蛋白药物的制备及展望参考文献.docx

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蛋白药物的制备及展望参考文献

参考文献1

蛋白药物的制备及展望

材料科学与生命科学是21世纪最具发展潜力的2个学科，蛋药物的制备包括蛋白药物的分离纯化、制剂等均与这2个学科紧密相关。

这是因为一方面蛋白药物的分离纯化及制剂均需要各种新型的吸附分离功能材料及生物可相容、可降解、可吸收材料．另一方面蛋白药物的分离纯化给予生命科学的发展。

研究水平以及医疗水平的提高提供了坚实的物质基础。

随着科学与技术的不断发展以及人民对生活质量的要求在不断提高。

蛋白药物的制备必将发展成为21世纪我国最具吸引力的新技术产业之一。

1蛋白药物的分离纯化方法：

由于蛋白药物的种类非常多．目前使用的蛋白药物的分离与纯化的方法也非常多。

在实际操作中，使用的材料以及采取的分离与纯化的方法也是各不相同。

要根据具体选择的目标蛋白来决定．至于分离操作时所使用的条件，则更加千差万别。

一般地讲目前常用的从提取液或发酵液中分离纯化蛋白药物的方法大致有超滤、离心、沉降、萃取、电泳、膜分离、色谱分离等。

其中色谱分离技术是关键的一步，决定了最终产物的纯度。

目前生物制品的分离纯化的费用一般要占总生产成本的5O％以上。

对于基因工程药物．甚至要占到8O％～9O％，这是因为．在重组微生物或动物细胞培养液中提取药物要比传统抗生素的分离提取工艺复杂困难得多．

其原因有以下几个方面：

（1）提取液中的有效成分相对较低；

（2）杂质含量较高；（3）对最终产品的纯度要求高。

在色谱分离中。

要根据分离不同的目标蛋白，选择使用不同的分离介质。

目前大部分分离介质来自国外，因此，如何制备分离介质，也给国内的企业提供了一些机遇．由于蛋白质本身的特异性，对色谱分离介质的选择有一些基本要求。

概括起来有以下几点：

1、刚性：

应该能够承受在较高流速时所产生的压力：

2、亲水性：

有些情况下疏水性的分离介质会使蛋白变性：

3、孔径：

有些蛋白分子体积较大，需要使用大孔径的分离介质才能达到较为理想的分离效果：

4、粒径：

均匀的粒径可以获得更好的柱效：

5、容易衍生化：

以便根据目标蛋白的不同，选择使用具有不同功能基的色谱固定相：

6、稳定性：

以便耐受操作过程不同pH的变化：

7、毒性：

防止在操作过程从外界引入毒性物质；

8、特异性吸附：

以便降低蛋白在分离纯化过程中的损失，提高收率；色谱分离时，由于使用的方法不同又可以分为：

凝胶过滤层析（或体积排阻层析）、羟基磷灰石层析、离子交换层析、疏水作用层析、反相作用层析以及亲和层析等．各种层析方法的优缺点以及适用范围列于表1。

此外，值得一提的是膜分离以及高效液相制．．备色谱A脂糖或纤维素制备。

在分离介质的制备方面，瑞典的法玛西亚（Pharmacia）公司居领先地位，1995年法玛西亚和美国的普强药厂（Up—iohn）合并为法玛西亚普强（Phar—macia&Upjohn）公司：

2000年法玛西亚普强（Pharmacia&U0John）公司再次与孟山都（Monsant~公司合并，形成目前世界最大的医药公司之一。

2蛋白药物制剂及相关材料研究概况

在蛋白药物制剂的研究方面．使用PLGAf乙交酯丙交酯的共聚物）制备蛋白缓释制剂是比较成熟的方法，PLGA是一种人工合成的生物可降解的无毒的聚合物材料．已经被美国药物食品监督管理局（FDA）认定，可以进入人体使用。

用PLGA制成的含甾体类抗生素药物炔诺酮和18甲基左炔诺孕酮的微球注射剂．在美国正在进行III期临床试用，不久可能进入市场。

一种释放促黄体激素释放激素fLH—RH）类似物的PLGA微球，的使用，给蛋白药物的分离纯化提供了非常有力的武器。

由于疏水性很强的聚苯乙烯介质容易使蛋白变性．因此分离纯化蛋白用的介质大部分用葡聚糖和琼囝堑堕兰源．在自然界存量仅次于纤维素。

近年来，使用壳聚糖对蛋白药物进行分离纯化做了许多研究，有望成为可以代替葡聚糖和琼脂糖的新型分离介质。

参考文献2

多肽、蛋白类药物脂质体研究进展

摘要:

脂质体做为多肽、蛋白类药物一种新型给药载体有控制药物释放、降低药物的毒性、提高药物的靶向性等突出优点，具有广阔的应用前景。

通过查阅近10年来多肽和蛋白类药物脂质体研究的相关资料，总结论述了脂质体作为多肽、蛋白类药物载体在新的制备方法、新型脂质体、产业化进展三个方面的最新研究动向，指出了多肽、蛋白类药物脂质体在研究应用中存在的不足，并展望了多肽、蛋白类药物脂质体未来发展方向。

关键词:

多肽蛋白质药物脂质体

多肽、蛋白类药物与传统药物相比，不仅具有用药剂量小、疗效好、毒副作用低等突出优点，而且还具有不同于传统药物的一些特性

（1）蛋白质分子的化学结构决定其活性，影响活性的结构因素主要为氨基酸及其排序、末端基团、肽链和二硫键位置等。

此外，药物的空间结构即二维、三维结构也同样影响生物活性。

（2）蛋白质药物体内外不稳定性。

蛋白质药物在体内外环境可能经受多种复杂的化学降解和物理变化而失活，如凝聚、沉淀、消旋化、水解、脱酰氨基等。

（3）蛋白质药物半衰期短、清除率高、分子量大、易受体内酶和细菌以及体液的破坏、非注射给药生物利用度低，一都仅为百分之几¨J。

因此，如何设计出安全、有效和稳定的转运多肽、蛋白类药物的新型给药系统是当今制剂工作者和制药业面临的一个重大难题。

多肽、蛋白类药物脂质体的研究是当前一个十分活跃的领域。

脂质体用做多肽、蛋白类药物载体具有众多优点和用途：

（1）根据脂质体类似生物膜的结构，脂质体可以用来测定多肽、蛋白类药物通过膜的渗透性能及药物在膜和水相之间的分配性能等；

（2）根据脂质体具有细胞亲和性，适合体内降解、无毒性和无免疫原性的特点，脂质体被广泛制药和化妆品中的多肽、蛋白类药物载体；（3）脂质体做为药物载体可控制药物的释放和具有器官靶向性，可用于药物的可控释放和体内的靶向给药；（4）利用脂质体可与细胞融合的特性，脂质体还可用作将目的基因L2j和其它多肽、蛋白类物质向细胞内传递的工具，介导转染作用；（5）利用特异性修饰脂质体表面物质的特殊性质如免疫原性等，脂质体可用于免疫检测和亲和层析，高效检测和筛选目的蛋白∞j，菌落及噬菌体群等。

本文将着重论述新型脂质体、脂质体作为多肽、蛋白类药物载体的新型制备方法、产业化三个方面的最新研究动向，并根据文献探讨多肽、蛋白类药物脂质体在研究中存在的不足及未来可能的发展方向。

L新型脂质体

1．1PEG修饰长循环脂质体

PEG修饰长循环脂质体是近年来研究较多的一种多肽、蛋白类药物载体，其具有许多优点，PEG修饰长循环脂质体可以通过所谓“被动靶向”或代偿滤过机制有效地达到病变部位（如肿瘤、感染、心肌梗塞等区域），提高对靶向组织的选择性，另外PEG修饰长循环脂质体的组成中含有亲水性聚合物如聚乙二醇（PEG）的二硬脂酸磷酯酰胺（DsPE）的衍生物（PEG．DsPE）等，可阻止血浆蛋白吸附于脂质体表面能够逃避网状内皮系统的捕获，特别是在体内能阻止吞噬细胞对脂质体的识别和摄取，而极大延长脂质体在血液中循环时间，从而提高治疗指数和疗效，减轻了不良反应，具有极好的产业化前景。

1．2免疫脂质体

免疫脂质体是机体修饰脂质体的简称，其作用机理是：

将单克隆抗体（也称为单抗或配基）与特定脂质体藕联可构建成免疫脂质体，该脂质体经单抗与靶细胞抗原．抗体特异性结合，可将脂质体靶向到特定细胞和器官。

免疫脂质体结合热敏和pH敏感可制得免疫热敏脂质体和pH敏感脂质体。

如将RDM4细胞的单抗连接到尿嘧啶核苷热敏脂质体上制备免疫热敏脂质体，将其与细胞共育1min后，热敏脂质体和游离药物在细胞内基本无分布，而应用免疫热敏脂质体后，在细胞中已经有一定浓度的药物存在。

5IIIin后，细胞对免疫热敏脂质体中尿嘧啶的摄取量是热敏脂质体的4倍，是游离药物的近7倍。

BIiscoe等人将surfactantpmteinA（sP—A）插入pH敏脂质体表面，可获得表达sP-A高亲和性受体的肺上皮细胞的特异靶向性。

由此携带sOD与肺上皮细胞孵育，可使细胞的sOD活性增加。

为了延长免疫脂质体在血液中的循环时间，在免疫脂质体表面引入PEG脂质体复合物可得到兼有主动靶向性和长循环的空间稳定免疫脂质体。

KentaroFummoto等⋯用清除率和肝脏首过消除率明显低于PEG一脂质体，进一步实验确证：

小鼠白蛋白藕联的PEG．脂质体能显著降低与调理作用相关的血浆蛋白的黏附，从而延长在循环系统中的停留时问，发挥“长循环”作用。

1．3柔性脂质体

类脂聚集体加入表面活性剂，如磷脂与胆酸钠制备的脂质体，具有较大的柔性，在一定压力作用下，发生自身形变，主要用于透皮给药，在透皮水合力作用下，可穿过比其粒径小几倍的皮肤孑L道；这种脂质体亦称传递体（transfersome），柔性脂质体用于多肽、蛋白类药物的主要有两种：

纳米柔性脂质体和含醇脂质体。

纳米柔性脂质体近来，纳米柔性脂质体用于多肽、蛋白类物非注射给药系统具有安全可靠的优点，引起了研究者的普遍关注。

sim6es等归J通过构建大鼠关节炎模型，经静脉注射给药s0D纳米柔性脂质体，给药剂量lmgs0D／kg和0．66mgs0D／kg．放射影像实验结果显示：

给药超氧化物歧化酶（s0D）纳米柔性脂质体组的关节损伤度明显小于控制组和安慰剂组；给药剂量1mgSOD／kg组的损伤度明显小于0．66mgs0D／kg组。

PremNGupta等【10J以破伤风毒素（TT）为模型蛋白疫苗，经大鼠皮肤给药（给药剂量6．25斗g／cm2）后，系统的比较了纳米柔性脂质体、纳米脂质体和普通脂质体应用于非注射疫苗给药系统的作用效果。

结果表明：

纳米柔性脂质体、纳米脂质体和普通脂质体被抗原识别捕获激发产生抗破伤风毒素IgG的比例分另0为：

72．7±3．4％、42．5±2．4％、41．3±2．2％。

进一步体内实验证实，纳米柔性脂质体再次免疫动物后能迅速产生抗破伤风毒素IgG，免疫应答反应强烈持久。

2多肽、蛋白类药物脂质体的新型制备方法

基于多肽、蛋白类药物本身的特点，在脂质体的制备中需尽量避免高温、有机溶剂、表面活性剂、剧烈超声等条件的使用。

传统的脂质体制备方法包括薄膜法、反相蒸发法、钙融合法、表面活性剂处理法及挤出器法等，其共同之处都是先用有机溶剂或表面活性剂溶解磷脂，得到粗制的磷脂双层膜，然后将膜进行水化处理，再通过适当方法得到大小不同的脂质体。

主要存在的问题是：

（1）脂质体包封率低。

（2）工艺自身的缺陷、残留的有机溶剂或表面活性剂都会导致蛋白质药物的生物活性降低。

（3）很难实现产业化。

为了克服多肽、蛋白类药物脂质体的众多缺点，新的脂质体制备方法近来已成为脂质体研究的热点。

2．1主动载药法（pH梯度法）

一般脂溶性药物能分布在脂质双分子层中。

脂质体对这些药物的包封率和载药量一般都较高。

而水溶性药物和双层膜作用较小，按一般方法只能少量包裹在脂质体的内水相中，这类药物制成脂质体，包封率往往达不到要求，运用主动载药的方法能较好地解决亲水性药物的载药问题。

主动载药是利用二些两亲性的弱酸、弱碱能够以电中性的形式跨越脂质双层，但其电离形式却不能跨越脂质双层的原理来实现的/

2．2冰冻熔融法

可避免使用加热、超声等剧烈条件是冰冻熔融法的突出特点。

实验操作首先制备未包封药物的小单室脂质体，在冻干前将待包封的药物加入，在快速冷冻过程中，由于冰晶的形成，使形成的脂质体膜破裂，形成冰晶的片层与破碎的膜同时存在。

此状态不稳定，在缓慢融化过程中，暴露出的脂膜互相融合重新形成脂质体。

毛孙忠等¨4J分别采用薄膜法、逆相蒸发法、复乳法和冰冻融熔法制备L一精氨酸脂质体对四种方法制备的脂质体进行包封率测定

2．3C02超临界法

传统脂质体制备方法，制备过程均会不同程度的引入有机溶剂，并且伴有加热，超声等剧烈过程，这些过程都可能对多肽、蛋白类药物的稳定性及活性造成影响，临界二氧化碳是一种无毒、惰性、不燃、价廉易得而又对环境友好的反应介质，二氧化碳可循环使用，因此可减少污染，节约资源，绿色环保．采