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荧光蛋白绚丽多彩的故事

荧光蛋白—“绚丽多彩”的故事

目录

荧光蛋白—“绚丽多彩”的故事0

摘要1

关键词1

Abstract1

Keywords2

第一章荧光蛋白的发现及发展2

1.1生物发光现象与维多利亚多管发光水母2

1.2绿色荧光蛋白（GFP）的发现3

1.3荧光蛋白的发展4

第二章绿色荧光蛋白的结构及其发光机理5

2.1绿色荧光蛋白的结构5

2.2生色团的形成机理7

2.3GFP的发光机理9

第三章各类颜色荧光蛋白简介10

3.1蓝色（BFP）和蓝绿色（CFP）荧光蛋白10

3.2绿色荧光蛋白（GFP）12

3.3黄色荧光蛋白（YFP）12

3.4橙色荧光蛋白（OFP）13

3.5红色荧光蛋白（RFP）13

第四章荧光蛋白的应用（以GFP为例）14

4.1利用GFP的定位作用研究生命体内的各种过程14

4.2利用荧光蛋白检测基因表达水平14

4.3利用GFP良好的融合性来标记蛋白质15

4.4利用GFP基因进行杀虫剂效果的评估15

4.5利用GFP跟踪目的基因15

4.6GFP做生物传感器15

4.7GFP在免疫上的应用16

第五章结束语16

参考文献17

摘要绿色荧光蛋白（GFP）是几十年前在水母体内发现的,它可以在蓝光或者紫外光的激发下发射绿色荧光。

由于它稳定的结构和光物理性质，又易于在细胞内表达，近几年来已经作为标记物质广泛的应用在生命科学的领域。

绿色荧光蛋白的出现及其广泛的应用引起了荧光蛋白的迅猛发展。

通过对绿色荧光蛋白氨基酸序列的改造,现在已相继有其他颜色的荧光蛋白出现。

当前荧光蛋白的进展方向主要是如何更好的改变蓝色到黄色范围内的荧光蛋白的光学性质,这些不同颜色的荧光蛋白都是绿色荧光蛋白的变异体；以及如何从有机体中得到发射橙黄到远红外颜色光的荧光蛋白,近期科学家们通过努力,已经从水母身上得到了新的得到改进的BFP、CFP、GFP、YFP变异的单分子荧光蛋白。

光激活的荧光蛋白现在已成为一种强有力的探针，广泛应用于探究细胞内的动力学过程，并且也促进了超分辨率显微镜的发展。

关键词荧光蛋白光激发变异光转化光交换光稳定性活细胞成像

AbstractGreenfluorescentprotein（GFP）wasdiscoveredmanyyearsagofromAequoreaVictoria.ItcanemitgreenlightunderexcitationofblueUVirradiation.GFPasamakerforgeneexpressionandlocalizationofgeneproductshasbeenwidelyusedinlifesciencesforthepastyearsbecauseitsstablestructureandphotophysicalpropertyandeasyexpressionincells.Theemergenceofgreenfluorescentproteinanditswidespreadapplicationhascausedtherapiddevelopmentoffluorescentprotein.Intherecentyears,scientisthasfindmanyotherfluorescentproteinswhichcanemitlightofdifferentcolorsbyimprovetheaminoacidsequence.Courrentfluorescentproteindevelopmentstrategiesarefocusedonfine-turningthephotophysicalpropertiesofbluetoyellowvariantsderivedfromtheAequoreaVictoriajellyfishgreenfluorescentproteinandonthedevelopmentofmonomericFPsfromotherorganismsthatemitintheyellow-orangetofar-redregionsofvisiblelightspectrum.ThelatesteffortsinjellyfishvariantshavevatresultedinnewandimprovedmonomericBFP,CFP,GFPandYFPvariants.PhotoactivatableFPsareemergingasapowerfulclassofprobesforintracellulardynamicsandunexpectedly,asusefultoolsforthedevelopmentofsuperresolutionmicroscopyapplications.

KeywordsFluorescentproteinPhotoactivationMutagenesisPhotoconversionPhotoswitchingPhotosabilityLive-cellimaging

第一章荧光蛋白的发现及发展

1.1生物发光现象与维多利亚多管发光水母

生物体的发光现象是指有机生命体通过体内的化学反应发出有色可见光的现象。

生物体发光一般有三个作用：

自身防御、攻击、信息交流。

植物界有细菌植物门的发光细菌和真菌植物门的发光蘑菇，动物界从原生动物到脊椎动物都有，脊椎动物中主要是鱼类。

从发光生物的分布来看,海产多，陆地上见得最多的就是萤火虫。

深海中太阳照射不到，一片黑暗，自身发光是彼此传递信息的唯一来源。

深海中缺乏海洋植物，无海藻可食用，只能是大鱼吃小鱼或者说弱肉强食。

因此自身发光的作用就显得尤为重要。

1885-1887年，Dubios首先从磕头虫和蛤中发现了热稳定的荧光素和对热不稳定的荧光素酶。

荧光素是一种小分子有机化合物，生物发光过程就是荧光素在荧光酶存在的条件下被氧化成处于激发态的氧化荧光素，激发态回到基态时就发出光和得到氧化荧光素。

不同发光生物有不同的荧光素和荧光素酶。

生物发光是将化学能转化为光能，可以认为是一种化学发光。

路产和淡水产的发黄绿-橙黄色光，海产的一般发蓝光，由于蓝色光比其他颜色传播得更远，在水中容易被感知，因此海洋生物一般都发蓝光。

在海洋生物中，腔肠动物中的软体珊瑚虫海肾（或称海三色紫罗兰）以及水母纲的维多利亚多管水母的研究报道比较多。

1.2绿色荧光蛋白（GFP）的发现

1955年，有报道第一次指出用紫外光照射多管水母，它可以发出绿光。

1962年，Shimomura第一次从太平洋维多利亚管水母中得到了GFP。

为了说明绿色荧光蛋白，他们做了如下的注解：

“aproteingivingsolutionsthatlookslightlygreenishinsunlightthroughonlyyellowishundertungstenlights,andexhibitingaverybright,greenishfluorescenceintheultravioletofaMineralite,hasalsobeenisolatedfromsqueezates.”Shimomura用木瓜蛋白酶处理热变性的GFP分离得到了包含发色团的肽片段。

通过合成小模式的化合物并把它们和绿色荧光蛋白的发色团相比较，Shimomura在1979年预测了GFP发色团的结构，如下图所示：

图二

后来的研究证实了绿色荧光蛋白的发色团的结构，发色团包含的肽片段是一个环状的六肽，是GFP残基Phe64-Ser-Tyr-Gly-Val-Gln69形成的。

1992年，野生类型的GFP的氨基酸序列被测定出来，如下图所示。

1994年，GFP第一次被成功表达出来，产生的蛋白质发出绿色荧光，并且证实了发色团是通过分子内催化环化形成的。

图三

1.3荧光蛋白的发展

绿色荧光蛋白的发现引起了荧光蛋白的飞速发展，造就了一场生命科学界的革命，除了荧光蛋白的各种吸收峰、发射峰、荧光蛋白的结构、氨基酸序列等等已经陆续被测定出来外，一个具有重大意义的进步就是通过基因将荧光蛋白在各种有机生命体内表达出来，科学家们通过对荧光蛋白氨基酸序列的测定，合成了相应的核苷酸片段，由于荧光蛋白的表达基本不需要外来物质，并且荧光蛋白具有很好的稳定性和对生命体的无毒害性，因此，荧光蛋白可以在各种有机生命体内得到很好地表达，从开始的荧光大肠杆菌到现在的荧光兔子等，荧光蛋白已经实现了跨越式的发展。

从原来的绿色荧光蛋白到现在的蓝色、蓝绿色、黄色荧光蛋白，通过对氨基酸序列的改造，人们已经成功合成了绿色荧光蛋白各种变异体。

如今的荧光蛋白已经成为了生物医学上的一种强有力的研究方法，广泛的应用于探究生命体内的各种过程，比如荧光探针、荧光蛋白成像技术等等。

当然，荧光蛋白也有很多地方仍是人类的未解之谜，其中值得一提的就是橙色到红色光谱区的荧光蛋白的合成曾一度成为一个难题，直到一个偶然的机会，人们从一种没有生物发光现象的生命体—造礁珊瑚体内发现了红色荧光蛋白，这一发现引起了生命科学界的又一场革命，各种关于GFP变异体的问题铺天盖地，目前科学家们已经在这些方面取得了很大的进步。

总之，虽然仍有一些光谱区域的荧光蛋白未实现，但通过努力，这些问题一定会得到解决，荧光蛋白将会有更大的应用。

第二章绿色荧光蛋白的结构及其发光机理

2.1绿色荧光蛋白的结构

TheProteinDataBank曾经列出了22种GFP和GFP衍生物的晶体结构，包括两个GFP类似物，如下表所示：

虽然许多荧光蛋白的衍生物有不同的光谱性质，但它们在结构上有着显著的相似性。

虽然GFP和后来发现的一些荧光蛋白的变异体在做晶体测量时都形成了二聚体，但是单分子荧光蛋白的结构还是被解决了，事实上，荧光蛋白不一定形成二聚体，二聚体的形成主要是靠晶体生长环境来控制的。

绿色荧光蛋白分子是一个具有11个β-片状结构所围成的桶装结构。

其结构如图四所示。

直径大约24Å,高度大42Å。

β-片状结构形成了桶的外壁,一个α螺旋片段斜穿过桶的内部，发色团连在α螺旋片段上。

一个不规测的α螺旋片段作为一个支架可以提供给发色团,使其坐落在圆筒的中心。

β-片状的链彼此牢牢地固定,像支撑桶的棒。

结构形成一个密集体,没有开口。

这种折叠的模式是β-片状在外,α螺旋在内,是一种新的蛋白类型,命名为β-片状罐。

图五给出了GFP折叠的布局。

从C2末端除去多于7个的氨基酸或者从N2末端除去带蛋氨酸的片段就没荧光了,没荧光的变异就不会表现出整个发色团的吸收光谱特征。

最后的7个残基无序,在圆筒的外边弯回来,不构成筒的外壁,它们的存在不是必需的,另外再加一些残基也没关系。

至于N2末端,在圆筒内的第一条蛋白链开始于残基10,筒的形成不需要N2末端部分。

N2末端片断是在蛋白的一头的帽子的主要成分,是折叠的,可以保护发色团。

在N2末端延伸不会破坏蛋白的结构。

非常紧密牢固的筒状结构和发色团所处的中心位置,都可以说明发色团被严格保护,性质稳定。

荧光不会由于和氧的相互碰撞而被猝灭,使得量子产率降低。

由于结构的关系通过系间窜越形成单重态氧而遭光化学损伤的几率也降低了。

图四绿色荧光蛋白图五GFP折叠布局

GFP由238个氨基酸组成,分子量约28kDa,组成发色团蛋白的3个残基Ser2dehydroTyr2Gly（丝2脱氢酪2甘）位于65~67位,经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮,它可以被光激发产生荧光。

野生水母GFP的最大吸收2激发波长在395nm,一个小峰在475nm,摩尔消光系数分别为30000和7000mol-1cm-1,发射峰在509nm（图六）,GFP晶体的荧光光谱和GFP水溶液的荧光光谱基本相同。

虽然氨基酸序列Ser2dehydroTyr2Gly在不少蛋白中也存在,但不是环化的,酪氨酸也不是被氧化的,更不会发光。

说明能形成发色团不是这三肽的固有特性。

在GFP中,发色团的形成经系列自催化过程,既无辅助因子也没有酶介入。

首先是Ser65和Gly67快速环化形成咪唑啉252酮中间体,然后O2慢慢氧化Tyr66的侧链,这个过程要几个小时。

形成发色团需要Gly67,没有任何一个氨基酸可以取代Gly。

反应对热敏感,温度高于30e时产率下降。

一旦形成GFP,它就是热稳定的。

对于GFP，当其发生变性后，11个β-片状结构被破坏，因此会失去发射荧光的能力，但是它的变性是可逆的，当β-片状结构恢复以后，荧光性质也会随之恢复。

图六GFP的吸收激发和发射光谱

2.2生色团的形成机理

图七荧光蛋白生色团

荧光蛋白中的发色团的形成是一个很罕见的以肽片段为母体的分子内自催化环化过程，一开始,人们相信发色团的自催化环化是唯一的,然而最近的研究显示，某些酶比如HAL、PAL等，也能通过连在蛋白质主体上而实现自动环化。

发色团的形成机理是不为人所知的，然而，Tsien等人预测了生色团的生物合成机理，如图八所示：

图八发色团的生物合成过程

从图中可以看出两点，第一点，发色团的形成并不需要什么其他的催化剂，这个过程存在于所有能合成GFP的生物有机体内。

第二点，发色团的合成需要氧气的参与，人们发现，将GFP放在无氧环境中，虽然它也有跟原来一样的电泳性质，但是它却失去了发射荧光的能力。

在S65T型GFP中，发色团的形成包括三个不同的动力学过程，首先，蛋白质是非常缓慢的一个过程kf=2.44*10-3s-1；其次，环化的发生，kc=3.8*10-3s-1;最后，发色团以缓慢的速度被氧化，kox=1.51*10-4s-1。

不同的GFP变异体的最后一步的氧化速率差别很大，比如S65T型GFP的氧化速率是野生GFP的五倍。

具体动力学过程见图九：

图九发色团形成的动力学过程

2.3GFP的发光机理

水母的整体或分离出的颗粒是发绿光的。

科学家首先从多管水母身上分离出了水母发光蛋白,其分子量为20kDa,它在遇钙离子以后发射波长460~470nm的蓝光。

每只水母平均只含50Lg的这种物质。

aequorin是水母荧光素通过硫酸酯键或过氧化键紧紧地连到脱辅水母发光蛋白上形成的,它遇到钙离子就发蓝光,因此可以用它作为钙离子的检测试剂,发光后的产物是脱辅水母发光蛋白,CO2和氧化荧光素,见图式1。

与其他发光生物不同的是,aequorin发出的蓝光,通过FÊrster共振能量转移将能量传给水母体内的GFP,发出波长509nm的绿光,所以水母在整体发光时发绿光。

图十水母荧光蛋白发光过程

水母发光蛋白上连接着荧光素,遇钙离子后发蓝光,经共振能量传递诱发GFP发光,整

个过程形成FÊrster循环,GFP是第一个知道的在蛋白核心的FÊrster循环的例子。

GFP激

发态的动力学用稳态和时间分辨荧光光谱进行过研究,结果认为,质子转移包含在两个基态和两个激发态的相互转换中。

围绕发色团的极性相互作用可以适应质子的重排。

在循环中根据Tyr66是处于羟基形式（上左）或它的酚盐形式（下左）,荧光色团分别吸收395nm或470nm的光。

酚在激发态比在基态具有更强的酸性,可以认为,荧光色团质子化的激发形式（上右）转换成激发的酚盐（下右）,它是仅有的发光物种,可以发射509nm的光。

在这个循环中荧光色团吸收一个光子,失去一个质子,发射一个光子,得到一个质子,回到原来的状态。

具体的循环过程见下图十一：

图十一FÊrster循环

第三章各类颜色荧光蛋白简介

前面已经介绍，绿色荧光蛋白的发展已经引起了生命科学界的一场伟大的革命，随着研究的进展，人们已经不仅仅局限于绿色荧光蛋白，人们致力于寻找有更好的光学性质、更快的成熟性、覆盖更广阔的光谱范围、不发生齐聚反应的荧光蛋白，目前，人们已经研究出了多种其他颜色的荧光蛋白，如图十二所示：

图十二不同颜色的荧光蛋白

3.1蓝色（BFP）和蓝绿色（CFP）荧光蛋白

虽然说近期的研究热点主要集中在橙色—远红外区域的荧光蛋白，但是，蓝色和蓝绿色荧光蛋白的出现也大大加强了这两种颜色的成像技术的应用。

虽然说蓝色荧光蛋白（EBFP）是GFP的第一种变异体，但是由于它发光颜色太浅以及光学稳定性太差的缘故，大部分的研究者并未选择它。

最近几年，有三个研究小组报道了得到改善的蓝色荧光蛋白，比原来的（EBFP）有更好光学稳定性，发光颜色也比原来深很多，被称为SBFP2，下图是Ai等人的研究成果：

图十三　改善的EBFP生色团及EBFP在生物体内的表达

这几篇报道第一次成功的实现了蓝色光谱区域内的活细胞成像技术。

这三种蓝色荧光蛋白在浓缩的为环境体系中很少会聚集成二聚体。

它们的功能在亚细胞定位蛋白中起到了重要的作用，用BFP和DAPI可以迅速的成像。

所有的这些新的BFP变异体都可以通过加入A206K来维持单分子状态，A206K的加入不会对蛋白质的性质产生不好的影响。

另外，EBFP2是发光能力最强、光学性质最好的BFP，是活细胞中一种非常良好的绿色荧光蛋白荧光共振能量转移的提供者（FRET）。

蓝绿色位于波长在470-500nm,这个光谱范围一直被原始的维多利亚多管水母的ECFP所支配，直到后来，一种新的蓝绿色荧光蛋白mTFP1的出现，相比于CFP，这种荧光蛋白的光谱发生了红移。

一般性质的CFP都会存在在发色团66位置上都会存在一个含芳香杂环的氨基酸色氨酸，mTFP1在这个位置存在一个酪氨酸。

通过酪氨酸取代色氨酸残基可以使荧光的发射范围由原来的60nm变为现在的30nm。

mTFP1的高效的荧光产率为它们的衍生物mECFP等和红色和橙色荧光蛋白结合时作为一个共振能量转移的提供者提供了非常好的选择性。

3.2绿色荧光蛋白（GFP）

大部分的荧光蛋白发射500nm到525nm的绿色光谱范围内的光，这些蛋白质存在于各种生命体当中，比如：

水母、文昌鱼以及焦珊瑚等等。

然而，现在各种荧光蛋白都没有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的效果好一些，或许，目前有一种称为“Emerald”的绿色荧光蛋白是活细胞成像技术的最好选择，因为它具有和增强型荧光蛋白母体的相似的性质。

“Emerald”相比于增强型荧光蛋白，它在F64L和S65T的位置发生了突变，还有四个使其折叠发生变化的突变位置，最终的结果导致它具有更加光亮的荧光性质。

虽然说“Emerald”可能比增强型荧光蛋白的效率更高，但是它含有一个光褪色组分，在一些特殊的环境中,这可能会影响它的定量成像。

近几年,对于绿色蛋白的最好的补充应该算是超级折叠绿色荧光蛋白了。

即使混进不溶的蛋白质里,它也能高效的折叠,并且,它具有比增强型绿色荧光蛋白和“Emerald”荧光蛋白更光亮的性质以及更好的耐受酸的性质它也有一个显著的缺点，那就是背景噪声太大，影响检测。

3.3黄色荧光蛋白（YFP）

黄色荧光蛋白作为光谱的一种，由于其发光效果最明亮，它已经成为了应用最广泛的一种探针。

然而，原始的黄色荧光蛋白的变异体EYFP由于其pKa太大并且对卤素非常敏感，因此，它也不是一种最佳的选择。

单分子YFP的变异体“mCitrine”以及”mVenus“是黄色荧光蛋白领域应用最广泛的两种探针，但是现在市场上都买不到。

另外，最近新发展得SYFP荧光蛋白也成为了YFP家族的一份子，如果它在哺乳动物体内的表达得到证实，那么它的应用将会更加的广泛。

黄色荧光蛋白另外一种应用的就是作为YPet（yellowfluorescentproteinforenergytransfer），它是用荧光激活细胞分选术来使DNA混编，从而产生蓝绿色和黄色荧光蛋白对，在FRET中起重要作用。

YPet是目前发展起来的YFP中最光亮的，并且具有很好的光学稳定性。

良好的耐受酸的能力使它优于Venus和其他YFP衍生物，这将会使它应用于生物传感器从而可以作用于酸性的组织或器官上。

虽然，它是FRET的最佳选择，但是它的各种性质增强的原因仍然等着人们去探索和发现。

3.4橙色荧光蛋白（OFP）

与由GFP、CFP、YFP发展起来的上百种荧光蛋白相反的是，只有很少的荧光蛋白探针在橙色和红色的波普范围内发展起来。

然而,即便如此,现发现的几种从一些特殊物种分离得到的橙色和红色荧光蛋白依然在成像技术方面展现出了良好的应用前景。

在橙色光谱范围内的荧光蛋白存在着命名上的混乱。

通常术语所讲的红色荧光蛋白，比如DsRed、TagRFP、tdTomato等探针所发射的颜色其实更倾向于橙色而不是红色。

忽略掉颜色的定义，使用四甲基异硫氰酸罗丹明滤光镜套件,橙色荧光蛋白和蓝绿色、绿色、红色荧光蛋白联合起来很容易在混合颜色的场景中成像。

KusabiraOrange这种荧光蛋白是通过一种珊瑚的cDNA克隆的特定位点变异而得到的，它的N端被加上了十个残基。

这种荧光蛋白可以在548nm处有一个最大吸收，并且会放射出波长为559nm的黄色—橙色荧光。

KusabiraOrange这种橙色荧光蛋白是作为一种四聚体被发现的，发现不久，它的单分子变异体就被得到了，这种单分子荧光蛋白称为mKO。

它的发光性能和EGFP很相似，但是它的光学稳定性是目前已知荧光蛋白中最好的，这也是使它成为了长时间发光成像实验的最好的选择。

现在，无论是四聚体还是单分子的KusabiraOrange荧光蛋白都能在市场上买到。

最近，一种名为TagRFP的单分子橙色荧光蛋白被报道，它在定位和FRET中有着非常大的应用潜力。

开始，这种荧光蛋白是从海葵体内克隆的得到的二聚体，后来又产生了一种新的能快速成熟的变异体—TurboRFP，它展现出了很好的发光性、光稳定性以及pH耐受能力。

后来又在此基础上发展出了新的变异体TagRFP，它具有很好的发光性能，并且能在哺乳动物的细胞内很好的融合和表达。

几个关于DsRedFP的难题已经通过定位点的随机突变得到解决，然而，这种蛋白质的单分子结构仍然是一个难题。

研究发，要创造出单分子的DsRedFP需要改变33个氨基酸残基，得到的这种单分子荧光蛋白称为mRFP1，最大的吸收波长在584nm，最大的发射波长在607nm。

然而，它的发光强度小，褪光速度快的缺点还是使它的应用受到一定程度的限制。

3.5红色荧光蛋白（RFP）

使红色荧光蛋白在生物细胞乃至于动物体内得到很好地表达一直以来都是一个目标，因为红色荧光蛋白的激发波长较长，对生物体的伤害较小，这样就可以用来探究更深层次的生命体组织了。

在这一方面,最引人瞩目的就是一种从mRFP1衍生来的新型荧光蛋白，它是通过目标生色团的特定变异得到的。

它最大的吸收和发射波长分别是560nm和610nm。

有趣的是随后的这一系列的荧光蛋白的命名都是以和它们发射光颜色相同的水果来命名的。

在”水果”系列的红色荧光蛋白中，最好的应该算是mStrawberrey和mCherry，它们的发光强度大约是EGFP的75%到50%。

但是由于mCherry的发光稳定性要好于mStrawberrey，因此，在