光学显微镜原理分析.docx

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光学显微镜原理分析

光学显微镜原理分析

一、光学显微镜的发展历史 

    早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放大成像。

后来逐渐对球形玻璃外表能使物体放大成像的规律有了认识。

    1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。

1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的间隔，得出合理的显微镜光路结构，当时的光学工匠遂纷纷从事显微镜的制造、推广和改进。

    17世纪中叶，英国的胡克和荷兰的列文胡克，都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。

1665年前后，胡克在显微镜中参加粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。

这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的根本组成部分。

    1673～1677年期间，列文胡抑制成单组元放大镜式的高倍显微镜，其中九台保存至今。

胡克和列文胡克利用自制的显微镜，在动、植物机体微观结构的研究方面获得了出色成就。

    19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的才能大为进步。

1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。

19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。

这些都促进了显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，并为19世纪后半叶包括科赫、巴斯德等在内的生物学家和医学家发现细菌和微生物提供了有力的工具。

    在显微镜本身结构发展的同时，显微观察技术也在不断创新：

1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干预显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。

    古典的光学显微镜只是光学元件和精细机械元件的组合，它以人眼作为接收器来观察放大的像。

后来在显微镜中参加了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。

现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完好的图像信息采集和处理系统。

    目前全世界最主要的显微镜厂家主要有：

奥林巴斯、蔡司、徕卡、尼康。

国内厂家主要有：

江南、麦克奥迪等。

二、显微镜的根本光学原理 

    〔一〕折射和折射率 

    光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，那么发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。

当与透明物面不垂直的光线由空气射入透明物体〔如玻璃〕时，光线在其介面改变了方向，并和法线构成折射角。

    〔二〕透镜的性能 

    透镜是组成显微镜光学系统的最根本的光学元件，物镜目镜及聚光镜等部件均由单个和多个透镜组成。

依其外形的不同，可分为凸透镜〔正透镜〕和凹透镜〔负透镜〕两大类。

    当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称"焦点"，通过交点并垂直光轴的平面，称"焦平面"。

焦点有两个，在物方空间的焦点，称"物方焦点"，该处的焦平面，称"物方焦平面"；反之，在象方空间的焦点，称"象方焦点"，该处的焦平面，称"象方焦平面"。

    光线通过凹透镜后，成正立虚像，而凸透镜那么成正立实像。

实像可在屏幕上显现出来，而虚像不能。

    〔三〕凸透镜的五种成象规律 

    1.当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，那么在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； 

    2.当物体位于透镜物方二倍焦距上时，那么在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象； 

    3.当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，那么在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象； 

    4.当物体位于透镜物方焦点上时，那么象方不能成象； 

    5.当物体位于透镜物方焦点以内时，那么象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。

三、光学显微镜的成象〔几何成象〕原理 

    只有当物体对人眼的张角不小于某一值时，肉眼才能区别其各个细部，该量称为目视分辨率ε。

在最正确条件下，即物体的照度为50~70lx及其对比度较大时，可到达1’。

为易于观测，一般将该量加大到2’，并取此为平均目镜分辨率。

    物体视角的大小与该物体的长度尺寸和物体至眼睛的间隔有关。

有公式y=Lε 

    间隔L不能获得很小，因为眼睛的调节才能有一定限度，尤其是眼睛在接近调节才能的极限范围工作时，会使视力极度疲劳。

对于标准〔正视〕而言，最正确的视距规定为250mm〔明视间隔〕。

这意味着，在没有仪器的条件下，目视分辨率ε=2’的眼睛，能清楚地区分大小为0.15mm的物体细节。

    在观测视角小于1’的物体时，必须使用放大仪器。

放大镜和显微镜是用于观测放置在观测人员近处应予放大的物体的。

    〔一〕放大镜的成像原理 

    外表为曲面的玻璃或其他透明材料制成的光学透镜可以使物体放大成像，光路图如图1所示。

位于物方焦点F以内的物AB，其大小为y，它被放大镜成一大小为y’的虚像A’B’。

    放大镜的放大率 

    Γ=250/f’ 

    式中250--明视间隔，单位为mm 

    f’--放大镜焦距，单位为mm 

    该放大率是指在250mm的间隔内用放大镜观察到的物体像的视角同没有放大镜观察到的物体视角的比值。

    〔二〕显微镜的成像原理 

    显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。

只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。

    图2是物体被显微镜成像的原理图。

图中为方便计，把物镜L1和目镜L2均以单块透镜表示。

物体AB位于物镜前方，分开物镜的间隔大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。

所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像A’B’。

A’B’位于目镜的物方焦点F2上，或者在很靠近F2的位置上。

再经目镜放大为虚像A’’B’’后供眼睛观察。

虚像A’’B’’的位置取决于F2和A’B’之间的间隔，可以在无限远处〔当A’B’位于F2上时〕，也可以在观察者的明视间隔处〔当A’B’在图中焦点F2之右边时〕。

目镜的作用与放大镜一样。

所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。

    〔三〕显微镜的重要光学技术参数 

    在镜检时，人们总是希望能明晰而亮堂的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数到达一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。

只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果。

    显微镜的光学技术参数包括：

数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作间隔等等。

这些参数并不都是越高越好，它们之间是互相联系又互相制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。

    1．数值孔径 

    数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者〔尤其对物镜而言〕性能上下的重要标志。

其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。

    数值孔径〔NA〕是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率〔n〕和孔径角〔u〕半数的正弦之乘积。

用公式表示如下：

NA=nsinu/2 

    孔径角又称"镜口角"，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。

孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的间隔成反比。

    显微镜观察时，假设想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值。

基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1。

    数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都到达了极限。

目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。

    这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。

    数值孔径与其他技术参数有着亲密的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。

它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作间隔都会相应地变小。

 2．分辨率 

    显微镜的分辨率是指能被显微镜明晰区分的两个物点的最小间距，又称"鉴别率"。

其计算公式是σ=λ/NA 

    式中σ为最小分辨间隔；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。

可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。

NA值越大，照明光线波长越短，那么σ值越小，分辨率就越高。

    要进步分辨率，即减小σ值，可采取以下措施 

    〔1〕降低波长λ值，使用短波长光源。

    〔2〕增大介质n值以进步NA值〔NA=nsinu/2〕。

    〔3〕增大孔径角u值以进步NA值。

    〔4〕增加明暗反差。

    3．放大率和有效放大率 

    由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率Γ应该是物镜放大率β和目镜放大率Γ1的乘积：

    Γ=βΓ1 

    显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。

    放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。

显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。

    分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。

有关系式：

500NA<Γ<1000NA 

    当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。

反之假设分辨率已满足要求而放大倍率缺乏，那么显微镜虽已具备分辨的才能，但因图像太小而仍然不能被人眼明晰视见。

所以为了充分发挥显微镜的分辨才能，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。

    4．焦深 

    焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。

焦深大,可以看到被检物体的全层，而焦深小，那么只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系：

    〔1〕焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。

    〔2〕焦深大，分辨率降低。

    由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。

在显微照相时将详细介绍。

    5．视场直径〔FieldOfView〕 

    观察显微镜时，所看到的亮堂的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。

    视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。

视场直径愈大，愈便于观察。

    有公式F=FN/β 

    式中F:

视场直径，FN：

视场数〔FieldNumber,简写为FN，标刻在目镜的镜筒外侧〕，β:

物镜放大率。

    由公式可看出：

    〔1〕视场直径与视场数成正比。

    〔2〕增大物镜的倍数，那么视场直径减小。

因此，假设在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。

    6．覆盖差 

    显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。

由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。

覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。

    国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。

物镜外壳上标的0.17，即说明该物镜所要求的盖玻片的厚度。

    7．工作间隔WD 

    工作间隔也叫物距，即指物镜前透镜的外表到被检物体之间的间隔。

镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。

因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作间隔。

    在物镜数值孔径一定的情况下，工作间隔短孔径角那么大。

    数值孔径大的高倍物镜，其工作间隔小。

〔四〕物镜 

    物镜是显微镜最重要的光学部件，利用光线使被检物体第一次成象，因此直接关系和影响成象的质量和各项光学技术参数，是衡量一台显微镜质量的首要标准。

    物镜的结构复杂，制作精细，由于对象差的校正，金属的物镜筒内由相隔一定间隔并被固定的透镜组组合而成。

物镜有许多详细的要求，如合轴,齐焦。

    齐焦既是在镜检时，当用某一倍率的物镜观察图象明晰后，在转换另一倍率的物镜时，其成象亦应根本明晰，而且象的中心偏离也应该在一定的范围内，也就是合轴程度。

齐焦性能的优劣和合轴程度的上下是显微镜质量的一个重要标志，它是与物镜的本身质量和物镜转换器的精度有关。

    现代显微物镜已到达高度完善，其数值孔径已接近极限，视场中心的分辨率与理论值之区别已微乎其微。

但继续增大显微物镜视场与进步视场边缘成象质量的可能性仍然存在，这种研究工作，至今仍在进行。

    显微物镜与目镜在参于成象这点上是有区别的。

物镜是显微镜最复杂和最重要的部分，在宽光束中工作〔孔径大〕，但这些光束与光轴的倾角较小〔视场小〕；目镜在窄光束中工作，但其倾角大〔视场大〕。

当计算物镜与目镜，在消除象差上有很大差别。

    与宽光束有关的象差是球差、慧差以及位置色差；与视场有关的象差是象散、场曲、畸变以及倍率包差。

    显微物镜是一消球差系统。

这意味着：

就轴上的一对共轭点而言，消除了球差并且实现了正弦条件时，每一物镜仅有两个这种消球差点。

因此，物体与象的计算位置的任何改变均导致象差变大。

    1．物镜的主要参数 

    〔1〕放大率β 

    〔2〕数值孔径NA 

    〔3〕机械筒长L：

在显微镜中，物镜支承面到目镜支承面之间的间隔称为机械筒长。

对于一台显微镜来说，机械筒长是固定的。

我国规定机械筒长是160毫米。

    〔4〕盖玻片厚度d 

    〔5〕工作间隔WD 

    这些参数，大多刻在物镜筒上，如图3所示。

    有一种所谓筒长无限的显微物镜，这种物镜的前方一般带有辅助物镜〔也叫补偿物镜或镜筒物镜〕，被观察物体位于物镜前焦点上，经过物镜以后，成像在无限远，再经过辅助物镜成像在辅助物镜的焦平面上，如图4所示。

在物镜和辅助物镜之间是平行光，所以中间间隔比较自由一些，可以参加棱镜等光学元件。

    2．物镜的根本类型 

    〔1〕按显微镜镜筒长度〔以mm计〕：

透射光用160镜筒，带0.17mm厚或更厚的盖玻片；反射光用190镜筒，不带盖玻片；透射光与反射光用镜筒，筒长无限大。

    〔2〕按浸法特征：

非浸式〔干式〕、浸式〔油浸、水浸、甘油浸及其它浸法〕。

    〔3〕按光学装置：

透射式、反射式以及折反射式。

    〔4〕按数值孔径和放大倍数：

低倍〔NA≤0.2与β≤10X〕，中倍〔NA≤0.65与β≤40X〕，高倍〔NA＞0.65与β＞40X〕。

    〔5〕按校正象差的情况不同，通常分为消色差物镜，半复消色差物镜，复消色差物镜，平视场消色差物镜，平视场复消色差物镜和单色物镜。

    a.消色差物镜〔Achromaticobjective〕 

    这是应用最广泛的一类显微物镜，外壳上常有"Ach"字样。

它校正了轴上点的位置色差〔红，蓝二色〕、球差〔黄绿光〕和正弦差，保持了齐明条件。

轴外点的象散不超过允许值〔－4属光度〕，二级光谱未校正。

    数值孔径为0.1~0.15的低倍消色差物镜一般由两片透镜胶合在一起的双胶物镜构成。

数值孔径至0.2的消色差物镜由两组双胶透镜构成。

当数值孔径增大到0.3时，再参加一平凸透镜，该平凸透镜决定着物镜的焦距，而其它透镜那么补偿由其平面与球面产生的象差。

高倍物镜的平面象差可用浸法消除。

高倍消色差物镜一般均为浸式，由四部分构成：

前片透镜、新月形透镜及两个双胶透镜组。

    b.复消色差物镜〔Apochromaticobjective〕 

    这类物镜的结构复杂，透镜采用了特种玻璃或萤石等材料制作而成，物镜的外壳上标有"Apo"字样。

它对两个色光实现了正弦条件，要求严格地校正轴上点的位置色差〔红，蓝二色〕、球差〔红，蓝二色〕和正弦差，同时要求校正二级光谱〔再校正绿光的位置色差〕。

其倍率色差并不能完全校正，一般须用目镜补偿。

    由于对各种象差的校正极为完善，比响应倍率的消色差物镜有更大的数值孔径，这样不仅分辨率高，象质量优而且也有更高的有效放大率。

因此，复消色差物镜的性能很高，适用于高级研究镜检和显微照相。

    c.半复消色差物镜〔Semiapochromaticobjective〕 

    半复消色差物镜又称氟石物镜，物镜的外壳上标有"FL"字样。

在结构上透镜的数目比消色差物镜多，比复消色差物镜少，成象质量上，远较消色差物镜为好，接近于复消色差物镜。

    d.平视场物镜〔Planobjective〕 

    平场物镜是在物镜的透镜系统中增加一快半月形的厚透镜，以到达校正场曲的缺陷，进步视场边缘成像质量的目的。

平场物镜的视场平坦，更适用于镜检和显微照相。

对于平视场消色差物镜，其倍率色差不大，不必用特殊目镜补偿。

而平视场复消色差物镜，那么必须用目镜来补偿它的倍率色差。

    e.单色物镜 

    这类物镜由石英、荧石或氟化锂制的一组单片透镜构成。

只能在紫外线光谱区的个别区内使用〔宽度不超过20mm〕，可见光谱区不能采用单色物镜。

这类物镜均制成反射式与折反射式系统。

主要缺点是相当大一部分光束在中心被遮蔽〔入瞳面积的25%〕。

在新型折反射系统中，由于采用半透明反射镜以及物镜的胶合结构，使这一缺点大为减轻，从而可以取消反射镜框的遮光。

并且两同轴反射镜的剩余象差是互相补偿的，同时用透镜组来增大数值孔径。

假设系统的校正满意，孔径到达NA=1.4时，中心遮蔽可不超过入瞳面积的4%。

    f.特种物镜 

    所谓"特种物镜"是在上述物镜的基础上，专门为到达某些特定的观察效果而设计制造的。

主要有以下几种：

    〔a〕带校正环物镜〔Correctioncollarobjective〕 

    在物镜的中部装有环装的调节环，当转动调节环时，可调节物镜内透镜组之间的间隔，从而校正由盖玻片厚度不标准引起的覆盖差。

调节环上的刻度可从0.11--.023,在物镜的外壳上也标科有此数字，说明可校正盖玻片从0.11-0.23mm厚度之间的误差。

    〔b〕带虹彩光阑的物镜〔Irisdiaphragmobjective〕 

    在物镜镜筒内的上部装有虹彩光阑，外方也可以旋转的调节环，转动时可调节光阑孔径的大小，这种结构的物镜是高级的油浸物镜，它的作用是在暗视场镜检时，往往由于某些原因此使照明光线进入物镜，使视场背景不够黑暗，造成镜检质量的下降。

这时调节光阑的大小，使背景变黑，使被检物体更亮堂，增强镜检效果。

    〔c〕相衬物镜〔Phasecontrastobjective〕 

    这种物镜是由于相衬镜检术的专用物镜，其特点是在物镜的后焦平面处装有相板。

    〔d〕无罩物镜〔Nocoverobjective〕 

    有些被检物体，如涂抹制片等，上面不能加用盖玻片，这样在镜检时应使用无罩物镜，否那么图象质量将明显下降，特别是在高倍镜检时更为明显。

这种物镜的外壳上常标刻NC，同时在盖玻片厚度的位置上没有0.17的字样，而标刻着"0"。

    〔e〕长工作间隔物镜 

    这种物镜是倒置显微镜的专用物镜，它是为了满足组织培养，悬浮液等材料的镜检而设计。

〔五〕目镜 

    目镜的作用是把物镜放大的实象〔中间象〕再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，本质上目镜就是一个放大镜。

显微镜的分辨率才能是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。

因此，对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。

    〔六〕聚光镜 

    聚光镜装在载物台的下方。

小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，那么必须具有聚光镜。

聚光镜不仅可以弥补光量的缺乏和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。

    聚光镜的的结构有多种，同时根据物镜数值孔径的大小，相应地对聚光镜的要求也不同。

    1．阿贝聚光镜〔Abbecondenser〕 

    这是由德国光学大学大师恩斯特.阿贝〔ErnstAbbe〕设计。

阿贝聚光镜由两片透镜组成，有较好的聚光才能，但是在物镜数值孔径高于0.60时，那么色差，球差就显示出来。

因此，多用于普通显微镜上。

    2．消色差聚光镜〔Achromaticaplanaticcondenser〕 

    这种聚光镜又名"消球差聚光镜"和"齐明聚光镜"，它由一系列透镜组成，它对色差球差的校正程度很高，能得到理想的图象，是明场镜检中质量最高的一种聚光镜，其NA值达1.4。

因此，在高级研究显微镜常配有此种聚光镜。

它不适用于4X以下的低倍物镜，否那么照明光源不能充满整个视场。

    3．摇出式聚光镜〔Swingoutcondenser〕 

    在使用低倍物镜时〔如4X〕，由于视场大，光源所形成的光锥不能充满真整个视场，造成视场边缘部分黑暗，只中央部分被照亮。

要使视场充满照明，就需将聚光镜的上透镜从光路中摇出。

    4．其它聚光镜 

    聚光镜除上述明场使用的类型外，还有作特殊用图的聚光镜。

如暗视场聚光镜，相衬聚光镜，偏光聚光镜，微分干预聚光镜等，以上聚光镜分别适用于相应的观察方式。

    〔七〕照明方法 

    显微镜的照明方法按其照明光束的形成，可分为"透射式照明"，和"落射式照明"两大类。

前者适用于透明或半透明的被检物体，绝大数生物显微镜属于此类照明法；后者那么适用于非透明的被检物体，光源来自上方，又称""反射式照明"。

主要应用与金相显微镜或荧光镜检法。

    1．透射式照明 

    生物显微镜多用来观察透明标本，需要以透射光来照明。

有两种照明方式 

    〔1〕临界照明〔Criticalillumination〕光源经过聚光镜后，成像于物平面上，如图5所示。

假设忽略光能的损失，那么光源像的亮度与光源本身一样，因此，这种方法相当于在物平面上放置光源。

显然，在临界照明中，假设光源外表亮度不均匀，或明显地表现出细小的结构，如灯丝等，那么就要严重影响显微镜观察效果，这是临界照明的缺点。

其补救的方法是在光源的前方放置乳白和吸热滤色