中草药饲料添加剂发酵菌种的筛选与发酵条件研究.docx

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中草药饲料添加剂发酵菌种的筛选与发酵条件研究

中草药饲料添加剂属于天然药物，大量研究表明，中草药饲料添加剂具有促进动物生长发育、提高饲料利用率、改善畜禽产品质量、增强动物免疫功能等作用（李洪龙等，2007；刘根新等，2007；王丽辉等，2007；李宗辉等，2002；唐建安等，2000），其研究和应用已受到国内外研究工作者的广泛关注。

但由于中草药饲料添加剂的应用和研究存在用药成分复杂、含量低、适口性差、效果不稳定、用量大且难以掌握、毒副作用等问题，阻碍了中草药饲料添加剂的规模化推广应用。

微生物发酵中草药饲料添加剂是利用微生物的降解作用，将中草药中的有效成分、活性物质最大限度地释放出来，并对中草药活性成分进行修饰产生新的活性物质。

微生物在生长代谢过程中，可以产生各种各样的防病助生长的次生代谢产物，可将动物难以消化吸收的大分子物质转化成易于吸收的小分子物质，还可产生各种不同的酶，从而促进动物生长发育，缩短饲养周期，提高饲料报酬率，增强药效和降低饲养成本等。

本文采用从不同中草药中分离能够发酵中草药的微生物，对中草药复中草药饲料添加剂

发酵菌种的筛选与发酵条件研究

湖南农业大学生物科学技术学院兰时乐李立恒胡超林元山谢达平

[摘要]为提高中草药饲料添加剂的抑菌效果和应用效果，从中草药青蒿、鱼腥草、地骨皮、黄岑、胆草、夏枯草等

中草药中筛选到1株能发酵中草药饲料添加剂的菌株，鉴定为米曲霉Y-1。

以抗菌活性和CMCase酶、FPA酶及蛋

白酶酶活为评价指标，研究了以青蒿、鱼腥草、地骨皮、胆草等为主组成的中草药饲料添加剂的发酵条件。

结果表明，

合适的发酵条件为：

中草药饲料添加剂与麦麸的比例为7∶3、葡萄糖1%、发酵温度32℃、初始pH自然、物料含水量

50%～60%、发酵周期为72h。

在此条件下，发酵料蒸煮液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和鼠伤寒沙

门氏菌的抑菌活性分别较对照提高36.03%、60.83%、27.64%、41.32%，CMCase、FPA酶和蛋白酶酶活分别达到

9653、971U/g和6357U/g。

说明中草药饲料添加剂通过微生物发酵可提高其作用效果。

[关键词]中草药；饲料；饲料添加剂；发酵条件

[中图分类号]S816.7[文献标识码]A[文章编号]1004-3314（2010）15-0013-05

[Abstract]ToimprovetheeffectsofantibacterialandapplicationofChineseherbalfeedadditive.AChineseherbal

feedadditivefermentingstrainwasisolatedfromChineseherbalsuchasHerbaartemisiaeannuae，Herbahouttuyniae，

CortexLycii，ScutellariabaicalensisGeorgi，CorallodiscusflabellateandSpicaprunellaeetc.Itwaspreliminarilyidentified

asAspergillusorzymeY-1.ThefermentationconditionsforChineseherbalfeedadditivecontainingHerbaartemisiaean-

nuae，Herbahouttuyniae，CortexLycii，CorallodiscusflabellatewerestudiedwiththeantibacterialactivitiesandCMCase

activity，FPAactivity，proteinaseactivityastheindexesofevaluation.Theresultsshowedthattheoptimalfermentation

conditionswere：

theratioofChineseherbalfeedadditivetowheat-branwas7∶3，glucosewas1%，fermentationtempera-

turewas32℃，initialpHwasnature，watercontentwas50%～60%，fermentationtimewas72h.Underthesecondi-

tions，theantibacterialactivitiesofthefermentedproductswereenhanced36.03%，60.83%，27.64%，41.32%against

Escherichiacoli，Saphylococcusaureus，Proteusvulgaris，Salmonellatyhimuriumthanthecomparison.CMCaseactivity，

FPAactivityandtheproteinaseactivitywererespectivelyachieved9653，971U/gand6357U/g.Theresultsindicatedthat

theeffectsofChineseherbalfeedadditivecouldimprovebymicrobialfermentation.

[Keywords]Chineseherb；feed；feedadditive；fermentationcondition

13中国饲料2010年第15期

方进行发酵，并测定了中草药复方发酵前后抑菌

活性和纤维素酶、酸性蛋白酶活力的变化规律，以

期为开发发酵型中草药饲料添加剂提供依据。

1材料与方法

1.1材料中药：

青蒿、鱼腥草、地骨皮、黄岑、贯

众、胆草、石菖蒲、夏枯草、紫草、金银花、板蓝根等

中草药，购于长沙市汽车东站中药材市场，无霉变

和虫蛀。

低温烘干，粉碎后，过40目筛，备用。

供试菌株：

大肠杆菌（Escherichiacoli）、金黄

色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、鼠伤寒沙门

氏菌（Salmonellatyphimurium）、普通变形杆菌

（Proteusvulgaris）。

1.2培养基

1.2.1中草药饲料添加剂浸煮液的制备称取适

量的中草药饲料添加剂复方，加入20倍的蒸馏

水，煎煮30min后粗过滤，取滤液于8000r/min

离心15min，取上清液，减压浓缩5倍，备用。

1.2.2细菌分离培养基牛肉膏0.5%，蛋白胨

1%，NaCl0.5%，中草药饲料添加剂水煮液5%，

琼脂粉1.5%，pH7.2～7.5。

1.2.3霉菌分离培养基马丁氏固体培养基（沈

萍和陈向东，2007）中加入0.8%去氧胆酸钠和

5%中草药饲料添加剂水煮液，pH自然。

1.2.4液体种子培养基葡萄糖5%，豆饼粉

1.5%，酵母粉0.5%，KH

0.2%，MgSO

·7H

0.1%，CaCO

0.4%。

1.2.5发酵培养基中草药饲料添加剂复方

90%，麦麸5%，葡萄糖3%，（NH

）

1.5%，

0.3%，MgSO

·7H

O0.2%。

1.3方法

1.3.1中草药饲料添加剂发酵菌种筛选分别称

取10g粉碎至40目的青蒿、鱼腥草、地骨皮、黄

岑、贯众、胆草、石菖蒲、夏枯草等不同中草药于

90mL带有玻璃珠的无菌水中，振荡15min后，

适当稀释。

分别取0.1mL不同稀释度的中草药稀

释液于细菌和霉菌分离培养基平板中央，涂布均

匀。

细菌平板在37℃培养48h，霉菌平板在28℃

恒温培养3～5d进行初筛。

将初筛得到的菌株

采用平板划线法分离纯化后，分别接种于加有

20%中草药饲料添加剂浸煮液的细菌和霉菌培

养基中进行复筛，将复筛得到的菌株于4℃冰箱

中保存待用。

1.3.2培养菌种活化：

将供试菌株和Y-1接种

于牛肉膏蛋白胨和PDA培养基斜面上，分别置于

37℃和28℃恒温培养箱中培养48～72h，备用。

液体种子培养：

将培养成熟的斜面菌种Y-1

接种于液体种子培养基中，28℃，180r/min条件

下培养72h。

中草药饲料添加剂的发酵：

按配方称取中草

药饲料添加剂发酵培养基30g于250mL三角瓶

中，自来水调节含水量50%，充分拌匀，110℃灭

菌30min后，按10%（V/m）的接种量接种培养好

的液体种子，28℃培养96h，50℃烘干。

同时以接

种无菌水为对照。

1.3.3发酵条件的研究培养方法同1.3.2，替换

不同的条件，如中药与麦麸的不同比例、碳源的种

类、氮源的含量、起始pH值、含水量、温度等，考

察Y-1霉菌发酵中草药饲料添加剂后对抑菌效

果的影响及Y-1霉菌的产酶规律。

1.3.4抑菌试验及酶活测定发酵样品处理：

称

取10g不同菌种的发酵物和各组对照物，加入

200mL蒸馏水，煮沸15min后，3000r/min离心

15min，收集上清液，残渣加入200mL蒸馏水提

取后，离心，合并上清液，真空减压浓缩至每毫升

含1g生药。

抑菌试验：

取培养16～18h的大肠杆菌、金

黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌

新鲜培养液5mL，分别加入100mL冷却至50℃

左右的牛肉膏蛋白胨培养基中，混合均匀后，在直

径为9cm的标准培养皿中准确吸入15mL含菌

培养基，冷却成含菌平板。

每个平板上放置3个灭

菌的牛津杯，牛津杯中加入40μL中草药饲料添

加剂发酵浸提液。

37℃培养24h，测定抑菌圈的

大小。

每处理设3次重复。

同时以未接种的为对

照。

酶活测定：

（1）粗酶液制备：

称取经低温烘干

的固体中草药发酵剂1.00g于100mLpH4.8的

磷酸缓冲液中，40℃浸提2h，滤纸过滤，4000r/

min离心15min，4℃冰箱保存备用。

（2）纤维素

酶活力测定：

参照Vallander和Erik（1985）提供的

方法并略作修改进行测定。

（3）羧甲基纤维素酶

（CMCase）活力测定：

于25mL具塞试管中加入浓

度为1%CMC-Na-醋酸缓冲液（pH4.8）1.8mL，

加入0.2mL粗酶液，50℃保温30min后，加入

年第15期中国饲料

3.0mLDNS试剂，水浴煮沸5min，冷却后用蒸馏

水定容，摇匀，于540nm处测定光密度值。

酶活

定义：

在反应条件下，30min水解羧甲基纤维素

钠产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位

（U）；（4）FPA活力测定：

于25mL具塞试管中加

入pH4.8的醋酸缓冲液1.8mL、新华滤纸50.0

mg以及酶液0.2mL，50℃保温60min后，加入

3.0mLDNS试剂，其他同CMCase酶活测定。

酶

活定义：

在反应条件下，每60min水解滤纸产生

1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位（U）。

（5）酸

性蛋白酶活力测定：

参照姜锡（1999）提供的方法

进行测定。

2结果与分析

2.1中草药饲料添加剂发酵菌种的筛选从青

蒿、鱼腥草、地骨皮、黄岑、贯众、胆草、石菖蒲、夏

枯草等中草药中共分离出22株微生物菌株，其中

细菌14株，霉菌8株。

将纯化的菌株点种在含药

浓度逐步递增的固体培养基平板上，通过多次反

复筛选，得到一株在中药复方中生长良好、发酵能

力较强的菌株，初步鉴定为米曲霉Y-1。

2.2中草药饲料添加剂与麦麸比例对Y-1霉菌

产酶的影响及抑菌效果的影响分别配制中药与

麦麸不同比例（9∶1、8∶2、7∶3、6∶4）的发酵培养基，按

10%（V/W）接种量接种Y-1种子培养液，28℃恒

温培养72h，测定酶活，同时提取发酵液进行抑

菌实验，结果见表1、图1。

从表1可以看出，中草药饲料添加剂中添不

同比例的麦麸发酵后对四种供试菌的抑菌效果都

有不同程度的增加。

当中草药饲料添加剂与麦麸

的比例为7∶3时，发酵物料的蒸煮液对S.aureus、

S.tyhimurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌效果分别增

加38.61%、22.32%、27.93%和11.4%。

从产酶

效果来看（如图1），在一定范围内，随着麦麸比例

的增加，纤维素酶的活力增强，当中草药饲料添加

剂与麦麸的比例为7∶3时，CMCase酶活达9870

U/g，FPA酶活为892U/g，主要原因为中草药中含

有大量的纤维素，能够诱导真菌纤维素酶的分泌，

高纤维素酶活力可以破坏中草药的细胞壁，导致

中草药有效成分的充分释放，从而提高了中草药

发酵后的抑菌效果。

而蛋白酶的酶活随着麦麸含

量的增加而增加，主要原因为麦麸中含有一定量

的蛋白质，可以诱导蛋白酶的合成和分泌。

综合抑

菌效果和各种酶的含量，以下试验均选择中草药

饲料添加剂和麦麸的比例为7∶3。

2.3不同碳源对Y-1霉菌产酶的影响及抑菌效

果在其他条件相同的情况下，向培养基中分别

加入1%的蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖，以

不加其他碳源为对照，28℃恒温培养120h，测定

纤维素酶和蛋白酶的酶活，并测定抑菌活力。

结果

分别见表2和图2。

从表2中可知，发酵培养基中添加适量的不

同碳源，可以明显提高发酵中草药饲料添加剂的

抑菌效果。

在添加的四种碳源中，以添加葡萄糖的

处理，发酵物料蒸煮液的抑菌效果最好，其次是蔗

糖。

与对照相比，添加葡萄糖对S.aureus、S.ty-

himurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌效果分别提高

了18.6%、24.79%、31.48%、17.6%。

从图2中可

以看出，葡萄糖为碳源时，发酵后物料的CMCase

酶、FPA酶和蛋白酶的活力最高，分别达到9017、

1062U/g和7793U/g，蔗糖次之。

说明在发酵培养

基中添加适量葡萄糖，可以促进霉菌Y-1的生长

和酶的分泌。

2.4培养温度对抑菌效果和酶活力的影响将

中草药饲料添加剂培养物分别置于不同的温度

（28、30、32、35℃和37℃）下恒温培养120h，测

定酶活和抑菌活性。

结果分别见表3和图3。

表1中草药饲料添加剂

与麦麸比例对抑菌效果的影响

中药∶麦麸

抑菌圈直径/mm

S.aureusS.tyhimuriumE.coliP.vulgaris

对照组10.111.211.111.4

9∶112.012.513.013.0

8∶213.012.913.712.5

7∶314.013.714.212.7

6∶49.311.012.11.0

图1中草药饲料添加剂

与麦麸比例对酶活的影响

10000

9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

9∶18∶27∶36∶45∶5

CMCase酶活

FPA酶活

蛋白酶活

酶

活

（

）

中草药饲料添加剂与麦麸比例

15中国饲料2010年第15期

10000

9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

葡萄糖可溶性淀粉麦芽糖蔗糖

CMCase酶活

FPA酶活

蛋白酶活

碳源种类

酶

活

（

）

图2不同碳源对酶活的影响

表3不同培养温度对抑菌效果的影响

温度/℃

抑菌圈直径/mm

S.aureusS.tyhimuriumE.coliP.vulgaris

2813.112.413.812.7

3014.513.614.312.9

3215.614.515.114.3

3513.913.514.213.1

3712.411.712.812.5

图3培养温度对酶活的影响

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

283032343638

CMCase酶活

FPA酶活

蛋白酶活

温度

/℃

酶

活

（

）

表4起始pH值对抑菌效果的影响

抑菌圈直径/mm

S.aureusS.tyhimuriumE.coliP.vulgaris

5.09.310.76.78.7

5.511.213.714.513.6

6.014.913.915.213.9

6.514.114.415.513.7

7.014.414.315.113.1

7.512.812.013.410.5

图4起始pH值对酶活的影响

CMCase酶活

FPA酶活

蛋白酶活

11000

10000

9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

55.566.577.5

起始

pH值

酶

活

（

）

表2不同碳源对抑菌效果的影响

碳源种类

抑菌圈直径/mm

S.aureusS.tyhimuriumE.coliP.vulgaris

葡萄糖15.314.614.214.7

麦芽糖13.512.311.512.9

可溶性淀粉13.811.012.512.0

蔗糖14.713.413.313.6

对照组12.911.710.812.5

从表3可知，培养温度在28～32℃时，随着

温度的升高，发酵物料的抑菌作用也随之提高，当

培养温度为32℃时，发酵物料对S.aureus、S.ty-

himurium、E.coli、P.vulgaris的抑菌活性较28℃发

酵时分别提高19.08%、16.94%、9.42%和

12.6%。

但培养温度超过32℃，抑菌作用随着培

养温度的升高而下降。

不同培养温度对纤维素酶

和蛋白酶的酶活影响也很大，CMCase酶活和蛋白

酶酶活在32℃时最高，随着培养温度升高，酶活

降低较为明显；FPA酶活在28～35℃变化不是

很明显，但培养温度超过37℃，酶活同样降低（见

图3）。

因此确定培养温度为32℃。

2.5起始pH对抑菌效果和酶活的影响在上

述的基础上，选择不同的起始pH（5.0、5.5、6.0、

6.5、7.0、7.5）进行发酵，考察不同起始pH条件

下抑菌效果及酶活变化规律。

结果见表4和图

4。

表4和图4表明，发酵物料的初始pH值在

6.0～7.0，对供试菌的抑菌效果变化不显著；而纤

维素酶和蛋白酶酶活在pH6.0～6.5保持较高的

酶活力。

因此，在发酵前可不需调节发酵物料的

pH值，采用自然pH值即可。

2.6物料含水量对抑菌效果和酶活的影响分

别调节发酵培养基的含水量为30%、40%、

50%、60%、70%，其他条件不变，考察不同含水

量发酵条件下的抑菌效果和酶活变化。

结果见表

5和图5。

水是任何生物在生命活动过程中不可缺少的

物质。

固体基质中水分含量太少，会影响微生物对

物质的分解利用和微生物的代谢活动；水分含量

太高，会影响原料颗粒之间的松散性，使原料颗粒

成团，影响氧的传递和发酵热的散失，并容易造成

厌氧环境。

从表5可以看出，当发酵物料的含水量

为50%时，对四种供试菌的抑菌活性最高；从产

酶的变化规律分析，CMCase酶和蛋白酶酶活力在

含水量为60%时，酶活最高，分别达到8107U/g

和3158U/g，而FPA酶活在含水量为50%时最

年第15期中国饲料

含水量/%

抑菌圈直径/mm

S.aureusS.tyhimuriumE.coliP.vulgaris

3013.712.511.313.2

4014.613.912.714.3

5015.214.315.814.2

6013.112.912.212.7

7011.810.611.512.0

表5含水量对抑菌效果的影响

10000

9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

24487296120

CMCase酶活

FPA酶活

蛋白酶活

酶

活

（

）

发酵时间

高，达到1857U/g（见图5）。

为生产实际考虑，发

酵物料的含水量控制在50%～60%为宜。

2.7发酵时间对抑菌效果及酶活的影响将中

草药饲料添加剂发酵培养基分别培养不同时间

（24、48、72、96、120h），其他条件不变，取样低

温干燥后测定抑菌效果和酶活。

结果见表6、图

6。

从试验结果可以看出，发酵时间对酶的产量

和抑菌效果影响较大。

发酵前期，主要是微生物生

长阶段，随着培养时间的延长，微生物酶特别是纤

维素酶合成量加大，中草药细胞壁破坏程度加剧，

使中草药中有效成分逐步释放出来，到发酵72

h，中草药饲料添加剂发酵物料对四种供试菌的抑

制效果较发酵前分别增加60.83%、41.32%、

36.03%和27.64%，但发酵时间超过72h，抑菌

活性下降，原因可能为部分中

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