菌落总数的检验方法.docx

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菌落总数的检验方法

ISO与美国FDA不同处

食品微生物检查办法（FDA与ISO对比）

内容提纲：

l菌落总数检测

l大肠菌群及大肠杆菌检测

l金黄色葡萄球菌检测

l沙门氏菌检测

l单核细胞增生李斯特氏菌检测

菌落总数测定——菌落总数概念

l菌落总数是指在被检样品单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成菌落总数。

菌落总数测定——卫生学意义

l鉴定食品被细菌污染限度及卫生质量。

l及时反映食品加工过程与否符合卫生规定，为被检食品卫生学评价提供根据。

l普通以为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染也许性越大，菌落总数多少在一定限度上标志着食品卫生质量优劣。

FDABAM菌落总数测定流程

检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）

恰当十倍稀释样品

选取2~3个持续适当稀释度

各取1mL分别加入灭菌平皿内

（每个稀释度做两个平行）

每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）

35℃48±2h

菌落计数

FDABAM菌落计数办法

l选取25~250CFU之间菌落进行计数，计算公式如下：

N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d

l所有平板菌落数都局限性25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。

EAPC：

estimatedaerobicplatecount

l所有平板菌落数都超过250CFU，但局限性100/cm2，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU平板菌落数预计值，乘以相应稀释度。

l所有平板菌落数都超过100/cm2，计算平板面积（直径为90mm平板面积为65cm2），预计最高稀释度每cm2菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度菌落计数成果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100*1/d。

l无法计数平板报告LA（LaboratoryAccident）。

l最后成果保存前两位有效数字。

按照4舍6入，5是奇进偶不进。

ISO4833-菌落总数测定流程

检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）

恰当十倍稀释样品

选取2~3个持续适当稀释度

各取1mL分别加入灭菌平皿内

（每个稀释度做两个平行）

每皿内加入适量（12~15mL）

平板计数琼脂（PCA），

30±1℃，72±3h

菌落计数

ISO4833-菌落计数办法

l选取持续2个稀释度不超过300CFU平板，且一种平板至少含15CFU进行计数，计算公式如下：

N=∑C/（n1+0.1*n2）*d

l所有平板菌落数都局限性15CFU，计算2平板菌落算术平均值m，液体样品：

NE=m固体样品：

NE=m×d-1

l无菌生长：

液体样品：

lessthan1;固体样品：

lessthan1×d-1

l最后成果保存前两位有效数字。

菌落总数测定几点阐明

l由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是样品中实际总活菌数，某些特殊营养规定细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。

l鉴于食品检样中细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆形式存在，因而在平板上浮现菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内菌落数或菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）报告。

菌落总数测定几点规定

l每个样品从开始稀释到倾注最后一种平皿所用时间不得超过15min，重要为防止细菌增殖和产生片状菌落。

样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。

皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。

l检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以鉴定稀释液、培养基、平皿或吸管也许存在污染。

同步，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相称，以理解检样在检查操作过程中有无受到来自空气污染。

l检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合平皿，不经培养，于4℃放置，以便在计数检样时用作对照。

大肠菌群定义

l大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。

l大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是依照卫生学方面规定，提出与粪便污染关于细菌，即作为食品、水体等与否受过人畜粪便污染批示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。

依照进一步生化实验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。

大肠杆菌定义

l大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。

l大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC实验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐实验）为++--或-+--细菌。

l与人类关于大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，涉及五种：

肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。

卫生学意义

l大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量重要指标，作为食品中粪便污染指标。

l食品中检出大肠菌群，表白该食品有粪便污染，既也许有肠道致病菌存在，因而也就有也许通过污染食品引起肠道传染病流行。

大肠菌群数高低，表白了粪便污染限度，也反映了对人体健康危害性大小。

l大肠杆菌在外界存活时间与某些重要肠道致病菌接近，它浮现预示着某些肠道病原菌存在，因而该菌是国际上公认卫生监测批示菌。

近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况监测指标和HACCP实行效果评估指标。

大肠杆菌生物学特性

培养特性：

l大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖普通培养基上生长良好。

最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范畴15-46℃

大肠菌群及大肠杆菌测定

——MPN法检查流程（FDABAM）

检样50g+450ml稀释液

恰当十倍稀释样品

选取3个适当持续稀释度样品稀释液，

每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），

每管接种1mL

35℃，24±2h~48±2h

没有产气管有产气管

报告阴性

接种BGLB肉汤管接种EC肉汤

44.5±0.5℃（水浴培养）

24±2h~48±2h

查MPN表报告成果产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）

（大肠菌群）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜

面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气

查MPN表报告成果（大肠杆菌）

大肠菌群测定——MPN法检查几点阐明

lMPN检索表：

MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同稀释度，则表内数字应相应减少或增长10倍。

l初发酵和证明实验：

1）两步法进行了两次乳糖发酵实验。

初发酵和证明实验所用培养基不同，但都是为了证明培养物与否符合大肠菌群定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。

2）初发酵阳性管，不能必定就是大肠菌群细菌，通过证明实验后，有时也许成为阴性。

有数据表白，食品中大肠菌群检查环节符合率，初发酵与证明实验相差较大。

因而，在实际检测工作中，证明实验是必须。

l产气量与倒管：

在乳糖发酵实验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮小气泡。

实验表白，大肠菌群产气量，多者可以使发酵倒管所有布满气体，少者可以产生比小米粒还小气泡。

如果对产酸但未产气乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑也许有气体产生，而应作进一步实验。

大肠杆菌测定——EMB选取性分离鉴别

EMB平板典型大肠杆菌菌落特性：

中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽

大肠杆菌测定——EMB选取性分离鉴别

lEMB是一种弱选取性培养基，某些球菌也可在该培养基上生长；

l高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有正常紫色，倾注平板前应先摇匀；

l大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色金属光泽；

l该培养基受可见光易使其中成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件

大肠杆菌测定——革兰氏染色

基本环节：

l将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；

l滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；

l滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过度脱色，水洗；

l滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。

l成果：

革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

大肠杆菌测定——生化鉴定

（表略）

金黄色葡萄球菌——概述

l依照《伯杰氏鉴定细菌学手册》，按葡萄球菌生理化学构成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis）和腐生葡萄球菌（S.saprophyticus），其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。

l金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常用病原菌。

可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。

葡萄球菌致病力强弱重要取决于其产生毒素和侵袭性酶。

金黄色葡萄球菌——生物学特性

金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.8μm左右，排列成葡萄串状，无芽孢，无荚膜。

金黄色葡萄球菌——生长特性

l金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长

金黄色葡萄球菌检查——办法合用性

lMPN法：

合用于检测带有大量竞争菌食品及其原料和未经解决含少量金黄色葡萄球菌食品。

l直接平板计数法：

合用于检查金黄色葡萄球菌数不不大于10/g（ml）食品。

l增菌培养法：

合用于检查具有受损伤金黄色葡萄球菌加工食品。

金黄色葡萄球菌检查——直接平板计数法

（FDABAM&ISO）

检样（50g+450mL稀释液）

恰当十倍稀释样品

选取2~3个持续适当稀释度

吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分别涂布于

3块90mmBaird-Parker平板上（做平行实验）

35℃，45~48h

确证明验

报告

FDABAM金黄色葡萄球菌检查——MPN法

检样（50g+450mL稀释液）

恰当十倍稀释样品

选取3个适当持续稀释度样品稀释液，

每个稀释度接种三管10%NaClTSB肉汤，

每管接种1mL

35℃，48±2h

从生长管中接种1环划线于Baird-Parker平板上

35℃，48h

确证明验

报告

FDABAM金黄色葡萄球菌确证明验

1.凝固酶实验

l办法：

从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35℃培养18-24h。

取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶实验兔血浆充分混合，置35℃培养，定期观测与否有凝块形成，至少观测6h。

实验中需同步做已知阳性和阴性对照。

l成果鉴定：

以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。

某些凝固（2+和3+）必要进行生化鉴定加以证明。

FDABAM金黄色葡萄球菌确证明验

2.革兰氏染色

l对所有可疑培养物都要进行革兰氏染色。

3.生化鉴定

l过氧化氢酶实验

l葡萄糖厌氧运用实验

l甘露醇厌氧运用实验

l金葡溶菌酶敏感性实验

l耐热核酸酶实验（辅助

ISO金黄色葡萄球菌检查——MPN法

检样（xg+9xmL稀释液）

恰当十倍稀释样品

选取3个适当持续稀释度样品稀释液，

每个稀释度接种三管

modifiedGiolittiandCantonibroth，

37℃，24~48h

从变黑或浮现黑