巨线粒体DNAND6基因克隆及多态性分析.docx

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巨线粒体DNAND6基因克隆及多态性分析

巨线粒体DNAND6基因克隆及多态性分析

　　摘要：

利用GenBank数据库中科鱼线粒体ND6基因序列保守区设计引物，采用PCR技术克隆并测序，共得到12尾巨ND6基因全序列。

用DNAMAN5.0软件比对序列，MEGA5.0软件分析科不同鱼类的进化关系，结果表明：

巨ND6基因序列全长为516bp，碱基含量分别为14.20%、34.50%、40.20%、11.00%，其中“A+T”含量（54.40%）高于“G+C”含量（45.50%），存在4个单倍型，发生3次颠换；12个个体4个单倍型间的平均相对遗传距离为0.003；将巨与其他14种鱼类的ND6基因用Neighbore-Joining（NJ）法构建系统发育树，发现巨单独聚为1支。

研究将为今后鱼类线粒体基因组的研究提供科学依据。

　　关键词：

巨；线粒体；ND6基因；多态性；系统进化

　　中图分类号：

S917.4

　　文献标志码：

A

　　文章编号：

1002-1302（2016）04-0062-04

　　巨（BagariusyarrelliSykes）是云南省特有鱼类，主要分布于元江、澜沧江、怒江流域，属于鲇形目（Siluriforme）科（Sisoridae）属（Bagarius）。

巨个体很大，体质量约50kg，全身无鳞，皮肤表面布满细密的微小颗粒物，使其皮肤极为粗糙，此外其体表无黏液，身体背面颜色为灰黄色，腹面为白色，肌肉为黄色，所以又称“黄鱼”[1]。

巨为底栖肉食性鱼类，具有口宽、上下颌都有齿带、牙齿呈锥形且排列紧密、鳃耙粗短、胃大、肠短等特点，主要食物为鱼类、虾、泥鳅、水生昆虫[2]。

田树魁等通过比较巨、叉尾鲇、斑点叉尾3种鱼肌肉中常规营养成分和氨基酸含量，发现巨肌肉中蛋白质、粗脂肪和必需氨基酸的含量比常规鱼类高，是一种具有较高营养价值的有待驯养开发的野生鱼类[3]。

杜民等研究表明，野生巨具有较高的遗传多样性[4]。

但是由于地理环境的改变和人为因素的影响，野生可利用的巨资源越来越少。

为了保护该鱼类，薛晨江等开展了巨的人工驯养，并取得初步成功[5]。

　　鱼类线粒体DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）是细胞核外（细胞质中）具有转录、自主复制和翻译能力的共价闭合环状双链DNA[6]。

鱼类的mtDNA主要包括37个基因（22个tRNA编码基因、13个疏水蛋白基因、2个rRNA基因）；其中13个疏水蛋白基因编码的多肽中包含了7个氢化辅酶Ⅰ（nicotinamideadeninediuncleotidehydrogen，NADH）脱氢酶的亚单位（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）。

ND6蛋白编码基因位于L链上，处于细胞色素b与ND4之间的连续区域，是线粒体内膜呼吸链的重要组成成分[7]。

在氢化辅酶中，由于ND6基因序列不易发生变异，进化速度一般，且基因片段不长，因此常用来研究物种的遗传多样性、种群之间的亲缘关系以及系统进化关系[8]。

方月琴等用复合扩增体系，选择线粒体ND6基因进行种属鉴定，结果表明，该方法可以将13种不同的动物区分开来[9]。

也有研究表明，ND6基因与人类疾病帕金森氏症等发生有关[10]，ND6基因还被用于研究鸟类的亲缘关系[11]，但是大多应用于鱼类群体和亚种间的遗传变异研究[12-13]。

对巨的线粒体ND6基因全序列进行检测分析，进而分析巨遗传结构、变异及与其他物种之间的同源差异，可为今后巨鱼种研究提供一定的试验数据与理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　本研究采用的12尾巨采自云南省河口县。

剪取肌肉组织放于1.5mLEP管中，贴上对应标签，再加入无水乙醇，于4℃保存备用。

　　1.2试验方法

　　1.2.1基因组DNA的提取及多态性引物筛选DNA的提取参考Sambrook等的酚/氯仿抽提法[14]。

用凝胶成像系统观察、照相记录后，将提取的DNA贮存在-20℃冰箱中备用。

　　根据GenBank数据库中已公布的科巨鱼线粒体基因组ND6基因序列（登录号：

NC_021606，JQ026260），用PrimerPremier5软件设计简并引物：

上游引物：

5′-GCACCTCAGAAKGATATTTGWCCYC-3′；下游引物：

3′-TYTAAACAGCCCGAAGCGCMC-5′，在PCR扩增仪上进行扩增，反应体系见表1。

　　PCR反应条件：

94℃4min；94℃30s，54℃50s，72℃90s，30个循环；72℃延伸6min；4℃保存。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶在120V电压下电泳35min，最后通过凝胶成像系统得到PCR产物条带并照相。

　　检测后的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，在紫外分析仪下切下目的片段，用DNA凝胶回收试剂盒（天根生物科技有限公司）进行回收纯化，具体步骤参照回收试剂盒说明书进行。

　　1.2.2目的DNA片段的连接与转化用pMD18-T载体与目的DNA进行连接、转化，具体步骤参照载体连接试剂盒说明书进行，用LB培养基进行扩大养后用M13进行阳性克隆筛选，送交南京金斯瑞科技生物公司测序。

　　1.3数据分析

　　利用DNAMAN5.0软件将测得的巨线粒体ND6基因部分序列与参照物种ND6基因部分序列进行比对。

利用MEGA5.0软件中的Kimura2-parameter方法计算遗传距离，采用邻接法（Neighbore-Joining，NJ）中的MaximumCompositeLikelihood法构建系统发育树，通过自举检验（Bootstrap）获得系统分支的置信度（重复1000次）。

　　2结果与分析

　　2.1DNA提取

　　从巨鱼鳍条或肌肉提取DNA，结果见图1。

可以看出，DNA条带清晰。

　　2.2引物退火温度的优化

　　用设计的Bayam18引物退火温度的±10℃范围进行梯度PCR（图2），所用marker为BM2000，Bayam18引物的退火温度梯度见表2。

由图2可知，Bayam18号引物能扩增出条带的温度为55、55.6、56.4、57.5、59.2、60.7、61.9℃，根据条带明亮度，初步确定Bayam18引物最适的退火温度。

　　2.3扩增产物与DNA回收

　　利用凝胶回收试剂盒对PCR产物（图3）进行回收，回收产物（图4）于-20℃保存。

　　2.4菌液退火温度优化

　　通过梯度PCR优化M13通用引物的退火温度（图5）。

M13通用引物序列见表3，退火温度梯度见表4。

由图5可知，M13通用引物在每个泳道都扩增出了明亮条带。

　　2.5巨鱼ND6基因序列的碱基含量

　　本试验中，利用下载序列通过DNAMAN5.0软件对比排位，得到ND6基因片段长度516bp，12条序列中发现4个单倍型，其中6号、7号、11号个体序列相同，为1#单倍型；1号、3号、4号、5号、8号、9号、12号个体序列相同，为2#单倍型；10号个体为3#单倍型；2号个体为4#单倍型。

采用MEGA5.0软件计算它们的碱基组成（表5），可以得出T、C、A、G4种碱基含量分别为14.10%、34.80%、40.10%、11.00%，其中“A+T”含量（54.20%）高于“G+C”含量（45.80%）。

　　2.6巨鱼ND6基因12个个体的相对遗传距离

　　用MEGA5.0软件中的双参数法，通过转换加颠换、转换比颠换分别计算12个个体之间的相对遗传距离[15]，详见表6。

由表6可知，12个个体的4个单倍型之间的差异（转换加颠换）为0.002～0.004。

　　2.7基于ND6基因构建系统发育树

　　将巨鱼ND6基因与其他14物种（表7）进行比对，用MEGA5.0软件构建系统发育树[16-17]，从图6可以看出，系统发育树分为两大支，巨单独聚为1支。

　　3讨论与分析

　　本试验通过从GenBank数据库中查询已公布的科巨线粒体基因组中ND6基因序列保守区设计引物，采用PCR反应扩增、克隆及测序巨ND6基因，共得到12条ND6基因全序列。

对巨线粒体ND6基因序列进行研究，得到ND6基因全序列长516bp。

　　利用MEGA5.0软件分析对巨鱼线粒体ND6基因12个个体进行分析，得到T、C、A、G这4种碱基含量分别为14.10%、34.80%、40.10%、11.00%，其中“A+T”含量（54.20%）高于“G+C”含量（45.80%），说明ND6基因序列中富含碱基A、T。

共发现4个单倍型，3个变异位点，都为单突变位点，表明ND6基因序列多态性贫乏，序列之间差异不大，这与赖瑞芳等比较鲂属鱼类线粒体基因组，研究鲂属鱼类系统发育的结果[18]是一致的。

ND6基因序列共发生3次颠换，表明本研究的4个单倍型的ND6基因核苷酸变异类型以

　　颠换为主。

12个个体的4个单倍型之间平均相对遗传距离为0.003，转换和颠换的比值为0.667，表明这12个个体之间亲缘性近，ND6基因序列变异并不显著，这与于美玲等对科鱼类系统发育关系的研究结果[19]一致。

　　此外，由系统发育树可知，系统发育树分为两大支，其中巨单独聚成1支，置信值为100%，表明与其他14种科鱼亲缘性远。

另一支又分为2支，分别是细尾、长丝黑先聚为1支，黄石爬、黑斑原先聚为1支后，这4个种类进而聚为一个大的分支后与本研究的4个巨聚在一起。

大鳍异齿和中华先聚为1支，二者与三线纹胸聚在一起后与中华纹胸聚为1支，再与藏聚在一起，然后与黄斑褶聚为较大的分支。

巨单独聚成1支，这与形态学分类结果与基于细胞色素b（Cytochromeb）、rpS7基因研究的遗传进化是一致的[20-21]。

本研究通过研究巨鱼ND6基因序列多态性，可为以后研究巨与其他鱼类的亲缘性、系统进化等研究提供科学依据。

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