低浓度有机磷农药DDV对微囊藻生长的影响.docx

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低浓度有机磷农药DDV对微囊藻生长的影响

探讨有机磷和无机磷对微囊藻生长的影响

吴丽　（藻类工程和显微镜实验室/南京师范大学生命科学学院,江苏南京　）

本文主要以DDV和K2HPO4为例,研究了以有机磷或无机磷为磷源时,铜绿微囊藻的生长过程。

在实验室内利用BG-11（含磷量为5.4mg·L–1，磷源为K2HPO4）培养液培养,通过测定藻吸光值和叶绿素a含量,研究不同浓度下有机磷农药DDV和无机磷酸盐K2HPO4对群体M.aeruginosaXW01和单细胞M.aeruginosa7806生长的影响,探究2种藻对有机磷和无机磷利用差异与特点。

结果表明,DDV浓度在1.00mg·L–1时，其对群体微囊藻和单细胞微囊藻都有一定的促进作用。

相对于K2HPO4，DDV含磷较低的浓度下就能够促进微囊藻的生长。

当DDV浓度在1.00～1000.00mg·L–1浓度范围内，DDV对群体M.aeruginosaXW01的生长表现出低浓度刺激、高浓度抑制的效应,并且当DDV浓度在0.01～100.00mg·L–1质量浓度范围内,单细胞M.aeruginosa7806也出现此效应。

而对于有机磷K2HPO4来说，当其含磷量在0.011～11.00mg·L–1范围内时，无论是单细胞微囊藻还是多细胞微囊藻均表现出一定程度的低浓度刺激、高浓度抑制的效应，但不是很明显。

相较于有机磷农药DDV，无机磷酸盐K2HPO4在高浓度范围下不会对藻生长产生严重的抑制作用。

关键词:

有机磷；无机磷;群体微囊藻;单细胞微囊藻;碱性磷酸酶

　在我国大部分富营养化水体中,铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa）在数量和发生频率上均占优势[1—2],铜绿微囊藻死亡或细胞膜通透性增强时会向水中释放微囊藻毒素,对环境和人类健康造成危害.因此国内外研究者围绕铜绿微囊藻做了大量工作[3—5].关于造成湖泊富营养化的营养物质基础问题,一致的观点认为主要物质是氮和磷[6-8],其中磷的限制作用又大于氮[9—11].在自然状态下,水体中的磷以多种形态存在，其中以可溶性有机磷（DOP）和悬浮态磷为主,而生物可直接利用的可溶性无机磷的含量很低[12].因此微囊藻对水体中有机磷利用的问题引起笔者的注意。

水体中的有机磷主要来源于工厂废液，生活污水，以及农药的使用等。

而在众多的有机磷农药中，敌敌畏（Dichlorvos，DDVP），化学名O，O-二甲基-O（2，2-二氯）乙烯基磷酸酯，分子式为C4H7C12O4P，是一种高效、速效、广谱性的有机磷杀虫剂使用范围广，用量也比较大，在长期投入使用过程中，其对土壤与水体产生了不同程度的污染。

因此笔者选取DDV为对象来研究有机磷和无机磷为微囊藻生长的影响，其对研究微囊藻的暴发增殖和水华有积极意义。

   1材料与方法

1.1　实验材料

供试农药：

DDV80%乳油（所含磷的质量分数为11%）

供试试剂：

质量分数为8.088g·L–1K2HPO4（含磷量为1.1g·L–1）

供试藻类：

群体M.aeruginosaXW01和单细胞M.aeruginosa7806均取自南京师范大学生命科学学院藻类工程和显微镜室。

1.2试验方法

1.2.1缺磷培养基的配置：

实验所用的培养基是BG-11，其中含有大量的磷元素（约0.54g/l-1）。

在做无磷对照时，需要把BG-11中的K2HPO4抽去，其它的元素仍按照原来的含量补上去。

1.2.1藻的预培养

藻的预先培养在无菌条件下,将群体M.aeruginosaXW01和单细胞M.aeruginosa7806转移至BG-11培养液中,培养至对数生长期,如此反复转接3次后取对数生长期的微囊藻作为测试材料。

培养条件:

温度25℃,光照度为2500～5000lx,光照时间24h。

1.2.2DDV对蓝藻生长的影响实验

先将DDV和K2HPO4用BG-11稀释到实验需要的不同质量浓度（如下表），通过预实验对实验浓度的摸索，对群体M.aeruginosaXW01和对单细胞M.aeruginosa7806设置浓度如下表所示:

名称

不同DDV的浓度（mg·L–1）

M.aeruginosaXW01

0

1

5

10

30

50

100

1000

M.aeruginosa7806

0

0.01

1

5

10

50

100

----

表一：

DDV不同稀释浓度

名称

不同K2HPO4的浓度（mg·L–1）

M.aeruginosaXW01

0

0.011

0.11

0.55

1.1

5.5

11

M.aeruginosa7806

0

0.011

0.11

0.55

1.1

5.5

11

表二：

K2HPO4不同稀释浓度

然后在无菌条件下，将处于对数生长期的藻（4ml）接入装有40ml不同质量浓度DDV和K2HPO4培养液的100ml锥形瓶中。

处理组加不同质量浓度DDV和K2HPO4，对照组不加DDV和K2HPO4,每个处理设3个平行。

静置培养,每天定时摇2次。

连续记录7d测定650nm处光吸收值，5d以后用丙酮法测两种藻的叶绿素a含量。

1.3藻生长量的测定方法

1.3.1　叶绿素a含量的测定

采用丙酮法提取叶绿素a，通过分光光度法测定，分别测量藻液在663nm和645nm处的吸光度。

1.3.2吸光值的测定

将群体微囊藻群体M.aeruginosaXW01和单细胞M.aeruginosa7806在400～800nm范围内进行全光谱扫描,发现在650nm处有最大吸收。

接种当天测定藻液在650nm处的吸光度,然后每隔24h测定一次，每天定时测量群体M.aeruginosaXW01和单细胞M.aeruginosa7806的吸光值，连续测7天。

1.4碱性磷酸酶的测定方法

1.4.1碱性磷酸酶测定原理：

本实验采用的是磷酸苯二钠比色法测定碱性磷酸酶，测胞内胞外碱性磷酸酶，其中要释放胞内碱性磷酸酶，还要经过超声波破碎细胞，最后通过分光光度法测定，测酶液在510nm的吸光度。

1.4.2碱性磷酸酶含量的计算：

本100ml藻液在37℃与底物作用15min，产生1mg酚为1个金氏单位。

公式：

Y=0.0093X+0.0127（X：

含酶量Y：

吸光光度值）最终计算出每毫克叶绿素中含碱性磷酸酶的量。

【参考范围】

2结果与分析

2.1　不同浓度DDV对2种藻生长的影响

图1：

不同浓度DDV对群体M.aeruginosaXW01生长的影响

图2：

不同浓度DDV对单细胞M.aeruginosa7806生长的影响

通过图1和图2，我们对群体M.aeruginosaXW01和单细胞M.aeruginosa7806对不同浓度DDV的敏感性进行比较，结果发现：

DDV浓度在1.00mg·L–1时，其对群体微囊藻和单细胞微囊藻都有一定的促进作用，并且在一定的DDV浓度范围内，两种形态的微囊藻都表现出低浓度促进，高浓度抑制的效应。

但群体M.aeruginosaXW01对DDV浓度反应的灵敏度不如处于单细胞状态的M.aeruginosa7806迅速。

DDV浓度为10.00mg·L–1时就对单细胞M.aeruginosa7806起一定的抑制作用。

当DDV的浓度在100.00mg·L–1时，单细胞M.aeruginosa7806生长受到显著抑制，其对群体M.aeruginosaXW01的抑制作用相对于M.aeruginosa7806则弱很多，群体M.aeruginosaXW01生长状态良好，而绝大多数单细胞微囊藻已经死亡。

这可能是因为微囊藻以群体的形式存在能够增强对外界不良因素的抵抗能力，提高其适应能力和生存能力。

2.2不同浓DDV对2种藻叶绿素a含量的影响

绿素a是反映藻生物量的另一个指标。

图3、图4分别表示不同浓度的DDV对群体M.aeruginosaXW01和单细胞M.aeruginosa7806叶绿素a含量的影响。

图3：

不同浓度DDV对群体M.aeruginosaXW01叶绿素a含量的影响

图4：

不同浓度DDV对单细胞M.aeruginosa7806叶绿素a含量的影响

图3表明不同浓度DDV对群体M.aeruginosaXW01叶绿素a含量的影响不同。

叶绿素a含量在0.00mg·L–1和1.00mg·L–1两个浓度之间变化不明显，当浓度浓度在5.00mg·L–1时，其叶绿素的含量稍微大于对照，叶绿素的变化与藻细胞密度的变化是一致的。

当浓度继续增大，DDV浓度在10.00～50.00mg·L–1范围内时，对群体M.aeruginosaXW01的生长有不同程度的抑制作用，总体来说，随着浓度的增大，叶绿素逐渐减少，这种趋势在图5群体微囊藻的生长曲线上也有所反映，随着浓度继续增大，抑制作用越来越明显。

当DDV浓度达到1000.00mg·L时，如图所示，这时的叶绿素的含量相对于对照极其微少，说明此时DDV的浓度对叶绿素a起显著的抑制效应。

图4总体看来，DDV浓度在0～10.00mg·L–1范围内叶绿素含量差距不大，大体与群体微囊藻密度的变化一致。

当浓度在100.00mg·L–1时，相对于对照，绿素a的含量明显减少。

这点在图6上也有突出反映。

说明浓度DDV在100.00mg·L–1或高于这个浓度时，单细胞微囊藻的生长收受到显著抑制。

2.3不同浓K2HPO4对2种藻生长的影响

图5：

不同浓度外加K2HPO4对群体M.aeruginosaXW01生长的影响

图6：

不同浓度外加K2HPO4对单细胞M.aeruginosa7806生长的影响图五显示当外加K2HPO4含磷量为1.1mg·L–1时，其对群体M.aeruginosaXW01生长有一定的促进作用，但不是很明显，而DDV对群体微囊藻和单细胞微囊藻都有一定的促进作用浓度在1.00mg·L–1，含磷量为0.11mg·L–1，从有机磷和无机磷对微囊藻生长促进作用的对比，我们看出的有机磷农药在含磷量较低的情况下，就能在一定程度上刺进微囊藻的生长。

外加K2HPO4含磷量在0～11.00mg·L–1的范围内，群体微囊藻表现出一定的低浓度促进，高浓度抑制的效应，但效果不是很明显。

图六从整体上看，各个浓度对应的生长曲线分布集中，说明外加K2HPO4含磷量在0～11.00mg·L–1的范围内对微囊藻生长不会有太大的影响。

2.4不同浓K2HPO4对2种藻叶绿素a含量的影响

图7：

不同浓度外加K2HPO4对群体M.aeruginosaXW01叶绿素a的影响

图8：

不同浓度外加K2HPO4对单细胞M.aeruginosa7806叶绿素a的影响

图7和图8表示的是不同浓度外加K2HPO4对群体和单细胞微囊藻叶绿素的影响。

有图7可以看当外加K2HPO4含磷量在1.1mg·L–1，群体M.aeruginosaXW01叶绿素a含量最高。

叶绿素a也是生物量的一个重要指标，反映了藻生长状况，说明在此浓度下外加K2HPO4对群体微囊藻生长有一定促进作用，这与图5生长曲线反应的状况是一致的。

图8显示外加K2HPO4含磷量在时0.011、0.055、11.00mg·L–1时，单细胞微囊藻的叶绿素a含量相对对照高些，但总体上各个浓度间的叶绿素a含量差异不是很大。

2.5有机磷和无机磷对微囊藻生长影响比较

通过对DDV和K2HPO4对微囊藻生长的影响比较，我们得出当DDV浓度在1.00mg·L–1（含磷量0.11mg·L），外加K2HPO4磷浓度为1.1mg·L–1时，其对群体微囊藻和单细胞微囊藻都有一定的促进作用。

相对于K2HPO4，DDV含磷较低的浓度下就能够促进微囊藻的生长。

当DDV浓度在1.00～1000.00mg·L–1浓度范围内，DDV对群体M.aeruginosaXW01的生长表现出低浓度刺激、高浓度抑制的效应,并且当DDV浓度在0.01～100.00mg·L–1质量浓度范围内,单细胞M.aeruginosa7806也出现此效应。

而对于无机磷K2HPO4来说，当其含磷量在0.011～11.00mg·L–1范围内时，无论是单细胞微囊藻还是多细胞微囊藻均表现出一定程度的低浓度激刺、高浓度抑制的效应，但不是很明显。

相较于有机磷农药DDV，无机磷酸盐K2HPO4在高浓度范围下不会对藻生长产生严重的抑制作用。

本实验培养液磷是充足的，不会因缺磷而限制藻的生长。

当额外补充相同磷浓度的有机磷DDV和无机磷K2HPO4时，无论群体还是单细胞微囊藻对两种形态的磷都表现出低浓度激刺、高浓度抑制的效应。

同时结果也显示出有机磷DDV对微囊藻显示较明显刺激效应的浓度比无机磷K2HPO4要低。

有许多研究认为[15,17]低浓度有机磷农药能促进藻类的生长是因为藻类能利用有机磷农药作为其生长的磷源。

但本实验所用的培养基BG-11中并不缺磷，，由自身含有的K2HPO4提供，当额外补充相同磷浓度的有机磷DDV和无机磷K2HPO4时，DDV较明显地促进微囊藻生长的浓度比无机磷K2HPO4要低。

所以笔者以为有机磷农药在低浓度下能促进微囊藻的生长不太不该是因为有机磷分解提供磷所致。

更多是因为低浓度有机磷农药DDV促进了微囊藻对无机磷的吸收所致。

沈宏等人在有机磷农药对铜绿微囊藻生长及摄磷效应的动力学研究结果[13]一文中提出，当培养基中的无机正磷酸盐足够时,碱性磷酸酶的活性受到抑制,因此DOP（溶解有机磷）浓度的变化很小,此时藻类主要是利用溶解态无机正磷酸盐。

所以,从微囊藻摄磷的角度可以认为,培养基中加入低浓度的有机磷农药后促进藻类生长的主要原因不是因为藻类利用有机磷作为生长的磷源而加速生长,而是因为有机磷的加入促进了藻类对SRP的摄取,藻类对SRP的摄取速度越快,其生长速率也越快。

这表明,藻类的生长效应与藻类摄取SRP有直接关系。

一定浓度的有机磷和无机磷在促进藻类生长的过程中存在某种协同作用。

因此有机磷农药DDV相较于K2HPO4在较低的浓度下就能够促进微囊藻的生长。

3DDV对XW-01和7806碱性磷酸酶的影响

图九：

DDV对XW-01碱性磷酸酶的影响

上图表示的是有机磷农药DDV对M.aeruginosaXW01胞内和胞外碱性磷酸酶的影响。

通过图可以看出，加入DDV以后胞外碱性磷酸酶含量升高，当DDV为1mg·L–1碱性磷酸酶升高幅度最大。

相较于胞外碱性磷酸酶，胞内碱性磷酸酶也随着DDV浓度的增大有升高的趋势，图示DDV在10mg·L–1胞内碱性磷酸酶的含量达到最大。

碱性磷酸酶在有机磷和无机磷的转化过程中起着重要的作用，碱性磷酸酶含量升高也表明了藻体加快了对有机磷的利用。

图十：

DDV对7806碱性磷酸酶的影响

上图表示的是有机磷农药DDV对M.aeruginosa7806胞内和胞外碱性磷酸酶的影响。

通过图可以看出，当DDV为1mg·L–1，胞内碱性磷酸酶含量最大。

对照和DDV浓度10mg·L–1时胞内碱性磷酸酶含量相差不大。

当DDV浓度为1mg·L–1和10mg·L–1胞外碱性磷酸含量均比对照含量大。

图标总体表明，加入DDV后胞内和胞外碱性磷酸酶的含量增加，加快了有机磷和无机磷的转化。

3.1：

DDV对XW-01和7806碱性磷酸酶的影响比较

碱性磷酸酶作为湖泊水体中的一种重要的酶类，其在磷的生物地球化学循环过程中的作用，已为日益增多的实验所证实，作为一种诱导酶，当水体中的溶解性无机磷的浓度较低时，浮游植物、细菌体中的酶被诱导大量产生，通过酶的作用，水体中的有机磷化合物被水解，释放出无机磷。

通过以上两个图可以看出，加入DDV后，胞内和胞外碱性磷酸酶含量有了不同程度增长。

其中当DDV浓度在1.00mg·L–1时，胞外碱性磷酸酶含量是最大的。

其中7806在此浓度下的胞内碱性磷酸酶的含量也是最大的。

DDV浓度在1.00mg·L–1时，其对群体微囊藻和单细胞微囊藻生长有比较明显的促进作用，这点可以从藻的生长曲线看出。

上面的也显示，当DDV浓度在1.00mg·L–1碱性磷酸酶的含量相应的也有较大程度的增高。

DDV在10mg·L–1，XW-01胞内碱性磷酸酶的含量达到最大，7806在此浓度时胞外碱性磷酸含量均比对照含量大。

图标总体表明，加入DDV后胞内和胞外碱性磷酸酶的含量增加，加快了有机磷和无机磷的转化。

总结

本实验是以BG-11（含磷量为5.4mg·L–1）为培养基，配置培养基的试剂含有K2HPO4本，能够提供微囊藻正常生长所要的磷元素。

在此基础上，我们将DDV和K2HPO4用BG-11稀释到实验需要的不同质量浓度，外加了不同浓度的有机磷和无机磷。

结果表明，有机磷农药DDV含磷较低的浓度下就能够更好的促进微囊藻的生长。

有许多研究认为[15,17],低浓度有机磷农药能促进藻类的生长是因为藻类能利用有机磷农药作为其生长的磷源。

在通常情况下,SRP（溶解反应磷）是藻类优先利用的磷形态,但是当环境中的SRP（溶解反应磷）不足时,藻类会在酶的作用或借助外界环境条件增加对溶解态有机磷的利用。

但从沈宏等人在有机磷农药对铜绿微囊藻生长及摄磷效应的动力学研究结果来看这种作用是非常有限的[13]。

他的实验还表明，当培养基中的无机正磷酸盐足够时,碱性磷酸酶的活性受到抑制,因此DOP（溶解有机磷）浓度的变化很小,此时藻类主要是利用溶解态无机正磷酸盐。

所以,从微囊藻摄磷的角度可以认为,培养基中加入低浓度的有机磷农药后促进藻类生长的主要原因不是因为藻类利用有机磷作为生长的磷源而加速生长,而是因为有机磷的加入促进了藻类对SRP的摄取,藻类对SRP的摄取速度越快,其生长速率也越快。

这表明,藻类的生长效应与藻类摄取SRP有直接关系。

一定浓度的有机磷和无机磷在促进藻类生长的过程中存在某种协同作用。

另外,有研究表明,溶解有机碳（DOC）对藻类的生长有特殊的促进作用,可能有机磷在转换成无机磷的同时还能提供额外的碳源而促进微囊藻的生长,其作用机制有待进一步研究。

本文是在实验室培养基体系中研究有机磷农药和无机磷对微囊藻生长的影响,其中各种营养盐处于理想状态,总磷浓度远远大于富营化湖泊中的总磷浓度,因此在天然湖泊中,有机磷对微囊藻的生长影响以及微囊藻摄取磷形态的动力学规律与培养基中的作用机制有所不同,关于这方面的工作将在今后报道。

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