微生物实验讲义.docx

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微生物实验讲义

实验二细菌染色观察（2学时）

一、实验目的

1、巩固显微镜的使用和细菌的涂片方法

2、掌握细菌的单染色和革兰氏鉴别染色技术

二、实验内容

1、细菌单染色

2、革兰氏染色

三、原理

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。

碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。

因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。

酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。

中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

染色种类：

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。

复染色是用两种或两种以上的染料，常用于鉴别微生物，如革兰氏染色、芽孢染色和抗酸染色等。

负染色：

使微生物背景着色，如细菌荚膜染色。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

四、操作

（一）单染色

1、涂片（直径1厘米左右）；

2、干燥：

自然干燥或在酒精灯上方；

3、热固定：

使细胞质凝固，杀死微生物，固定细胞形态，使细胞固定在载玻片上。

涂菌面朝上，通过火焰2－3次，涂片反面以不烫手为宜，温度过高会破坏细胞形态；

4、染色：

约2分钟，期间不要使染液干涸；

5、水洗：

不要直接冲洗涂面（滴下水无色为止）；

6、干燥：

自然干燥或吸水纸洗干（不要擦掉菌体），完全干燥后镜检。

（二）革兰氏染色

1、涂片：

混合涂片

2、晾干：

同简单染色法。

3、固定，与简单染色法相同

4、结晶紫色染色：

加适量（以盖满细菌涂面）结晶紫染色液染色1分钟。

5、水洗：

倾去染色液，用水小心地冲洗。

6、媒染：

滴加卢哥氏碘液，媒染1min。

7、水洗：

用水洗去碘液。

8、脱色：

将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至载玻片下沿流出液无色，立即水洗。

9、复染：

滴加蕃红复染2min。

10、水洗：

用水洗去涂片上的蕃红染色液。

11、晾干：

将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。

12、镜检：

镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

革兰氏阳性菌：

染成蓝紫色；

革兰氏阴性菌：

染成（浅）红色

注意事项

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。

如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。

2.涂片过厚，可造成脱色不完全而成假阳性。

3、染色过程中勿使染色液干涸。

用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

4、菌龄：

G+菌如白葡萄球菌，培养时间不超过24h，E.coli培养24h。

若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。

实验报告

1、绘出革兰氏染色两种细菌的形态图，注明染色结果；

2、回答相关思考题。

思考题：

1、固定的作用，应注意那些问题？

2、为何制片完全干燥后才能用油镜观察？

3、革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？

在什么情况下可以采用？

实验三细菌特殊结构

一、实验目的

1、掌握细菌芽孢的染色方法

2、了解常用的几种特殊染色在微生物形态分类中的重要性

二、实验内容

1、细菌的芽孢染色

三、原理

细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色（芽胞呈无色透明状）。

芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。

所有的芽胞染色法都基于同一个原则：

除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。

当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。

然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。

四、操作——Schaeffer-Fulton氏染色法

1、制片

按常规涂片、干燥、固定

涂片应偏向载玻片一端，取菌不宜太少，因部分或大部分菌芽孢未形成

2、染色：

（1）加数滴5%孔雀绿染液于涂片处（染料以铺满涂片处为度），用竹夹夹住载玻片一端，在酒精灯火焰上加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5min。

加热时温度不能太高，期间要随时添加染液，切勿让标本干涸。

（2）水洗：

待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水无色为止。

（3）复染：

用蕃红液染色2min。

（4）水洗后晾干或吸干。

（5）镜检：

先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。

染色结果：

芽胞呈绿色，菌体为红色。

五、实验报告

1、绘图表示芽孢杆菌的形态特征，注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊形状。

2、回答思考题P33（3）。

实验四放线菌形态观察（2学时）

一、实验目的

1、了解放线菌的形态结构

2、学习放线菌的观察方法

二、实验原理

放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。

紧贴固体培养基表面或深入培养基内部生长的叫基内菌丝（基丝），基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝（气丝），并进一步分化产生孢子丝及孢子。

有的放线菌只产基丝而无气丝。

光镜下直接观察时，气丝在上层，较粗且色暗，基丝在下层，较细且较透明。

孢子丝依种类不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。

油镜下观察，孢子有各种形状。

扦片法：

将放线菌接种在琼脂平板上，扦上灭菌盖玻片培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。

观察时，用镊子取出盖玻片放在洁净的载玻片上直接观察。

三、实验内容

1、观察插片法培养放线菌的形态结构

2、观察放线菌装片

三、操作步骤

1、扦片培养（教师提前做好）

2、镜检用镊子小心拔出盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦掉，然后将有菌的一面朝上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。

注意：

光线宜暗些便于观察。

3、染色装片观察。

四、实验报告

绘图说明所观察到的放线菌的主要形态。

实验五霉菌的形态观察（2学时）

一、实验目的

1、了解霉菌的形态结构

2、学习霉菌的观察方法

二、实验原理

霉菌菌丝也分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。

许多分枝的菌丝相互交织在一起称菌丝体。

霉菌菌丝的直径比放线菌约粗几倍到十几倍，用低倍镜即可观察。

用乳酸石炭酸棉蓝染液制成的制片特点是：

细胞不变形；具防腐作用，不易干燥，可长时间保存；能防止孢子飞散；染液的蓝色能增强反差，便于观察；必要时用树胶封固制成永久装片。

三、实验内容

1、霉菌的直接制片观察

2、根霉、毛霉、曲霉、青霉的装片观察

44四、操作步骤

1、直接装片观察

（1）根霉、毛霉、曲霉、青霉2－5天马铃薯琼脂培养物（教师准备）。

（2）在载玻片上加一端乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50％乙醇浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的溶液中，用解剖针小心将菌丝分散开。

盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜。

2、染色装片观察

在低倍镜下（必要时换高倍镜）观察根霉、毛霉、曲霉、青霉的染色装片。

五、实验报告

绘图说明四种霉菌的形态特征。

实验六酵母菌形态观察及死活细胞鉴别（2学时）

一、实验目的

1、了解酵母菌的形态和无性繁殖方式

2、掌握活细胞染色观察微生物的方法

二、实验内容

1、酵母菌的活细胞染色

2、压滴法观察统计酵母菌的死亡率

三、原理

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，大多数酵母以出芽方式行无性繁殖，有的分裂繁殖，有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。

美蓝是一种无毒性的染料，其氧化型呈蓝色，还原型为无色。

用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，因细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。

因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，故可通过美蓝染色来鉴别酵母菌是死细胞还是活细胞。

四、操作

1、在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作用接种环取少许少量酵母菌苔放在溶液中，混合均匀。

注意取液不要过多或过少，防止溢出或产生气泡。

2、用镊子取一块盖玻片，先将其一边与菌液接触，然后慢慢放下使其盖在菌液上。

注意不能平着放下，以免产生气泡，如菌液太多，可用滤纸吸去多余菌液。

3、将制片放置约3分钟后镜检，遵循先低倍镜而后高倍镜的顺序观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区分死活细胞。

依据下式计算死亡率（一个视野）：

死亡率（％）＝死细胞数/细胞总数×100

芽出率（％）＝出芽细胞数/细胞总数×100（不作统计）

◆肝糖拉观察：

将一滴碘液置于载玻片中央，挑少许酵母菌苔，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的肝糖粒呈深红色。

注意须在营养丰富培养基上培养的酵母，在光镜下观察到的是一片红色。

五、实验报告

1、绘制所观察到的酵母菌形态图

实验七、微生物大小测定（3学时）

一、实验目的

掌握用测微尺测定微生物细胞大小的方法

二、微生物大小测定原理

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。

用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10mm长度刻成100等分。

测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中间像重叠）来测量经显微镜放大后的细胞物象。

由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。

校正时，将镜台测微尺放在载物台上，

由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。

三、实验内容

1、目镜测微尺的标定

2、酵母菌的测定

四、操作

1、目镜测微尺安装

将目镜测微尺刻度朝下放在镜筒内隔板上，旋上目镜透镜，插入镜筒内（已装）。

2、镜台测微尺刻度面（数字）朝上，置于载物台上。

3、校正

先用低倍镜观察，调节焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推进器，使两尺在某一区域内两线完全重合，分别数出两重合刻度线之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。

然后由下列公式算出目镜测微尺每格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度（μm）＝两重合线间镜台测微尺格数×10

两重合线间目镜测微尺格数

将目镜测微尺标定结果填入后面表格

（1）中。

注意：

（1）镜台测微尺有刻度一面须朝上放置，如放反无法对焦。

（2）视野必须暗些，否则难找到镜台测微尺的刻度线。

（3）换高倍镜和油镜时要小心，防止与镜台测微尺碰撞损坏镜头。

4、菌体大小测定

（1）水浸片的制做

（2）酵母菌的测量（长径×短径）

（3）要测定10个细胞并且在读数时估读半个格。

将镜台测微尺和菌体测定结果填入相应的表格中。

五、实验报告

1、目镜测微尺的校正结果；

2、菌体的测量结果；

3、回答P51思考题

（1）、

（2）。

实验八、微生物数量测定（3学时）

一、原理

测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。

菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（PetrofHausser）细菌计数板。

两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。

而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：

一种是计数区分为16个中格（中格用三线隔开），而每个中格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中格（中格之间用双线分开），而每个中格又分成16个小方格。

但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。

盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。

细胞数/ml＝80小格内的细胞数/80×400×1000×10×菌液稀释倍数。

二、操作

1、取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

3．将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，由盖玻片的下边缘摘入一小滴，让菌悬液沿缝隙靠毛细渗透作用进入计数室，勿使气泡产生，

4．静置约5分钟，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数室，再转换高倍镜观察并计数。

由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度，否则不易看清计数室方格线。

5．计数室由25个中格组成，除了要数四个角上中格内的菌数外，还需数中央l个中格的菌数（即80个小格）。

如菌体位于方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

6．每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作）。

7．计数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。

洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

三、实验报告

1、报告计数结果

2、回答P92思考题

（1）。

实验十

（一）培养基的配制及灭菌

一、实验原理（略）

二、培养基配制

（一）牛肉膏蛋白胨培养基

1、称药品（一组配1000毫升，另一组配500毫升）

2、溶化

将上述药品放入搪瓷缸中，加入少于需要量的水，溶化后补足水。

3、调pH

4、分装：

一组分装试管，装量不超过试管高度的1/5，另一组分装三个500毫升锥形瓶。

5、加棉塞及包扎，注明培养基名称、组别和日期。

6、灭菌：

0.1MPa，121℃、20分钟。

7、摆斜面。

8、无菌检查37℃温箱培养24h，无菌生长即可使用。

（二）高氏1号培养基

1、称量和溶化（一组配1000毫升，另一组配500毫升）

称取的可溶性淀粉先放入小烧杯中，用少量冷水调成糊状，再加至少于所需要水量的沸水中，继续加热，直至淀粉完全溶化，再将其它成分依次逐一溶化。

1%FeSO4●7H2O（教师配制）加量（1ml/1000ml培养基）

2、其余步骤同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

（三）马丁氏培养基

1、一组配1000毫升，另一组配500毫升

2、链霉素的加入，链霉素受热易分解，故临用时，将培养基溶化后待温度降至55℃左右时再加入。

可先配制成1％的溶液（保存于－20℃），加量为0.3ml/100ml培养基。

3、其余步骤同牛肉膏蛋白胨培养基配制。

二、其它器皿的准备

1、试管，内装无菌水9.0毫升，4只管/每5人组；

2、50毫升锥形瓶，内装无菌水49.5毫升（铺满玻璃珠）

3、2.0毫升移液管5只/每5人组（示范加棉塞）。

4、培养皿15套/每5人组

5、玻璃涂布器

实验十酸奶制作（4学时）

一、实验目的

1、学习酸奶制作方法

2、了解发酵的一般原理

二、实验原理

酸奶是以脱脂乳粉或牛奶为原料，经乳酸菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品。

奶中的乳糖经乳酸菌发酵产生乳酸使得pH下降，当pH下降到4.7以下时，牛奶中的酪蛋白发生凝固而使奶液成凝乳状态（牛奶中含蛋白质大约为3％，酪蛋白占其总量的85％，等电点是4.7）在发酵过程中还产生一些风味物质，如乙醛、二乙酰等，这些风味物质与加入的蔗糖共同构成酸甜可口，具有独特口味的酸奶。

酸奶按照凝固状态分为凝固型酸奶和搅拌型酸奶，本实验是制作凝固型酸奶。

三、实验内容

1、酸奶制作

2、酸奶质量品评鉴定

四、实验步骤

1、培养基制备

鲜牛奶，在85℃下灭菌10min，加入蔗糖使成浓度8％，冷却至42℃。

2、接种市售酸奶，接种量10％。

3、分装灭菌后的奶瓶，每瓶装量约200ml，取灭过菌的方纸封口，用橡皮筋捆扎。

4、发酵前发酵42－43℃，3－6h，凝乳后转入后发酵。

后发酵（后熟）2－5℃，12－24h。

5、品尝鉴定

从凝乳情况、口感、香味和异味等方面给予评价。

实验十二大肠杆菌营养缺陷型的筛选

一、实验目的

了解微生物诱变育种的基本方法，重点掌握紫外线、5-溴尿嘧啶在诱变中的应用以及营养缺陷型的诱变、浓缩、分离筛选与鉴定的方法。

二、实验材料

大肠杆菌（E.coli）斜面菌种。

细菌基本培养基、LB培养基（固体和液体）、PB缓冲液（pH7.0）、氨苄青霉素、氨基酸、碱基混合物。

台式离心机、多用振荡器、磁力搅拌器、紫外灯（30W）等。

三、实验步骤

（一）细菌悬液的制备

取一环大肠杆菌（E.coli）斜面菌种划线接种在LB固体平板上，37℃培养12—16h，挑取单菌落接入装有3mLLB液体培养基的试管中，37℃，200r/min培养12-16h，取此培养液0.5mL，接入含有50mLLB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min培养2-4h（培养至对数期），将培养液离心（3000r/min,10min）弃上清液，菌体用PB离心洗涤两次（离心条件同前），最后用PB悬浮细胞，菌落计数器计数，使细胞浓度控制在107-108/mL。

（二）诱变处理

取上述悬浮液2mL于小培养皿（直径6cm，内含搅拌子）中，将培养皿放置在磁力搅拌器上，在搅拌状态下接受紫外线照射2-5min（紫外灯30W，距离30cm），照射完毕立即离心，收集细胞，并避光保存。

（三）营养缺陷型的浓缩

将上述处理过的细菌细胞接入含有50mLLB培养基的250mL三角瓶中，37℃，200r/min培养2-4h，离心收集细胞，并用基本培养基洗涤两次，用4mL基本培养基悬浮细胞，取2mL细胞悬液接入50mL含有氨苄青霉素（终浓度20-60μg/mL）的基本培养基中，37℃，200r/min培养3-4h，离心，取沉淀，用PB洗涤两次后用PB制成细胞悬液，并用PB适当稀释，取100-200μL稀释涂布LB固体平板，37℃，培养12-16h。

（四）营养缺陷型的挑选

将LB平板上形成的每个菌落用无菌牙签分别点种在基本培养基和LB固体培养基的相应位置上，37℃培养12—16h。

将在LB培养基上生长而在基本培养基上不生长的菌落继续接种在基本培养基和LB固体培养基的对应位置上，如此传代5-6次，最后在LB上生长而在基本培养基相应位置上不生长的菌落即可确定为营养缺陷型。

（五）营养缺陷型的鉴定

把挑出的缺陷型用PB悬浮制成菌悬液（106-108/mL），取100-200μL涂布在固体基本培养基的表面，待表面干燥后，在标定位置上放置少量氨基酸、碱基或维生素的结晶（或滤纸片），37℃，培养12-16h。

缺陷型在所需的化合物周围出现浑浊的生长圈。

现一般把几种化合物编为一组，按下表进行测定。

营养缺陷型检测分组表

组别

化合物代号

A

B

C

D

E

F

17891011

2712131415

3812161718

4913161920

51014171921

61115182021

按上表可在一个培养皿上测定出一个营养缺陷型菌株对21种化合物的需要情况。

若在C组化合物的周围出现生长圈，则这一缺陷型缺少化合物3；若在C组和D组位置周围都出现生长，则这一缺陷型所需要的化合物是16.；若在C组和D组之间出现生长，说明这一缺陷型同时需要C、D这两组化合物中的各一种，具体是哪两种，尚需进一步鉴定。

四、注意事项

1、紫外诱变后要避光培养。

2、操作的各环节要无菌操作。

实验十三微生物实验技能评定（2学时）

一、测试目的

1、考察学生显微镜使用的熟练程度

2、考察学生无菌操作的正确性

二、测试内容

1、细菌的单染色

2、革兰氏染色

3、显微镜使用

三、评定方法及标准（见评分细则）