八种抗生素检测结题报告.docx
《八种抗生素检测结题报告.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《八种抗生素检测结题报告.docx（37页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
八种抗生素检测结题报告
院级本科生科技创新基金项目
研究报告
项目名称畜、禽肉中八种抗生素的测定
立项时间2011年3月
计划完成时间2012年3月
项目负责人邓明镜
学院及班级化生学院生技0901班
2012年4月22日
北京科技大学教务处
摘要
抗生素是由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，主要用于治疗各种细菌感染或其以致病微生物感染，广泛应用于医药卫生领域中。
有人估计，由于抗生素的发明，全人类的平均寿命增加了10岁。
但是，抗生素的广泛使用，也带来了一些严重问题。
例如，若过量的注射或在饲料中添加抗生素，将致使病菌耐药能力逐年增强，从而减少畜、禽对病菌的抵抗力；而人体经常摄入低剂量的抗生素残留物，会逐渐在体内蓄积而导致各种器官病变。
所以抗生素残留已经成为乳肉类食品安全中一个日益严峻的问题。
本实验采用高效液相色谱法（HPLC），在中华人民共和国国家标准方法（GB/T5009.116-2003）的基础上进行优化，旨在建立一种能够同时检测畜禽肉中土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、四环素（TC）、氯霉素（CLP）、磺胺、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲恶唑（SMZ）和氟哌酸（FPA）八种抗生素的方法。
实验时色谱条件为：
色谱柱规格ODS-C18（5μm）6.2mm×15cm，检测波长355nm和280nm，柱温40℃，流速0.8mL/min，进样量20μL，流动相为乙腈：
0.01mol/L磷酸二氢钠（用30%硝酸溶液调节PH2.5）=23:
77。
本方法对八种抗生素的分离效果较好，实现了基线分离。
实验中分别研究并确定了八种抗生素的检出限（LOD）、定量限（LOQ）和线性范围；而在实际肉样的测定中，由于磺胺的出峰时间及鸡肉杂质峰相重合，所以我们比较三种C18固相萃取小柱对干扰物的去除效果，实验结果表明杂质的去除效果均不明显，无法测算其标准曲线，而其他七种抗生素测定效果理想。
本方法的建立更快捷的实现了肉类中多种抗生素残留的检测；不仅节约了实验室检测的成本，缩短了检测时间，还大大提高了检测精度。
[关键词]抗生素高效液相色谱畜禽肉
目 录
1.1项目背景条件3
1.2项目意义3
1.3主要工作3
2.2抗生素残留现状5
2.3抗生素残留检测方法6
1绪论
1.1项目背景条件
抗生素最早发现于1929年，英国科学家弗莱明培养细菌时观察到，空气中偶然落在培养基上的青霉菌的菌落周围没有其他细菌生长，他认为是青霉菌产生了某种化学物质，并且分泌到培养基中抑制了细菌的生长。
这种化学物质就是最早发现的抗生素（antibiotics）——青霉素。
青霉素作为治疗细菌感染的特效药，在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。
自20世纪初青霉素问世以来，抗生素作为抗感染治疗的重要药物，在保障人类健康中发挥着重要的作用。
随着现代医药科学技术的进步，在畜、禽、牧、水生生物等产业领域应用药物对动物进行诊断、预防和治疗疾病，以及促进动物生长、提高饲料转化率等日益普遍，并且带来了可观的经济效益。
但人们长期食用这种动物食品及制品，必然会危及人类健康。
一些国家相继成立了各种相应的管理组织，通过立法来规范、制定和管理动物组织及产品中抗生素残留的限量标准，我国还加强了对动物性食品中抗生素残留的检测、检查工作以及对各种违法犯罪行为的打击力度。
1.2项目意义
研究表明，动物源食品中残留抗生素是诱发儿童肥胖的一个重要因素，长期食用有抗生素残留的动物性食品，不仅会使病菌产生抗药性，而且还会造成一些非致病菌的死亡。
例如人体肠道内寄生着对人体有益的微生物菌群，它们及人体为互利共生关系，正常情况下，微生物菌群处于平衡状态；若体内抗生素积蓄过量，将导致菌群失调，同时肠道内产生维生素B族和维生素Ｋ族的细菌受到抑制，造成严重的肝损害，从而引起维生素缺乏。
经常食用含有青霉素、四环素、磺胺类药物的乳肉制品，极易引起易染个体的过敏反应，严重者可引起皮疹、呼吸困难、休克等症状，甚至危及生命。
乳肉类中抗生素的检测根据检测原理不同，主要分为免疫学方法、微生物法和理化分析法三类。
但是在动物源性食品中，由于其蛋白质及脂肪含量高、基质复杂等原因，对磺胺及四环素类抗生素残留的测定多采用分别测定的方法，较费时费力。
而最有效的检测方法是采用固相萃取净化、色谱分离后进行质谱分析，该法需昂贵的仪器，在推广上受到限制。
所以，建立一种简便、快捷、灵敏且同时可以检测多种抗生素的检测方法迫在眉睫。
本方法建立了同时测定动物源性食品中常用的3种磺胺类药物：
磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑和磺胺；3种四环素类药物：
土霉素、四环素和金霉素；一种喹诺酮类药物：
氟哌酸；和一种氯霉素类药物：
氯霉素，共八种抗生素残留的方法，根据用高效液相色谱法（HPLC）测定畜禽肉中土霉素、四环素和金霉素的中华人民共和国国家标准，改良优化其方法步骤，以节约实验室检测的费用及检测的时间，避免重复性劳动，达到快速、便捷的效果。
1.3主要工作
本实验检测的动物性食品为畜、禽肉，主要仪器是高效液相色谱仪，在中华人民共和国国家标准方法（GB/T5009.116-2003）的基础上进行优化，具体工作如下：
1测定八种抗生素的出峰时间、线性范围、检出限和定量限；
2测定猪肉中土霉素、四环素、金霉素、氯霉素残留量；
3优化实验条件，测定鸡肉中四环素残留量；
4测定鸡肉中八种抗生素含量；
5比较三种C18固相萃取小柱对干扰物的去除效果。
2文献综述
2.1抗生素概述
2.1.1抗生素定义
抗生素是由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，且能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。
在体外能抑制微生物的生长，而对宿主不会产生严重的副作用。
通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种细菌感染或其以致病微生物感染的药物。
抗生素以前被称为抗菌素，事实上它不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用，近年来通常将抗菌素改称为抗生素。
卫生部调查显示，我国是世界上抗生素滥用最严重的国家，平均每年每人要“挂8瓶水”，远远高于国际上2.5瓶-3.3瓶的水平。
据不完全统计，我国抗生素人均年消费量为138克左右，是美国的10倍。
在中国住院患者中，抗生素的使用率达到70%，而实际上八成病人不需要抗生素。
除经济利益外，抗生素滥用还来自于病人的压力以及医生的用药习惯。
2.1.2抗生素分类
抗生素主要有以下几种分类：
①β-内酰胺类青霉素类和头孢菌素类分子结构中含有β-内酰胺环为基本特征。
近年来又发现了硫酶素类、单内酰环类，β-内酰酶抑制剂、甲氧青霉素类等几类抗生素。
②氨基糖甙类包括链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小诺霉素、阿斯霉素等。
③四环素类包括四环素、土霉素、金霉素及强力霉素等。
④氯霉素类包括氯霉素、甲砜霉素等。
⑤大环内脂类临床常用的有红霉素、白霉素、无味红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素、交沙霉素等。
⑥作用于G+细菌的其它抗生素如林可霉素、氯林可霉素、万古霉素、杆菌肽等。
⑦作用于G菌的其它抗生素如多粘菌素、磷霉素、卷霉素、环丝氨酸、利福平等。
⑧抗真菌抗生素如灰黄霉素。
⑨抗肿瘤抗生素如丝裂霉素、放线菌素D、博莱霉素、阿霉素等。
⑩具有免疫抑制作用的抗生素如环孢霉素。
2.1.3八种抗生素简介
本实验检测的八种抗生素主要为四大类：
四环素类的土霉素、四环素、金霉素；氯霉素类的氯霉素；磺胺类的磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺；喹诺酮类的氟哌酸。
四环素类：
四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，其结构均含并四苯基本骨架。
广泛用于多种细菌及立克次氏体、衣原体、支原体等所致之感染。
四环素类抗生素在酸性和碱性条件下均不稳定，四环素类药物中含有许多羟基、烯醇羟基及羰基，在中性条件下能及多种金属离子形成不溶性螯合物。
及钙或镁离子形成不溶性的钙盐或镁盐，及铁离子形成红色络合物，及铝离子形成黄色络合物。
氯霉素类：
一种由委内瑞拉链霉菌中分离提取的广谱抗生素。
对许多需氧革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、厌氧的拟杆菌、立克次氏体、衣原体及菌质体都有抑制作用，尤其对沙门氏菌属、流感杆菌和拟杆菌属等有良好的抗菌能力。
氯霉素的化学结构含有对硝基苯基、丙二醇及二氯乙酰胺三个部分，其抗菌活性主要及丙二醇有关。
磺胺类：
为人工合成的抗菌药，具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便、生产时不耗用粮食等优点。
磺胺类药物一般为白色或微黄色结晶性粉末，遇光易变质，色渐变深，大多数本类药物在水中溶解度极低，较易溶于稀碱，但形成钠盐后则易溶于水，其水溶液呈强碱性。
尽管目前有效的抗生素很多，但磺胺类药在控制各种细菌性感染的疾病中，特别是在处理急性泌尿系统感染中仍有其重要价值。
磺胺类药易产生耐药性，在肝内的代谢产物──乙酰化磺胺的溶解度低，易在尿中析出结晶，引起肾的毒性，因此用药时应该严格掌握剂量、时间，同服碳酸氢钠并多饮水。
临床常用的磺胺类药物都是以对位氨基苯磺酰胺（简称磺胺）为基本结构的衍生物。
对许多革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌、诺卡氏菌属、衣原体属和某些原虫（如疟原虫和阿米巴原虫）均有抑制作用。
喹诺酮类：
又称吡酮酸类或吡啶酮酸类，是一类合成抗菌药。
喹诺酮类以细菌的脱氧核糖核酸（DNA）为靶。
妨碍DNA回旋酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，达到抗菌效果。
本类药物及许多抗菌药物间无交叉耐药性，是理想的抗菌药。
喹诺酮类是主要作用于革兰阴性菌的抗菌药物，对革兰阳性菌的作用较弱（某些品种对金黄色葡萄球菌有较好的抗菌作用）。
2.2抗生素残留现状
近60年来，抗生素是用于治疗人类及兽类疾病的最常用药物。
抗生素在人类的防病、治病，和畜牧业中都发挥着巨大的作用。
但随着人类生活水平的提高，抗生素残留已经成为了乳肉类食品安全的一个重要问题。
抗生素残留是指给动物使用抗生素药物后积蓄或储存在动物细胞、组织或器官内的药物原形、代谢产物或药物杂质。
现在这个问题日趋严重，对人类的健康和环境造成了很大的影响。
抗生素积蓄在人体中会产生某些毒害作用，部分体质会引起过敏反应，还会产生耐药菌株，重则会使人体致癌、致畸、致突变。
当抗生素随动物的粪便等排泄物排入环境后，会对土壤微生物、水产生物及昆虫造成影响。
早在1988年，我国就对肉及肉制品的四环素族抗生素残留量制定了检验标准（GB9695.16-1988）。
但到现在为止，我国动物源性食品中这类药物残留超标仍比较严重。
2002年12月到2003年6月，成都市疾病预防控制中心对城乡开展调查：
猪肝中金霉素残留量最高为21.32%；四环素类阳性检出率为6.857%，其阳性超标率为73.91%；城乡猪肉中土霉素、金霉素残留量分别为达到最高残留限量（MRL）的14.58倍、11.3倍、5.4倍和2.4倍。
磺胺类药物的残留现状也不容忽视。
据报道，2003年兰州地区鲜（生）乳中磺胺的残留检出率为7.41%，磺胺嘧啶为4.44%，甲氧卞基嘧啶为12.59%，磺胺甲恶唑为21.48%。
而氯霉素在我国列为禁药，它会抑制人体造血系统的功能，导致白血病。
但氯霉素在水产品、蜂蜜甚至牛奶中仍有残留，甚至影响了我国畜禽产品的出口贸易。
2002年1月28日，欧盟以氯霉素残留为由宣布全面禁止从中国进口动物源性食品。
同年2月7日，英国以氯霉素超标为由停止销售中国蜂蜜。
我国开展兽药残留工作始于1991年，现在基本形成了农业部监控我国的动物及动物源性食品中的药物残留，国家质检总局检测进出口动物源性食品的药物残留的局面。
兽药残留限量标准是兽药残留监控的依据。
我国兽药残留限量标准制定始于1994年，共经历了4次修订。
现行的兽药最高残留限量标准是2002年12月24日农业部235号文件发布的。
欧洲委员会也在2002年3月底提议“欧盟将全面禁止在饲料中使用生长素类抗生素作为饲料促生长添加剂”。
虽然现在世界各地都在限制甚至禁止兽药中使用抗生素，但现在抗生素残留事件仍时有发生，非常值得我们关注。
2.3抗生素残留检测方法
目前用于检测肉类抗生素残留的方法有很多，根据检测方法原理的不同，可主要分为免疫学方法、微生物法和理化分析法。
免疫学方法是根据抗原抗体特异性反应的基本特征而设计的抗生素检测方法。
免疫反应的特点是有较高的选择性和灵敏性。
目前药物残留免疫学分析技术主要分为两大类：
一种是利用免疫分析的高选择性作为理化测定技术中的净化手段，将免疫技术及常规理化分析技术结合的方法，典型方式如免疫亲合色谱。
而相对独立的免疫测定法，如：
酶联免疫（ELISA）、放射免疫（RIA）、免疫传感器等。
微生物法是传统的，也是最广泛应用的方法。
其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用，来定性或定量确定样品中微生物药品残留，有纸片法、平板培养抑菌法等。
其优点是成本低，可在一般实验室操作，但操作复杂费时，不能区分具体的抗生素药物，灵敏度和特异性较低。
理化分析法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量，如气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法（HPLC）、质谱法、联用技术等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高。
许多理化检测方法对于样本的制备要求严格,需要复杂样本前处理和分离技术（如HPLC,GC,毛细管电泳CapillaryZoneElectrophoresis等），同时有许多检测方法可以根据不同需要选用，如质谱（MS）,紫外可见光吸收（UV–vis）,二极管阵列（diodearray）,荧光检测（fluorescence）等方法。
最常用的理化检测方法是高效液相色谱和联用技术。
高效液相色谱是目前应用比较广泛的一种理化检测方法，它结合气相色谱理论，采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测装置，分离速度快，结合计算机进行自动控制，结果精确。
本实验采用的就是理化分析法中的高效液相色谱法测定。
其敏感度较高，是最常用的检测方法。
2.4高效液相色谱法
2.4.1高效液相色谱法原理
高效液相色谱法（HighPerformanceLiquidChromatography/HPLC）是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固体相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分离。
该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
高效液相色谱的主要类型有：
吸附色谱（AdsorptionChromatography）、分配色谱（PartitionChromatography）、离子色谱（IonChromatography）、亲和色谱（AffinityChromatography）。
2.4.2高效液相色谱法特点
高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点：
①高压：
流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。
②高效：
分离效能高。
可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。
③高灵敏度：
紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。
④应用范围广：
百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
⑤分析速度快、载液流速快：
较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，及气相色谱相比各有所长，相互补充。
高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。
在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。
高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱高效液相色谱法能够比较精确的测定出样品中所含抗生素的含量，计算回收率。
所以本实验采用高效液相色谱法测定抗生素残留量的中国国家标准，并优化其条件，使之能够同时检测不同类的抗生素。
2.4.3ODS柱和固相萃取小柱
ODS柱是一种常用的反相色谱柱，也叫C18柱；是十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。
这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。
由于它是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛。
色谱柱的分类按键合到基质上的官能团可分为：
⑴反相柱：
填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：
C18（ODS）、C8、C4等。
⑵正相柱：
填料是极性的，官能团为－CN氰基、－NH2氨基等。
⑶离子交换键合相：
阳离子官能团：
－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。
阴离子官能团：
―R4N＋季铵基、-氨基等。
本实验使用的为反相柱中的C18柱。
固相萃取主要通过目标物及吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的：
（1）疏水作用力：
如C18、C8、Silica、苯基柱等
（2）离子交换作用：
SAX,SCX，COOH、NH2等
（3）物理吸附：
Florsil、Alumina等
本实验使用C18小柱来进行杂质的吸附。
并且PH对固相萃取有一定的影响：
pH值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。
对于强阳/阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。
而目标物的离子化程度则及pH值有关。
如对于弱碱性化合物来讲，其pH值必须小于其pKa值两个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其pH值必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。
对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。
固相萃取一般有四步：
活化----除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。
（注意整个过程不要使小柱干涸）
上样----将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。
（注意流速不要过快，以1ml/min为宜，最大不超过5ml/min）
淋洗----最大程度除去干扰物。
（建议此过程结束后把小柱完全抽干）
洗脱----用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。
（注意流速不要过快，以1ml/min为宜）
2.5检出限和定量限
HPLC色谱图上的基线并不是一条直线，而是呈现锯齿状，这就是检测器的噪音信号。
通过测定噪音峰峰高及样品峰峰高的的比值，来确定在此系统条件下样品的检出限及定量限。
检出限（LOD）：
流动相中样品组分在检测器上产生三倍基线噪声信号时相当的浓度或质量流量定为HPLC法的检出限。
也就是信噪比为3：
1的时候的样品浓度。
定量限（LOQ）：
流动相中样品组分在检测器上产生十倍基线噪声信号时相当的浓度或质量流量定为HPLC法的定量限。
也就是信噪比为10：
1的时候的样品浓度。
3材料及方法
3.1实验材料和仪器
3.1.1实验材料
试剂：
乙腈（色谱纯），磷酸二氢钠（NaH2PH4·2H2O），土霉素（OTC）标准品，金霉素（CTC）标准品，四环素（TC）标准品，0.1mol/L盐酸溶液，0.01mol/L盐酸溶液，5%高氯酸溶液，甲醇（色谱纯），正己烷，氯霉素（CLP）标准品，乙酸乙酯，磺胺，磺胺二甲嘧啶（SM2），磺胺甲恶唑（SMZ），氟哌酸（FPA）等。
样品：
排酸通脊（购自华润万家），华都鸡胸肉样（购自超市发超市）。
3.1.2实验仪器
主要实验仪器见表2.1。
表2.1主要实验仪器
实验仪器
出品公司
低温离心机
电子天平AB104-N
JB-3型定时恒温磁力搅拌器
冰箱
旋转蒸发仪
高效液相色谱仪（HPLC）
恒温振荡器
超声清洗机
Eppendorfcentrifuge5417R
MettlerToledo
上海雷磁仪器厂
海尔公司
上海亚荣生化仪器厂
岛津SHIMADZU
太仓市实验设备厂THZ-C
宁波新芝生物科技公司SB5200D
3.2实验方法
3.2.1猪肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定
土霉素（OTC）标准溶液：
称取土霉素0.0100g（精确到0.0001g），用0.1mol/L盐酸溶液溶解并定容10.00mL，此溶液每毫升含土霉素1mg。
四环素（TC）标准溶液：
称取四环素0.0100g（精确到0.0001g），用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容10.00mL，此溶液每毫升含四环素1mg。
金霉素（CTC）标准溶液：
称取金霉素0.0100g（精确到0.0001g），溶于超纯水并定容10.00mL，此溶液每毫升含金霉素1mg。
以上标准品均按1000单位/mg折算。
应于4℃以下保存，可使用一周。
混合标准溶液：
取土霉素、四环素标准溶液各1.00mL，取金霉素标准溶液2.00mL，置于10mL容量瓶中，加超纯水至刻度。
此溶液每毫升含土霉素、四环素各0.1mg，金霉素0.2mg，临用时现配。
工作曲线及试样测定：
分别称取7份切碎的肉样（＜5mm），每份5.00g（精确到±0.01g），置于50mL锥形烧瓶中，分别加入混合标准溶液0、25、50、100、150、200、250μL（含土霉素、四环素各为0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0μg；含金霉素0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0μg），加入5%高氯酸25.0mL，于摇床里振荡提取10min，移入到离心管中，以2000r/min离心3min，取上清液经0.45μm滤膜过滤，取溶液20μL进样，记录峰高。
以峰面积为纵坐标，抗生素含量为横坐标，绘制工作曲线，并计算回收率。
色谱条件：
柱：
ODS-C18（5μm）6.2mm×15cm
检测波长：
355nm
柱温：
40℃
流速：
0.8mL/min
进样量：
20μL
流动相：
乙腈+0.01mol/L磷酸二氢钠溶液（用30%硝酸溶液调节PH2.5）=23+77，使用前用超声波脱气10min。
3.2.2猪肉中氯霉素残留量的测定
氯霉素标准储备液：
精确称取0.010g氯霉素标准品，置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
此溶液浓度为0.10mg/mL,置于冰箱中保存，有效期3个月。
氯霉素标准工作液：
精确吸取5.0mL储备液于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。
此溶液浓度10μg/mL，置于冰箱保存。
有效期半个月。
临用前取此液用0.5mol/L高氯酸稀释成适当浓度的标准工作液。
提取：
取200g试样绞碎，称取20g（精确至0.0lg）绞碎后的试样，置于100mL具塞三角瓶中，加人40mL乙酸乙酯，振摇，超声提取30min，过滤，滤液放于另一三角瓶中。
再加人20mL乙酸乙酯于试样中，超声提取15min，过滤，滤液合并，滤渣再加20mL乙酸乙酯超声提取15min，过滤，滤液合并，全部滤液合并转人浓缩瓶中。
净化：
将合并的滤液于52℃-55℃水浴旋转蒸发仪上浓缩至干。
准确加入1.0mL0.5mol/L高氯酸溶液洗涤浓缩瓶中残留物，再加人1mL正己烷，振摇1min，将全部溶液转移至5mL试管中，静置分层，吸弃正己烷层，再加人2ml正己烷提取脂肪，再吸弃正己烷层，高氯酸溶液过0.45μm滤膜，滤液供高效液相色谱测定。
氯霉素标准曲线的制备：
用0.5mol/L的高氯酸溶液，将氯霉素标准储备液稀释为10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、
升级会员 