性，中性红解离出大量阳离子而呈樱桃红色，而原生质及壁不染色；死细胞的液泡已消失因而不产生液泡着色现象，中性红阳离子却与带一定负电荷的原生质及细胞核结合而使原生质及细胞核染色。
成长的细胞是一个渗透系统，活的原生质具有选择透性，原生质内部包含着一个大液泡，具有一定的溶质势。
当细胞与外界低水势溶液接触时，细胞内的水分外渗，原生质随着液泡一起收缩而发生质壁分离；其后，当与清水（或高水势溶液）接触，细胞又因液泡的吸水膨胀而发生质壁分离复原。
死细胞因其原生质的选择透性已遭破坏，故与低水势溶液接触时不产生质壁分离。
二、材料、仪器设备及试剂
1.材料：
洋葱；
2.仪器设备：
不锈钢单面刀片；镊子；吸水纸；酒精灯；载玻片；盖玻片；胶头滴管；显微镜；
3.试剂：
0.8mol·L－1蔗糖液；0.1％中性红溶液母液。
三、实验步骤
1. 制片染色
选择一片比较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5cm2左右的小块，用用尖头镊子轻轻地撕取洋葱（玉葱）鳞片内表皮薄片，浸到0.03％中性红溶液中10～15min进行染色。
2.观察
2.1将染色后的植物材料放到载玻片上，用弱碱性水略加清洗后，盖好盖玻片，在盖玻片的一侧滴加无离子水（或pH略高于7.0的自来水），然后在显微镜下观察，可以看出液泡染成樱桃红色；原生质层（细胞质和细胞）则无色透明紧贴细胞壁（注意：
在细胞的角隅上可以看见）。
2.2在第1项观察后，接着从盖玻片的一边滴2滴0.8mol·L－1蔗糖液,在盖玻片的另一边用吸水纸吸盖玻片下的水，将蔗糖液引入盖玻片下浸渍植物材料，并立即镜检，可以看到细胞很快发生质壁分离。
先是凹形质壁分离，而后变为凸形质壁分离。
2.3在第2项观察后，接着在盖玻片的一边加入2～3滴去离子水，在另一边用吸水纸吸去糖液，将去离子水引入盖玻片底，立即镜检可以看到带有液泡的原生质体重新吸水膨大，最后充满整个细胞腔，即质壁分离复原（复原缓慢进行时，细胞仍可正常存活；如果进行很快，则会因原生质机械破坏而死亡，注意观察机械损伤的细胞的特点）。
2.4将一片经中性红染色的植物材料放在载玻片上，加一滴无离子水后加盖玻片，在酒精灯火焰上微微加热，然后在显微镜下观察，可以看到细胞质凝结成不均匀的凝胶状，与细胞核一起染成红色。
然后按（2.2）法加0.8mol·L－1蔗糖液也不发生质壁分离。
四、实验结果收集照片。
五、思考题1.活体细胞观察应该注意什么？
2.机械损伤后的细胞有什么特点？
实验三植物细胞渗透势的测定（质壁分离法）
一、原理
植物细胞的渗透势主要取决于液泡的溶质浓度，因此又称溶质势。
渗透势与植物水分代谢、生长及抗逆性等有密切关系。
已知在干旱、盐渍等条件下，一些植物常在细胞内主动积累溶质，以降低其渗透势，增加吸水能力，而在一定程度上维持细胞膨压，保障细胞的生长和气孔的开放，这种现象叫做渗透调节作用。
渗透调节能力的大小可以用逆境条件下细胞的渗透势的降低值来表示，在水分生理与抗逆性生理研究中经常需要测定植物细胞的渗透势。
将植物组织放入一系列不同浓度的蔗糖溶液中，经过一段时间，植物细胞与蔗糖溶液间将达到渗透平衡状态。
如果在某一溶液中细胞脱水达到平衡时刚好处于临界质壁分离状态，则细胞的压力势（Ψp）将下降为零。
此时细胞液的渗透势（Ψs）等于外液的渗透势Ψs0。
此溶液称为该组织的等渗溶液，其浓度称为该组织的等渗浓度，即可计算出细胞液的渗透势（Ψs）。
实际测定时，因为临界质壁分离状态难以在显微镜下直接观察到，所以一般均以初始质壁分离作为判断等渗浓度的标准。
处于初始质壁分离状态的细胞体积，比吸水饱和时略小，故细胞液浓缩而渗透势略低于吸水饱和状态时的渗透势称基态渗透势。
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
紫皮洋葱鳞茎
（二）试剂
1．1mol/kg蔗糖水溶液：
称取预先在60～80℃下烘干的蔗糖34.2g溶于100g蒸馏水中，即为1质量摩尔浓度的蔗糖溶液。
2．0.03％中性红溶液。
3．蔗糖系列标准液：
取干燥洁净的小试剂瓶7支编号，用1mol/kg蔗糖水溶液依据C1V1=C2V2公式配制0.35mol/kg、0.40mol/kg、0.45mol/kg、0.50mol/kg、0.55mol/kg、0.60mol/kg、0.65mol/kg等一系列不同浓度的蔗糖水溶液（具体范围可根据材料不同而加以调整），贮于试剂瓶中，瓶口加塞以防蒸发浓缩。
取不同浓度的蔗糖溶液个10ml称重，计算其密度。
（三）仪器设备
显微镜，载玻片，盖玻片，温度计，尖头镊子，刀片，直径6cm小培养皿，试剂瓶若干，烧杯，容量瓶，量筒，吸管，吸水纸适量。
三、实验步骤
1．取干燥、洁净的培养皿7套编号，将配制好的不同浓度的蔗糖溶液约5ml按顺序加入各培养皿，使之成一薄层，盖好皿盖备用。
2．用镊子撕取（或用刀片刮取）供试材料的表皮，大小约0.5cm2，迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，每一浓度4～5片。
同时记录室温。
为了便于观察，可先将切片于0.03%中性红内染色5min左右，吸去水分，再浸入蔗糖溶液中，但如不染色即能区别质壁分离时，仍以不染色为宜。
3．5～10min后，取出表皮薄片放在滴有同样溶液的载玻片上，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察，如果所有细胞都产生质壁分离的现象，则取低浓度溶液中的制片作同样观察，并记录质壁分离的相对程度。
如果在两个相邻浓度的切片中，一个没有发生质壁分离或质壁分离的细胞不足50%，另一个发生质壁分离的细胞数超过50%，则可粗略地将这两个浓度的平均值作为其等渗浓度，也可用插值法更准确地确定等渗浓度。
每一制片观察的细胞不应少于100个。
检查时可先从中间浓度开始。
在找到上述浓度极限时，用新的溶液和新鲜的叶片重复进行几次，直至有把握确定为止。
在此条件下，细胞的渗透势与两个极限溶液浓度之平均值的渗透势相等。
4．也可用CaCl2或NaCl代替蔗糖，但须改变式中等渗系数。
CaCl2的i值可用2.6，NaCl一般为1.8。
将结果记录于下表中。
植物细胞渗透势测定记载表
实验人日期材料名称实验室温度
蔗糖浓度（mol/kg）
渗透势（Mpa）
质壁分离细胞数/总细胞数*100%
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
四、结果计算
由所得到的等渗浓度和测定的室温，用下式计算供试溶液的渗透势（Ψs0），即为细胞的渗透势（Ψs）。
Ψs（MPa）=Ψs0=-
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