程序复习参考基因工程的基本操作.docx

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程序复习参考基因工程的基本操作

民族神话

鸿蒙未辟

宇宙洪荒

亿万斯年

四极不张

第2节基因工程的基本操作程序

【本节重难点】

重点：

基因工程基本操作程序的四个步骤

难点：

（1）从基因文库中获取目的基因

（2）利用PCR技术扩增目的基因

【知识精讲】

教材梳理

基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：

目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

知识点一目的基因的获取

1.获取目的基因是实施基因工程的第一步。

目的基因的获取方法主要有两种：

①从自然界中已有的物种中分离出来②用人工的方法合成。

2.基因文库——将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，成为基因文库。

基因文库根据其大小可分为基因组文库和部分基因文库。

受体细胞是指接受目的基因的细胞，即表达载体导入的细胞。

基因工程常用的受体有细菌、真菌、动植物细胞

3.PCR技术扩增目的基因

原理：

DNA复制

做法：

已知一段目的基因的核苷酸序列→据已知序列合成引物→DNA扩增

结果：

扩增出许多结构相同的目的基因。

注意：

学习该部分知识时，常出现将目的基因的来源和目的基因的提取相混淆，致使不理解课本所讲，原因是课本都用了“获取目的基因”字样。

目的基因的来源是：

①从自然界中已有的物种中分离出来。

②用人工的方法合成。

目的基因的提取是指在基因工程操作时怎样获得目的基因。

常用方法有二：

①从基因文库中直接获取②如果需要大量的目的基因，需要对目的基因进行PCR技术扩增。

不管是从基因文库中获取的目的基因，还是需要进行扩增的目的基因，其来源既可能是从自然界中已有的物种中分离出来，也可能是人工合成的。

知识点二基因表达载体的构建

基因表达载体的构建是基因工程的核心。

其中心内容是使目的基因与运载体结合，形成重组运载体，最后通过重组运载体将目的基因导入受体细胞。

注意：

在学习时应注意以下几点：

1.构建表达载体的目的：

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.基因表达载体的组成：

目的基因、启动子、终止子、标记基因

3.所选运载体应具备的条件：

（1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。

这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。

（2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。

（3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。

（4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。

（5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。

实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

知识点三将目的基因导入受体细胞

（1）转化——目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。

说明：

此处的“转化”与肺炎双球菌的转化实验中的“转化”的含义相同。

（2）基因工程中常用的受体细胞有：

大肠杆菌、枯草杆菌、土壤脓杆菌、酵母菌和动植物细胞

（3）将目的基因导入受体细胞的方法：

根据受体和运载体的类型不同，所采用的导入方法也不同。

目前常用的方法有：

①将目的基因导入植物细胞——脓杆菌转化法，还有基因枪法和花粉管通道法。

②将目的基因导入动物细胞——显微注射技术③将目的基因导入微生物细胞——Ca＋处理细胞法

说明：

将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，同学们可以上网查询更多的方法和具体过程。

知识点四目的基因的监测与鉴定

（1）检测对象：

①检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因

②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质

（2）检测方法：

分子检测法——①和②都是DNA分子杂交技术，③抗原－抗体杂交法

形态检测法——可根据目标性状的有无来判断目的基因是否表达

说明：

基因操作过程中有多个步骤需要检测，此处只讲了目的基因的检测，还有目的基因是否被整合到了运载体上，运载体是否进入了受体细胞等都需要检测，具体过程见拓展点2。

知识点五教材深化：

人工合成目的基因的过程：

①目的基因转录成的mRNA

单链DNA

双链DNA（目的基因）

②蛋白质中氨基酸的序列

mRNA中的碱基序列

DNA碱基序列目的基因

目的基因

教材拓展

拓展点一标记基因和标记基因的作用

课本上提到运载体要有标记基因，其作用是供重组DNA鉴定和筛选，那么怎样利用标记基因进行鉴定和筛选呢？

请同学们阅读下面一段文字：

运载体中所携带的一些抗性基因（如氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因）及发光基因等，能控制一些特殊物质的合成，利用这些特殊物质可以筛选运载体或重组运载体，这些基因就叫做标志基因。

在用限制酶切割目的基因和运载体、表达载体构建及将目的基因导入受体细胞，这一系列过程都是在人为控制条件下，在有关酶的作用下自行完成的，而不是人为条件下一个一个处理的，是很多对象同时进行的，这样，就会出现有的运载体被限制酶切割开，有的运载体没有被限制酶切割开，没有被限制酶切割开的运载体，就不可能连接上目的基因，只有被限制酶切开的运载体才有可能拼接上目的基因。

我们就必须选择出连接上目的基因的重组运载体（即表达载体），然后进行扩增，得到大量的表达载体。

然后把大量的表达载体和大量的受体细胞放在一起，在一定的人为条件下，让其自行导入受体细胞，这样，在导入受体细胞时，就会出现有的受体细胞被导入了表达载体，有的细胞没有导入表达载体，我们再选出含有表达载体的受体细胞，进行扩增，培养。

在上述过程中要进行两步筛选，一是筛选含有运载体的受体细胞，其过程是在含有相应抗菌素的培养基上培养，只有获得运载体的受体细胞才能继续生长，这样便可筛选出含有运载体的受体细胞。

二是筛选含有目的基因的受体细胞，其过程是从每个菌落取一部分再接种到含另一种抗生素的培养基上培养，由于目的基因插入该标记基因中，致使该基因不能表达，因而受体细胞不能在含该抗生素的培养基上生存，据此可以从该菌落剩余部分的菌体中筛选出含目的基因的受体细胞。

注意：

在基因操作的基本步骤中要进行多次筛选。

拓展点二从基因文库中找到所需要的基因

从基因文库中找到目的基因是一件比较复杂的事情，要根据目的基因已有的某些信息来进行。

下面介绍一种根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。

第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记（也可以用别的标记方法进行，如生物素、荧光素等），即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，与扩增出来的DNA杂交。

第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜上（也可以用其他类型的膜），然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并使DNA固定在膜上。

第三步，按Southern杂交的方法进行杂交。

第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个菌落中含有所需要的目的基因（若选用别的标记方法，有阳性信号的菌落则含有所需要的目的基因）。

第五步，从该菌落中再提取目的基因。

拓展点三PCR的扩增过程

PCR扩增是获取目的基因的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。

PCR的扩增反应过程包括以下几个主要过程。

第一步：

将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。

第二步：

将反应体系降温至55～60℃，使两种引物分别与模板DNA链3′端的互补序列互补配对，这个过程称为复性。

第三步：

将反应体系升温至70～75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA链。

上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。

PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

【典题分类精析】

考点一、目的基因的获取

例1．1993年，我国科学工作者培育成的抗棉铃虫的最新转基因抗虫棉，其抗虫基因来源于

A．普通棉花的基因突变B．棉铃虫变异形成的致死基因

C．在棉铃虫体内寄生的线虫基因D．苏云金芽孢杆菌体内的抗虫基因

分析：

1993年，中国农业科学院的科学家成功地将原核生物苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因转入棉植株，培育成了抗棉铃虫的转基因抗虫棉。

答案：

D

点评：

目的基因主要来源是原核生物。

例2．［2005高考全国］镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。

检测这种碱基序列改变必须使用的酶是

A.解旋酶B.DNA连接酶C.限制性内切酶D.RNA聚合酶

分析：

本题考查的知识点是DNA分子杂交原理。

选项B、D可以直接排除。

对于选A可能理解为的：

既然是检测突变的部位,那么很自然想到用该基因的探针，进行碱基互补配对杂交而检测之（相关知识见教材鉴定人猿亲缘关系和基因工程处都有所涉及），但是分子杂交的前提必须是单链DNA，于是很自然想到用解旋酶处理被检测基因。

但是，解开DNA双链结构不一定要用解旋酶，在高温或者用强碱溶液处理也可以得到单链DNA，而且题干上也有"必须使用的酶"的叙述，所以可以排除A选项。

对于C选项的理解：

限制酶只是把原DNA切成很多片段，其中某个片段可能包含突变的目的基因，然后再用化学方法处理成单链，最后再和探针杂交，根据放射性（或荧光）出现部位而检测出突变部位，这种技术其实就是所谓的基因诊断。

如不用限制酶把DNA切割成若干片段，通过其他方法把DNA处理成单链，然后与DNA探针杂交，但是，已经变性成单链的DNA很有可能常温下复性，可能回折重新形成许多双链区，如果恰恰突变部位及其临近区域和该单链其他区域结合成双链，那么必然影响探针与相应部位的结合，也就无法准确检测到突变部位。

答案：

C

点评：

本题易错选A，用探针检测DNA，DNA必须解旋，但解旋不一定要用解旋酶，这一点可联系肺炎双球菌的转化实验，高温使DNA解旋。

考点二、基因表达载体的构建

例3．［2006高考江苏］基因工程又叫基因拼接技术。

（1）在该技术中，用人工合成方法获得目的基因的途径之一是：

以目的基因转录的___________为模板，__________成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成__________。

（2）基因工程中常用的受体细胞有细菌、真菌、____________。

若将真核基因在原核细胞中表达，对该目的基因的基本要求是_________。

（3）假设以大肠杆菌质粒作为运载体，并以同一种限制性内切酶切割运载体与目的基因，将切割后的运载体与目的基因片段混合，并加入DNA连接酶。

连接产物至少有_________种环状DNA分子，它们分别是_______________。

分析：

本题考查的是基因工程的相关知识。

熟练掌握基因工程的四个步骤是解答本题的关键。

基因工程很容易与其他知识相联系命制综合题，如基因操作基本步骤中目的基因的获取常与“中心法则”、“碱基互补配对原则”相结合，还可与基因的结构、发酵工程、基因的遗传定律相结合进行综合考查，是学习和重点之一。

完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。

在基因工程中，人工合成目的基因的途径有两条，其中之一就是以信使RNA这模板经过反转录合成目的基因；基因工程常用的受体有细菌、真菌、动植物细胞；原核生物的基因中无内含子，若将真核生物的基因转入原核生物，需除去内含子部分；在本题