微量元素对食用菌生长的影响.docx
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微量元素对食用菌生长的影响
（2008届）
毕业论文（设计）
题 目：
微量元素钙镁对食用菌生长的影响
学 院：
生物与化学工程学院
专 业：
生物工程
班 级：
生物041
学 号：
0
姓 名：
梅晓峰
指导教师：
朱长俊
教 务 处 制
2008 年 6 月 5 日
诚信声明
我声明，所呈交的论文（设计）是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究结果。
据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得＿＿＿＿＿＿或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。
我承诺，论文（设计）中的所有内容均真实、可信。
论文（设计）作者签名：
签名日期:
年月日
授权声明
学院有权保留送交论文（设计）的原件，允许论文（设计）被查阅和借阅，学校可以公布论文（设计）的全部或部分内容，可以影印、缩印或其他复制手段保存论文（设计），学校必须严格按照授权对论文（设计）进行处理，不得超越授权对论文（设计）进行任意处理。
论文（设计）作者签名：
签名日期:
年月日
摘要:
本实验主要研究微量元素钙、镁对平菇菌丝生长的影响。
在PDA培养基中分别加入不同浓度的硫酸镁和氯化钙，接种培养并通过过测量菌丝圈直径的办法观察菌丝的生长速度，挑选出生长最快的两组进行液体发酵。
利用等离子体光谱仪测定菌丝中富集的钙元素和镁元素的含量。
实验数据表明Mg2+浓度为3.5g/L时，平菇菌丝体的生长状况最好，富集量达到6187.2mg/kg。
另一组Ca2+浓度为2.5g/L时，平菇菌丝体的生长最好、最浓密，富集量达到57421.2mg/kg。
关键词:
食用菌；富钙；富镁
Abstract:
TheinfluenceofCaandMgonthemushroom’smassproductionwasresearchedemphaticallyinthispaper.WeaddMgSO4、CaCl2withdifferentconcentrationintothePDAculturemedium.Thenmeasurethegrowthspeedofthecapfungusbyobservingthediameterofthemyceliumcycle.Pickouttwogroupswhichgrowfasterthanothers,theninoculateinliquidculture.AtlastwewillmeasurethecontentofMgandCainthecapfungusbyICP-AES.Fromtheresearch,wecandrawtheconclusionthatMg2+intheconcentrationof3.5g/Lcanacceleratethegrowthspeedofcapfungusandthehighestcontentcanreach6187.2mg/kg.WhileCa2+intheconcentrationof2.5g/Lcanacceleratethegrowthspeedofcapfungusandthehighestcontentcanreach57421.2mg/kg.
Keywords:
Mushroom;Ca2+enrichment;Mg2+enrichment;ICP-AES
摘要……………………………………………………………………………………………………（Ⅰ）
Abstract………………………………………………………………………………………………（Ⅱ）
1绪论………………………………………………………………………………………………
（1）
1.1选题的背景、意义…………………………………………………………………………
（1）
1.2食用菌富集微量元素的特点………………………………………………………………
（1）
1.3富集微量元素食用菌的生理功能…………………………………………………………
（2）
1.4生产富集微量元素食用菌的方法………………………………………………………
（2）
1.5研究动态及前景……………………………………………………………………………（4）
2实验部分…………………………………………………………………………………………（5）
2.1实验流程……………………………………………………………………………………（5）
2.2分析方法……………………………………………………………………………………（5）
2.3实验内容……………………………………………………………………………………（6）
3结果与分析………………………………………………………………………………………（9）
3.1菌种培养过程中平菇菌丝体的生长状况………………………………………………（9）
3.2钙离子、镁离子对平菇菌丝生长的影响………………………………………………（11）
3.3平菇菌丝体的富离子液体培养…………………………………………………………（13）
3.4平菇菌丝中钙、镁离子含量的测定………………………………………………………（14）
4结论……………………………………………………………………………………………（16）
致谢………………………………………………………………………………………………（17）
参考文献…………………………………………………………………………………………（18）
1绪论
1.1选题的背景、意义
食用菌是一种既营养又美味的食品，食用菌中含有丰富的蛋白质、无机元素及维生素，特别是各类的微量元素对人体的生长和发育有着不可忽视的影响，而且食用菌还具有保健功能，或许不久的将来食用菌保健品将走进我们的生活。
食用菌已被联合国列入二十一世纪的健康食品。
作为绿色食品，食用菌已越来越受人们的喜爱，并成为日常生活中不可缺少的一种食物。
微量元素是人和动物必需的营养素，也是某些强化食品的重要组成部分。
它对提高人体免疫机能、预防某些疾病的发生有着重要的作用。
然而，根据中国营养学会发表的资料表明：
在我国，人体必需的微量元素Zn、Fe、I、Ca等元素缺乏较多，长期摄入量不足，必将耗尽体内的储存，导致机体内微量元素失衡。
自然界中的微量元素多以无机盐形式存在，不利于人体吸收利用，甚至有时有毒副作用。
因此，寻找一条能获得有机态微量元素成本又低廉的途径，对改善人类微量元素缺乏的现状具有重要意义。
食用菌是人类的第二大类蔬菜，又是医药保健工业的重要原料，以它为载体富集人体所必需的微量元素，是一条切实可行的方法。
1.2食用菌富集微量元素的特点
1.2.1食用菌的栽培规模食用菌在世界各国均有广泛栽培，在我国几乎各省市均有大规模的栽培，有的省市还有特色菇的栽培历史，且有成熟的生产栽培、管理技术，及部分深加工产品。
大批菇农掌握了先进的栽培技术，专业技术队伍与菇农技术改造相结合更进一步推动了食用菌的科学化栽培，使规模化、工厂化生产逐渐成为主流。
1.2.2生产成本低，技术易掌握利用现代发酵技术，采用富集含量高的菌株，可降低成本，且富集力和耐受力强，低浓度的微量元素对食用菌的生长呈现有利趋势。
1.2.3富集微量元素的种类和含量可控性例如：
曹素芳等通过平菇母种、原种、栽培种加硒驯化，栽培时加入不同量的硒，推出了含硒量为10-20mg／Kg和50-60mg／Kg的两种富硒平菇。
其中前者可作为保健食品，日常鲜食100g可补足成人对硒的日需量；而后者可作为治癌的富硒药物研究应用。
1.2.4食用菌富集的有机态微量元索易于吸收性无机态的微量元素在人体内由于与脂肪、蛋白质、草酸、氧化物、维生素等的反应，以及与其他磷酸盐、植酸盐的相互作用的影响，生物利用率很低。
1.2.5食用菌富集的微量元素有机态具有良好的稳定性与安全性食用菌富集的微量元素有机态具有良好的稳定性，便于储存、运输、深加工,避免其中某些营养成分的损失，且食用菌本身安全无毒，富集微量元素后，只要所摄取的微量元素在限制范围内，亦对人体无毒副作用。
1.2.6食用方法简单多样性可直接食用鲜菌子实体，或鲜菇脱水处理制干菇储藏长期食用，或脱水处理后将食用菌磨碎作为食品添加剂，也可将其菌丝子实体的提取液制成各种饮料饮用。
1.3富集微量元素食用菌的生理功能
1.3.1食用菌中微量元素的存在形式许多研究认为，微量元素在食用菌内生物转化极高，大部分以有机态存在，多与菌体内的蛋白质、氨基酸、多糖等结合。
草菇富锌研究发现子实体中的锌较少与蛋白质结合，较多与可溶性糖和游离氨基酸结合或呈游离状态存在。
硒在金针菇菌体内的有机化程度达75％以上，其中分布在硒蛋白占64.1％，硒多糖占11.2％。
目前，由于分析技术及提取手段的限制，关于微量元素参与菌丝体内的代谢途径及存在方式尚不能作出完美的解释，需做进一步研究。
1.3.2生理功能微量元素在食用菌内生物转化的过程中，参与了食用菌体内酶的转化，影响了其部分代谢，促进了体内蛋白质、氨基酸、多糖的合成，从而表现出富集微量元素的食用菌比正常食用菌的脂肪、总糖及蛋白质含量均有增高。
从某种意义上说，富集微量元素的食用菌营养更高，它既体现了食用菌的保健作用,又强化了微量元素的生物功能，可作为具有良好的营养和药用价值的食品使用。
王关林等用富硒灵芝为材料，对小鼠全血谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）活性、全血SOD活性、丙二醛（MDA）含量进行试验发现，与食用正常灵芝相比，富硒灵芝表现出了更好的生物效应，其菌体内的有机硒有效的协同灵芝的主要营养成分，如灵芝多糖增加了机体的GSH—Px和SOD活性，增强了内源性氧自由基清除系统的功能，从而降低了体内MDA的含量。
1.4生产富集微量元素食用菌的方法
生产富集微量元素食用菌只需在目前生产上常用培养基中加入适量浓度的微量元素溶液进行常规方法处理即可。
有的食用菌需要进行母种、原种、栽培种驯化，有的液体深层培养方法更方便,需要在实践中总结。
1.4.1培养基基础培养基利用现在生产上常用培养基。
如母种：
PDA或改良PDA。
栽培种：
木屑或棉子壳等。
1.4.2微量元素液的配制可先制成母液，再依适宜浓度稀释成加入液。
Ca：
CaCl2用蒸馏水溶解，调pH中性；Mg:
MgSO4，用蒸馏水溶解，调pH中性。
1.4.3加入微量元素液的浓度一般低浓度的微量元素液对菌丝体及子实体生长有促进作用,还可使食用菌内蛋白质、氨基酸、多糖含量有所增加。
而过高的浓度则抑制菌丝体生长。
延迟出菇,降低产量，造成经济损失。
不同菌种、不同品种要求的适宜浓度不同，需要生产者在实践中摸索。
科学上，适宜的加入浓度要考虑施入量、富集率、回收率、产量及经济成本和用途等综合作用因素，尽量做到低投入、高产出。
如果是食用补充缺乏的微量元素，食用菌子实体的富集量可小一些。
而药用免疫的食用菌及其加工产品需要的富集浓度要稍高些。
1.4.4以富钙为例说明富集率、回收率的计算方法
菌丝体富集率=[（菌丝体干重*菌丝体含钙量）/培养液中加入钙量]*100％
子实体富集率=[每袋鲜菇重*（1一子实体含水量）*子实体含钙量/每袋培养料中加入的钙量]*100％
菌丝体钙回收率=（定量发酵液菌丝体含钙量/定量发酵液添加钙总量）*100％
子实体钙回收率=[（富钙菇测得钙一对照样含钙*1/10）/（培养基加钙量+培养基含钙量）]*100％
（注：
样品为干品，按鲜菇含水90％计）。
1.4.5常见种类富集微量元素的建议适宜浓度见表1。
据报道不同种类的耐受和富集微量元素的能力不同，不同品种间的差异不大。
生产中，应根据当地栽培的实际情况选择耐受和富集力强的种类。
而且有些种类需要母种驯化培养，否则子实体产量不能提高。
但是经母种驯化后，耐受力增强。
1.4.6微量元素液的加入方法，主要有喷洒、拌料、浸泡三种。
综合比较发现拌料优于其它两种，但在金针菇富碘的试验中发现喷洒的效果要好于拌料。
1.4.7栽培和管理栽培方法同普通菇类种植，液体培养比固体培养出菇早，且提取多糖更加方便。
通过锌对香菇的影响作用研究发现，同等浓度的锌对固体培养中的香菇菌丝生长有抑制作用，但对液体培养的香菇子实体产量及质量均有明显的促进作用，在金针菇上则作用不明显。
表1常见食用菌加入微量元素的适宜浓度（mg/kg）
元素
种类
抑制浓度
适宜浓度
备注
硒
金针菇
灵芝
猴头菌
平菇
灰树花
香菇
--
1500
300
1000
>100
80
20
100～500
<300
200
50
60
--
--
不同采集期的富集量有差异
--
--
--
锌
草菇
平菇
平菇母种
金针菇
4350
400
--
1000
800
29～47
400
200
800
400
培养料浓度低时，与富集量相关
不同品种不同
培养料
平板培养基
锗
灵芝
香菇
金针菇
紫孢侧耳
1100
1000
800
1050
<1000
500
600
210
钙
平菇
--
0.6%
在发酵液中加入
碘
金针菇
>50
>50
>50
300～500
100～200
200～300
菌丝体液体培养
子实体拌料加入
喷洒
1.5研究动态及前景
利用食用菌为介质获得有机态微量元素的研究已取得了一定的成果，这为发展新型保健食品提供了一条有效途径。
随着天然、营养、健康食品在全世界的兴起，以及科学技术的发展，用食用菌富集微量元素的研究必将会有更光明的前景。
但是，尽管当前研究所用的菌种、基质丰富多样，富集的微量元素种类繁多、含量较高、培养方式多样，结果却基本都停留于实验室或小试阶段，应用方面研究较少，机理、有机态形式、生理功能的认识也不全面。
对作用机理进行深入研究，完善栽培工艺，使科研成果与生产紧密结合，从而达到工业化生产、工业化应用是目前亟待解决的问题，它需要科研工作者和生产者的共同努力。
总之，用食用菌富集人和动物体所需微量元素的研究在未来的发展潜力很大，前景也是美好的。
2实验部分
2.1实验流程
本课题采用含不同浓度Ca2+、Mg2+的离子液，加入食用菌平板培养基，考察不同浓度的Ca2+、Mg2+离子对菌丝生长的影响，并确定最佳离子浓度后，配制该浓度的液体培养基，接入菌种进行摇床培养，获得菌丝后用等离子光谱法测其中富集的Ca2+、Mg2+离子的含量。
实验流程如图2-1：
菌种
↓
菌种活化
↓
平板实验，测定菌丝生长速度
↓
确定最佳离子浓度
↓
液体摇瓶培养
↓
获得湿菌丝体
↓
抽滤干燥，获得干菌丝体
↓
获得菌丝体中富集离子浓度
图2-1实验流程示意图
2.2分析方法
观察并记录菌丝生长速度、长势和菌丝外观状况，求出日平均生长的速度值。
收集最佳浓度下液体培养得到的菌丝，烘干后称得干重。
标准曲线的绘制：
在仪器推荐的浓度范围内，制备含待测元素的标准溶液至少3个点，浓度依次递增，并分别加入待测样品溶液配制中的相应试剂。
按各品种项下的规定制备待测样品溶液，使待测元素的估计浓度在标准曲线浓度范围内。
元素含量用等离子体-原子发射光谱法测定。
等离子体-原子发射光谱法具有基体干扰少，线性范围宽，可以进行多元素同时检测的优点，目前已广泛应用于金属、矿产品中的元素分析。
其工作原理为：
1把试样配成溶液。
2以一定流量进入ICP光谱仪，在矩管处气化，生成等离子体。
此时，各元素粒子中的电子处于跃迁状态。
3等离子体中各元素粒子中的电子开始从跃迁状态回到基态，发射出谱线。
4根据谱线的波长，定性判断元素的种类。
根据谱线的强度与标样中谱线的长度对比，定量判断某种元素的含量。
2.3实验内容
2.3.1实验器材
试剂及菌种：
MgSO4·7H2O、无水氯化钙、土豆500g、葡糖糖50g、琼脂40g、蒸馏水、菌种为市售新鲜平菇分离获得。
仪器：
SX2-4-10型箱型电阻炉（嘉兴恒泰电热设备有限公司），SHP-150型生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司），DGX-9143B-1型电热恒温鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司），FA1004型电子分析天平（上海良平仪器仪表有限公司），Cl-100型双层铁皮电炉（浙江嘉兴凤桥电热器厂），2D-8802B双层大容量摇床，710ES全谱直读电感耦合等离子体发射光谱仪（澳大利亚Varian公司），SA-300VF自动高压灭菌锅，电子天平，500ml、100ml、50ml烧杯各一个，1000mL烧杯2个，接种环，纱布，漏斗，电炉，铝锅，玻璃棒，25支100ml试管，标签纸，铁架台，棉花，酒精灯，牛皮纸，高压锅，石棉网，移液管1、2、5、10、20ml各1支，量筒50、100ml各一个。
2.3.2实验步骤
菌种的活化：
培养基就是根据食用菌生长发育的需要，用人工的方法配制的来适合食用菌生长繁殖或积累代谢产物的营养的物质，也叫基质，或称底物。
PDA培养基的配制：
土豆洗净，去皮，挖去芽眼，切成蚕豆块大小，称取200g。
将200g土豆块放在500ml水中煮30分钟，用4-6层纱布过滤去土豆渣而取土豆汁。
将土豆汁加水到1000ml再放进20g琼脂继续加热融化。
最后加入20g葡萄糖，即为PDA培养基。
培养基处理：
用漏斗和4—6层纱布过滤PDA培养基并分装试管中，每支试管的装量占试管容积的1/5—1/4为宜（分装时，不要让培养基沾到管口上）分装好的试管，再做一个棉花塞塞住管口，再立即将试管包扎成捆，棉塞部分用牛皮纸包好。
灭菌：
将成捆的试管放入手提式高压锅内，进行高压湿热灭菌30min，待压力磅指针回复到零位时，打开高压锅盖，待锅内温度下降到60-70℃取出。
斜面培养基：
选一水平的桌面，先在桌上放一木棒，将捆扎的试管打开，逐一斜放，培养基便倾斜成三角斜面。
（斜面长度占试管总长的1/2左右，原则是不能使培养基沾到棉塞的）
接种：
将接种环在酒精灯火焰上烧红以达到灭菌效果。
将装有菌种的试管口在火焰上微烧一周（将管口上可能沾染的少量或带菌尘埃烧掉）将烧过的接种唤伸入菌种管内，先触及没有长菌的培养基使环冷却。
轻轻挑取少许菌种，将接种环抽出管外迅速伸入已制备好的斜面培养基试管内。
抽出接种环，将试管塞上棉塞并插在试管架上。
再次烧红接种环，接种完毕。
活化：
1接种完毕的培养基放入恒温箱中进行活化，温度在25℃。
2观察菌丝的生长情况，待培养基上长满菌丝时进行下一歨的培养。
菌种扩大：
制备PDA平板培养基，用接种针从长满菌丝的试管中勾取一小块菌丝，接入平板中进行扩大培养。
待培养基上长满菌丝时进行下一步培养。
菌种的选育：
以PDA培养基为基本培养基，分别加入不同量的MgSO4·7H2O、无水CaCl2，配制成浓度（单位:
g/L）为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0共8个浓度梯度的培养基，高压灭菌30min，冷却后取出，在无菌工作室中倒平板，每个浓度设3个重复，再设一个空白对照组。
并在每只平板表面都贴上标签纸标记。
冷却凝固后在无菌室中用已灭菌的打孔器在培养好的培养皿培养基中打孔，为了能得到相同的菌种，然后接到含不同浓度离子培养基中。
置于28℃恒温生化培养箱中培养，观察并记录菌丝的生长速度、生长势和菌丝外观状况，求出日平均生长的速度值。
优良菌种液体培养：
选出平板中生长速度最快的两组，以该离子浓度浓度配制液体培养基，分别装于150ml三角瓶中。
在无菌室中用已灭菌的打孔器在培养好的含离子的固体培养基中打孔，将所得菌片接入三角瓶中，每组三个重复，室温、90r/min摇床培养10d，并观察菌丝生长状态。
抽滤干燥：
将已经长满三角瓶的菌丝球真空抽滤，置于恒温干燥箱70℃下干燥，干燥所得即是样品。
将样品在研钵中研磨成粉末，装于干净表面皿中标记后待用。
样品处理：
准确称取样品0.3g于瓷坩埚中，放入马弗炉中，先在200℃温度下炭化2h，然后升温至350℃预灰化1h，最后在500℃条件下灰化至灰白色。
灰化后的样品加入10mLV（硝酸）+V（高氯酸）=3+1的溶液。
在电炉上加热至溶液变成无色透明，如有少许沉淀应冷却后及时过滤，转移到50mL容量瓶中定容，待测。
标准曲线绘制：
标准溶液为国家标准样品，其中Ca采用单元素标准溶液，标准值：
1000ug/mL；Mg采用多元素标准溶液，标准值：
100ug/mL。
定量稀释后浓度如表2-1，绘制标准曲线。
表2-1标准溶液的配制
标样号
Mg（mg/L）
Ca（mg/L）
标准样1
标准样2
标准样3
标准样4
标准样5
0.00000
0.50000
2.50000
5.00000
10.0000
0.00000
1.00000
5.00000
10.00000
20.0000
元素含量测定：
利用等离子体光谱仪测定待测液中各元素含量。
等离子体原子发射光谱仪具有基体干扰少，线性范围宽，可以进行多种元素同时检测的优点，目前已广泛用于石油、化工、环境、食品卫生、科学研究、新型材料等70多种金属元素的定性和定量分析，其检测限在ppb级以下，而且通过一次测定同时得到常量组份和痕量组份的分析结果，波长范围175-785nm，波长连续覆盖，完全无断点，等离子体输出功率为：
700-1700W。
3结果与分析
3.1菌种培养过程中平菇菌丝体的生长状况
本实验采用组织培养的方法接种，用经过灭菌的镊子小心夹取新鲜平菇子实体伞柄交界处的分生组织，快速接入已制备好的试管斜面培养基内。
如图3-1。
接种完毕后放入恒温箱中进行活化，温度大约在25℃，培养大约一周以后培养基上长满菌丝，如图3-2。
为进行下一步扩大培养提供已活化的菌种。
图3-1接好平菇菌种的试管图3-2长满斜面的平菇菌种
用接种针从长满菌丝的试管中勾取一小块菌种置于PDA培养皿中，在恒温培养箱中进行扩大培养，温度大约在30℃，培养6天后可长满培养皿，如图3-3。
作为下一步培养的菌种。
图3-3扩大培养后已长满的平菇菌种
以PDA培养基为基本培养基，分别加入不同量的MgSO4·7H2O、无水CaCl2，配制成浓度（单位:
g/L）为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0共8个浓度梯度的培养基，高压灭菌30min后，冷却取出，在无菌工作室中倒平板，每个浓度设3个重复，再设一个空白对照组，贴标签纸作标记。
待冷却凝固后在无菌工作台上用灭过菌的打孔器统一在各培养基中打孔（取得相同的菌种），然后接种到含不同浓度离子的培养基中。
置于生化培养箱中28℃恒温培养，观察并记录菌丝的生长速度、生长势和菌丝外观状况，求出日平均生长的速度值。
如图3-4，即为培养第4天测得的不同浓度Mg2+培养基的生长情况。
图3-4平菇菌种在含不同浓度离子的培养基中的生长状况
3.2钙离子、镁离子对
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