（3）氨基酸的紫外吸收能力
参与蛋白质组成的20种氨基酸，在可见光区都没有光吸收，但在远紫外光区（<220nm）均有光吸收。
在近紫外光区（220-300nm）只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力，因为它们的R基含有苯环共轭双键系统。
酪氨酸的最大光吸收波长为275nm（苯酚基）、苯丙氨酸为257nm（苯基）、色氨酸为280nm（吲哚基）。
蛋白质由于含有这些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般最大光吸收在280nm波长处，可利用蛋白质的这个特点测定蛋白质的含量。
（4）与茚三酮反应
在弱酸性溶液中茚三酮与α-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物（氨）及还原茚三酮发生作用，生成紫色物质，利用这个反应可以定性或定量地测定各种氨基酸。
两个亚氨基酸，即脯氨酸和羟脯氨酸因与茚三酮反应不释放氨，而直接生成黄色化合物。
二、蛋白质的种类
生物界蛋白质的种类估计在1010-1012数量级。
蛋白质种类多样的原因是：
参与蛋白质组成的20种基本氨基酸在肽链中的排列顺序不同。
1、按蛋白质分子的化学成分，可分为
（1）简单蛋白质：
完全由氨基酸构成的蛋白质，如核糖核酸酶、胰岛素等。
（2）结合蛋白质：
除蛋白质外，还有非蛋白质成分（一般称为辅基或配基），这样的蛋白质叫结合蛋白质。
结合蛋白质可再按其辅基进行分类。
2、按蛋白质分子的形状，可分为
（1）球状蛋白质：
分子对称性佳，溶解度较好，能结晶，大多数蛋白质属此类型。
（2）纤维状蛋白质：
分子对称性差，溶解度较差，呈细棒状或纤维状，又可分为：
可溶性纤维状蛋白质，如肌球蛋白、血纤维蛋白原；
不溶性纤维状蛋白质，主要生理功能是在生物体内作为结构成分存在，如胶原、弹性蛋白、角蛋白、丝心蛋白等。
3、按蛋白质的生物功能，可分为
蛋白质从功能上可分为酶蛋白、结构蛋白、载体蛋白、受体蛋白、防御蛋白（免疫球蛋白）、营养和贮存蛋白、收缩蛋白、运动蛋白等。
三、蛋白质分子的大小与分子量
蛋白质的分子量变化很大，一般为6000-106道尔顿。
确定蛋白质分子量的简单方法举例：
1、凯氏定氮法：
蛋白质含量=蛋白氮×6.25
蛋白质元素组成特点：
蛋白质的平均含氮量为16%，这是凯氏定氮法的计算基础，上式中的6.25为16%的倒数，即1g氮所代表的蛋白质量。
2、不含辅基的简单蛋白质
可用蛋白质的分子量除以110来估计其氨基酸残基的数目。
原因是：
蛋白质中20种氨基酸的平均分子量为138，但在多数蛋白质中较小的氨基酸占优势，因此其平均分子量接近128，又因为每形成一个肽键将失去一分子水的分子量（18），所以氨基酸残基的平均分子量为110。
四、蛋白质的构象
蛋白质的生物学功能决定于它的高级结构，而蛋白质的高级结构由它的一级结构，即氨基酸的顺序决定。
天然存在的蛋白质总是处于热力学最稳定的状态。
蛋白质的构象：
每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构通常称为蛋白质的构象。
一般用蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、四级结构来表示蛋白质不同层次的构象。
1、一级结构
蛋白质的一级结构指多肽链共价主链中氨基酸残基的排列顺序。
ＨＯ
∣‖
（1）共价主链：
肽链是由规则单位—N—C—C—重复排列而成，称其为共价主链。
∣∣
ＨＲ
不同的肽链，其共价主链都是一样的，差异在于R基的顺序，即氨基酸残基的顺序。
（2）肽键、肽平面与多肽链：
氨基酸残基：
多肽链中的每一个氨基酸单位叫做氨基酸残基，因为在形成肽键时丢失了一分子水。
肽键：
由于肽键中氮原子的孤对电子与相邻羰基之间的相互作用，表现出高稳定性。
X-射线衍射分析证明，C—N单键有40%的双键性质，C=O双键有40%的单键性质。
肽链中肽键都为反式构型。
重要的特例是：
含脯氨酸的肽键，其构型可以反式的，也可以是顺式的，因为脯氨酸侧链的四氢吡络环引起的空间位阻消去了反式构型的优势。
肽平面：
肽键中的C—N具有双键性质不能自由旋转，结果肽键的4个原子和与之相连的两个α-碳原子（Cα）都处于同一个平面内，此平面称为肽平面。
多肽主链上只有与α-碳原子连接的两个化学键（如Cα——N1，Cα——C2）是单键，可以自由旋转。
多肽链的方向：
对直链多肽而言，规定从肽链的氨基末端（N-端）的氨基酸残基开始命名，书写时，也通常把氨基末端氨基酸写在左面，羧基末端（C-端）氨基酸写在右面。
（2）肽的显色反应
①与茚三酮的反应：
和氨基酸一样，肽链中游离的α-氨基也能与茚三酮发生反应，生成紫色物质。
这一反应广泛用于肽的定性和定量测定。
②双缩脲反应：
一般含有两个或两个以上肽键的化合物可与碱性硫酸铜溶液发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色复合物，利用这个反应可以测定蛋白质的含量。
该反应为肽和蛋白质所特有，氨基酸不能发生此反应。
2、二级结构
蛋白质的二级结构指多肽链借氢键排列成沿一维方向具有周期性结构的构象，如α-螺旋、β-折叠片、β-转角等。
使多肽链发生折叠的主要动力：
一是疏水相互作用，这种相互作用使暴露在溶剂中的疏水基团降低至最少程度；二是处于伸展状态的多肽链和周围水分子之间形成的氢键。
（1）蛋白质的二级结构主要有以下方式：
①α-螺旋：
为蛋白质中最常见，含量最丰富的二级结构，且几乎都是右手的，因为右手螺旋比左手螺旋稳定。
α-螺旋中的氢键是由肽键上的N—H上的氢与它后面（N端）第四个残基上的C=O上的氧之间形成的。
α-螺旋由于它的构象具有规则结构，从而引起肽链折叠中的协同性，即一旦形成了一圈α-螺旋，随后逐个残基的加入就会变得更加容易而迅速，这是因为第一圈螺旋成为安装相继的螺旋残基所需的模板。
一条多肽链能否形成α-螺旋，以及形成的α-螺旋是否稳定，与该肽链氨基酸的组成与排列顺序有极大的关系，如R基的大小（较小易）、R基是否带有电荷（不带电荷易）、多肽链中是否存在脯氨酸及羟脯氨酸（有则α-螺旋被中断，形成“结节”）等。
②β-折叠：
为蛋白质中常见的二级结构。
两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的—NH和C=O之间形成有规则的氢键，这样的多肽构象就是β-折叠。
β-折叠有两种类型，一种是平行式，即所有肽链的N端都在同一方向；另一种是反平行式，肽链的极性一顺一倒，N端间隔同向。
③β-转角：
又叫回折、β-弯曲，该结构多数位于球状蛋白分子的表面，因为在这里改变多肽链的方向阻力较小。
β-转角有三种类型，其共同特点为：
每种类型都有4个氨基酸残基，且弯曲处的第一个残基的C=O和第四个残基的—NH之间形成氢键，形成不很稳定的环形结构。
（2）超二级结构：
蛋白质中，特别是在球状蛋白中，由若干相邻的二级结构单元（即α-螺旋、β-折叠、β-转角）组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、空间上能辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件，称为超二级结构。
已知的超二级结构有三种组合形式：
（αα）、（βαβ）、（βββ）
3、三级结构
蛋白质的三级结构指多肽链借助各种次级键（非共价键）盘绕成具有特定肽链走向、呈紧密球状的构象。
在三级结构中，除了属于二级结构的α-螺旋、β-折叠片等规则构象外，还有无规则的松散肽段。
三级结构是多肽链上各个单键的旋转自由度受各种限制的总结果，它决定于一级结构中氨基酸的长程顺序及其种类。
维系蛋白质三级结构的作用力主要有盐键、氢键、范德华力、疏水相互作用、二硫键等。
二硫键也叫二硫桥，是由两个半胱氨酸中的两个巯基（-SH）相连而成，多见于在β-转角附近。
它在维持蛋白质的空间构象及维持蛋白质的生物活性方面上起重要作用。
二硫键可存在同一条肽链中（链内二硫键），也可存在于不同的肽链间（链间二硫键）。
蛋白质的三级结构决定于氨基酸残基的顺序，这一结论最直接最有力的证据是某些蛋白质的可逆变性实验，特别六十年代的牛胰核糖核酸酶复性经典实验。
4、寡聚蛋白质及其四级结构
（1）四级结构：
很多蛋白质以三级结构的球状蛋白通过非共价键彼此缔合在一起形成聚集体，这就是蛋白质的四级结构。
亚基：
又称单体，四级结构的蛋白质中每个球状蛋白质称为亚基或亚单位，亚基一般是一条多肽链，但有的亚基由二条或多条肽链通过二硫键连接而成。
单体蛋白质：
指无四级结构的蛋白质，如肌红蛋白、溶菌酶等。
寡聚蛋白质：
指由两条或更多条多肽链（亚基）组成的蛋白质。
（2）别构蛋白质和别构效应
别构蛋白质：
又叫调节蛋白质，为寡聚蛋白质，分子中每个亚基都有活性部位或者还有别构部位（调节部位）。
如天冬氨酸转氨甲酰酶，活性部位与别构部位分属不同的亚基。
别构效应：
指别构蛋白（如血红蛋白、别构酶等）与配基结合后，蛋白质的构象发生改变，进而改变了该别构蛋白生物活性的现象。
五、蛋白质的变性与复性
1、蛋白质的变性作用：
在某些物理、化学因素的影响下，蛋白质分子中次级键被破坏，结果蛋白质分子从有序紧密的构象变为无序而松散的构象，即蛋白质分子构象改变至解体的过程。
变性作用不涉及共价键（肽键和二硫键等）的断裂，一级结构保持完好；变性作用是一个协同过程，此过程是在变性剂浓度很窄范围内；或很窄的pH范围内，或很窄的温度间隔内突然发生的。
2、引起蛋白质变性因素
物理因素：
热、紫外线照射、高压和表面张力等；
化学因素：
酒精、尿素、丙酮等有机溶剂，酸，碱等。
3、变性过程中蛋白质分子的变化：
（1）蛋白质内部一些侧链基团暴露，如疏水基团外露等。
（2）蛋白质理化性质改变，如溶解度下降，蛋白质分子伸展，不对称性增加等。
（3）生物化学性质的改变，如变性后的蛋白质更易被蛋白酶水解等。
4、生物活性的丧失：
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时空间结构只有轻微的局部变化，甚至这些变化还没有影响物理化学性质时，蛋白质的生物活性就已经丧失了。
蛋白质的复性：
当变性因素除去后，有些变性的蛋白质又可重新回复其天然构象，这一过程称为复性。
六、蛋白质的性质及其分离方法
1、蛋白质的酸碱性质
在蛋白质分子中有游离的α-氨基、α-羧基，R基侧链上也有各种功能基团，因此蛋白质的很多物理化学性质与氨基酸是相同的，如蛋白质也是两性化合物；也可把它看成多价离子，也有等电点（pI）等。
2、蛋白质的胶体性质与沉淀
（1）蛋白质溶液属于胶体溶液
根据分散程度可以把分散系统分成三类：
分散相质点小于1nm的为真溶液；大于100nm的为悬浊液；介于1-100nm的为胶体溶液。
分散相质点在胶体系统中保持稳定，需要具备三个条件：
一是分散相的质点在1-100nm间；二是分散相质点带有同种电荷，结果质点间互相排斥，不易产生沉淀；三是分散相质点能与溶剂形成溶剂化层，如水分层。
质点的水化层使质点不易相互靠近，从而不易产生沉淀。
蛋白质溶液属于胶体溶液，和一般的胶体系统一样也有布朗运动、丁达尔现象及不能通过半透膜等特性。
（2）蛋白质分子的质点大小、带同种电荷和水化层是稳定蛋白质胶体系统的主要因素。
任何影响这些条件的因素都有会影响蛋白质溶液的稳定性，使蛋白质发生沉淀。
沉淀蛋白质的几种常用方法
①盐析法：
向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（如氯经钠、硫酸钠等），使蛋白质脱去水化层而沉淀，这种方法一般会使蛋白质变性。
②有机溶剂沉淀法：
向蛋白质溶液中加入一定量的有机溶剂（如乙醇、丙酮），使蛋白质脱去水化层，同时降低了溶剂的介电常数，从而使蛋白质沉淀。
③重金属盐沉淀法：
当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电，这样就易和重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。
④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：
当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，易与生物碱试剂、酸根离子生成难溶性盐而沉淀。
⑤加热变性沉淀法：
当蛋白质处于等电点，加热凝固最完全和最迅速。
3、蛋白质混合物的分离方法简介
可根据蛋白质分子的大小、溶解度、电荷性质与数量、吸附性质及对其它分子的亲和力不同，对蛋白质混合物进行分离。
（1）根据蛋白质的分子大小进行分离
①透析：
利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质进行分离，常用的半透膜是玻璃纸、火棉纸等。
②超过滤：
利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，通过施加压力或离心方法，强行使水和其它小溶质分子通过半透膜，而使蛋白质分子留在半透膜上。
③密度梯度离心：
蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，还决定于它的密度。
如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时就会停下来。
最终各种蛋白质在离心管（常用塑料的）中被分离成各自独立的区带。
分成区带的蛋白质可以在管底刺一小孔放出，并分部收集。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。
④凝胶过滤（又叫分子排阻法、分子筛层析）
这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，其原理实际上是一种层析法。
凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，在凝胶珠的内部是多孔的网状结构。
经常使用的凝胶有交联葡萄糖、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等。
分子大小不同的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，从而被排阻在凝胶珠之外，而比凝胶网孔小的分子则能自由进出珠内网状结构，这样当蛋白质混合物随着溶剂在层析柱中下行时，分子越小蛋白质的在下行过程中所走的距离越长，下行的速度越慢。
结果大分子物质先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。
（2）根据蛋白质的溶解度进行分离
影响蛋白质溶解度的因素主要有pH值、离子强度（盐浓度）、介电常数、温度等。
通过改变上述某些条件，使混合物中某种蛋白质的溶解度发生改变，从而达到分离的目的。
①等电点沉淀法
当蛋白质处在等于其等电点的介质环境中时，蛋白质的净电荷数为0，由于相邻蛋白质分子之间的静电斥力消失而发生沉淀。
利用不同的蛋白质分子具有不同的等电点，且蛋白质在等电点时溶解度最小的原理，控制蛋白质溶液的pH值，使其等于某一蛋白质的等电点，从而实现对该蛋白质的沉淀及分离。
这样沉淀下来的蛋白质保持了天然构象，在其非等电点的pH介质环境下能重新溶解。
②蛋白质的盐溶和盐析
中性盐对球状蛋白的溶解度有明显的影响。
盐溶及其机理：
低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。
盐溶的机理是：
蛋白质分子与某种盐类离子结合后，带电表层使蛋白质分子间彼此排斥，同时蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，使蛋白质分子溶解度增加。
同样浓度的二价离子的中性盐与单价离子的中性盐相比，两价离子的盐溶效果要大得多。
盐析及其机理：
当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降。
当离子强度增加到足够大时，如中性盐浓度处于饱和或半饱和状态时，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来。
盐析的机理是：
大量中性盐的加入，使水的活度降低，自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质的极性基团与水分子间的相互作用，破坏了蛋白质分子的水化层。
③有机溶剂分级法：
在一定的温度、pH值、离子强度条件下，可通过控制有机溶剂的浓度，达到分离蛋白质的目的。
有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，同时使蛋白质变性，如果先将有机溶剂冷却到-40℃到-60℃，然后在不断搅拌的同时，一滴一滴加入有机溶剂以防局部浓度过高，便可以解决变性问题。
④温度
在一定温度范围内（0-40℃），大部分球状蛋白质的溶解度随温度的升高而增加。
也有例外，如人的血红蛋白。
而温度高于40℃-50℃时，大部分蛋白质开始变性。
（3）根据蛋白质所带电荷数的不同进行分离
①电泳：
在外加电场的作用下，带电颗粒（如不处于等电点的蛋白质分子）将向与其电性相反的电极移动，这种现象为电泳。
带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷性质、数量；带电颗粒的大小、形状；电场强度的大小等。
②离子交换层析
以强酸型阳离子交换树脂为例，带正电的蛋白质与树脂交换而被“挂”在树脂上，使其移动速度变慢，这种情况下，蛋白质被洗出的顺序一般为：
带负电的蛋白质最先被洗出，带正电的蛋白质最后被洗出。
【例题精析】
例2、一个突变使一种蛋白质分子内的丙氨酸残基变成缬氨酸残基，并使此蛋白质的活性丧失。
其原因是：
C
A、缬氨酸是酸性氨基酸，而丙氨酸是碱性氨基酸
B、丙氨酸是形成а-螺旋所必需的，而缬氨酸则不是
C、缬氨酸比丙氨酸占据空间大，因此蛋白质分子的形状改变了
D、缬氨酸的存在改变了蛋白质的等电点。
解析：
缬氨酸和丙氨酸都是中性氨基酸，因此A不正确；丙氨酸和缬氨酸都能形成а-螺旋，只要两个或多个缬氨酸残基（-碳链有分枝）不连续排列即可，因此B不正确；缬氨酸的侧链为异丙基比丙氨酸的侧链甲基大，而且它们都是疏水氨基酸，一般分布在蛋白质分子的内部，特别是如果分布在活性中心，这样会改变活性部位的结构而引起蛋白质活性的丧失，因此C正确；这两种氨基酸的侧链都没有可解离的基团，因此它们的更换不会改变蛋白质的等电点，因此D不正确。
例4、已知血红蛋白含铁0.34%，血红蛋白的最小相对分子量是多少？
实验表明，血红蛋白的相对分子量为64500，实际上一个血红蛋白含几个铁原子？
解析：
血红蛋白的最小相对分子量=56（铁的原子量）÷0.34%≈16400
一个血红蛋白含铁原子=64500÷16400≈4
例5、氨基酸的定量分析表明牛血清蛋白含有0.58%的色氨酸（色氨酸的相对分子量为204）。
（1）试计算牛血清蛋白的最小分子量（假设第每个蛋白质分子只含有一个色氨酸）
（2）凝胶过滤测得的牛血清蛋白相对分子量为70000，该血清蛋白分子中含几个色氨酸分子？
解析：
（1）牛血清蛋白的最小分子量=204÷0.58%≈35200
（2）该血清蛋白分子中含色氨酸分子数=70000÷35200≈2
例6、有一个蛋白分子在pH7的水溶液中可以折叠成球状，通常是带极性侧链的氨基酸位于分子外部，带非极性侧链的氨基酸位于分子内部。
请解析：
（1）在Val、Pro、Phe、Asp、Lys、Ile、His中，哪些位于内部？
哪些位于分子外部？
（2）为什么在球状蛋白内部和外部都发现Gly和Ala？
（3）Ser、Thr、Asn、Gln都是极性氨基酸，为什么会在内部发现？
（4）在球状蛋白的分子内部和外部都能找到Cys，为什么？
解析：
（1）带有非极性侧链的氨基酸残基：
Val、Pro、Phe、Ile位于分子内部；带有极性侧链的氨基酸残基：
Asp、Lys、His位于分子外部。
（2）因Gly和Ala的侧链都比较小，疏水性和极性都小；Gly只有一个H与а-碳原子相连，Ala只有CH3与а-碳原子相连，故它们即可出现在分子内部，也可出现在分子外部。
（3）Ser、Thr、Asn、Gln都是极性氨基酸，但它们在pH7.0时含有不带电荷的极性侧链，参与分子内部的氢键形成，从而减少了它们的极性。
（4）在球状蛋白内部可见Cys，因其常常参与链内和链间的二硫键的形成，使其极性减少。
例7、Edman降解：
从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基序列的方法。
N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再以层析鉴定，余下的多肽链（少了一个残基）被回收再进行下一轮降解循环。
一个含13个氨基酸残基的多肽链，经Edman降解确定该肽链的氨基酸组成为：
Ala、Arg、2Asp、2Glu、3Gly、Leu、3Val。
部分水解后得到以下肽段：
（1）Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala
（2）Val-Asp-Val-Asp-Glu
（3）Val-Asp-Val
（4）Glu-Ala-Leu-Gly-Arg
（5）Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu
（6）Leu-Gly-Arg
问：
推测原始肽链的序列
解析：
思路是分析这六个片段中重叠部分，结合该肽链的氨基酸组成，可分析出该肽链的原始序列为：
Val-Asp-Val-Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg
例8、有一多肽，其分子式是C55H70O19N10，将其彻底水解后只得到下图中的四种氨基酸。
根据上面的条件回答问题：
问：
（1）该多肽是几肽？
（2）该多肽水解后，有几个谷氨酸？
（3）该多肽水解后，有几个苯丙氨酸？
几个丙氨酸？
几个甘氨酸？
解析：
（1）该多肽水解后产生氨基酸中，都含1个N原子。
除谷氨酸外，又各含2个氧原子，只有谷氨酸有4个氧原子。
它们的碳氢原子比最大的是苯丙氨酸，为9：
11。
又根据题中分子式可知该多肽分子共有10个N原子，因此该多肽为10肽。
（2）形成10肽时会脱去9个水分子，因此这个10肽彻底水解所得到的10个氨基酸的总和应是C55H70O19N10+9H2O，即C55H88O28N10，氧数折半后去氮数（28-10×2）/2=4（因为多了几个双氧，就有几个谷氨
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