则：
Ax=εbcx
As=εbcs
ΔＡ＝Ａx－Ａs=εb（cx－cs）=εbΔc
测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔＡ。
ΔA＝Ax－As=εb（cx－cs）=εbΔc
测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔA。
示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系。
由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx：
cx=cs+Δc
示差法标尺扩展原理
普通法：
cs的T=10%；cx的T=5%
示差法：
cs做参比，调T=100%
则：
cx的T=50%；标尺扩展10倍
11、紫外-可见光谱在生物系统中的应用
（1）氨基酸、蛋白质的吸收特性
大部分氨基酸在230．310nm范围内没有吸收，只有芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和含硫的氨基酸在此范围内有吸收.
对于蛋白质来说，在波长大于250nm的范围内，所测得的吸收主要来自芳香氨基酸；
在210～250nm范围内，主要的吸收除了来自芳香氨基酸外，还来自组氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸。
胱氨酸、半胱氨酸中的二硫键基团在230～270nm范围内有吸收，
在185～230nm的范围内还有很强的吸收，而蛋白质和多肽除了表现出氨基酸的吸收特性外，蛋白质和多肽中的肽键在180～230nm范围内也有强吸收。
在波长小于210nm的范围内，吸收主要来自多肽主链，由肽键产生的190nm左右的吸收强度大约相当于芳香氨基酸在280nm的吸收强度的100倍。
（2）核酸的吸收特性
核酸中的生色团是碱基，组成核酸骨架的核糖和磷酸的跃迁需要的能量更高。
核酸的吸收谱与其中的各种碱基之间的相互作用有很大关系。
核糖核酸和脱氧核糖核酸被相应的酶水解后，吸光度都会增加。
利用这一现象，可以测定DNA和RNA混合物中DNA和RNA的含量。
（3）过渡金属复合物的紫外一可见吸收谱
过渡金属复合物的紫外一可见吸收谱可以用d—d跃迁来解释，吸收峰位和峰强度不仅取决于过渡金属本身，还与金属的配基及空间配位的情况有关。
（4）用紫外—可见吸收光谱测量蛋白质和核酸等生物大分子的浓度
紫外—可见吸收光谱是蛋白质和核酸定量分析的一种很方便的方法，在生化研究中已经成为最常规的工具。
蛋白质的浓度测量通常是测量样品在280nm处的吸光度（A280），如果280nm处的摩尔消光系数ε280已知，就可以由A=εCI得到蛋白质的浓度。
蛋白质的A280主要是由于色氨酸和酪氨酸侧链的吸收，因此知道了ε的大小，也就知道了单位长度的蛋白质中色氨酸和酪氨酸残基的数目。
常规制备的蛋白质中常常含有核酸，利用紫外吸收光谱可以测量核酸／蛋白质复合物中蛋白质和核酸的量。
蛋白质和核酸在280nm和260nm处都有吸收峰。
但是蛋白质在280nm处吸收更强，而核酸在260nm处的吸收更强。
由此存在关系式：
蛋白质浓度（mg／mL）=1.55A280-0.76A260
A280和A260分别是溶液在280nm和260nm处的吸收度。
如果蛋白质中混有20％的核酸，或是浑浊样品，这种方法的测量误差是比较大的。
许多其他的生物分子，如不同的维生素分子，也往往有它们的特征紫外—可见吸收光谱，利用与蛋白质、核酸浓度测量类似的原理，也可以测量其他生物分子的浓度。
（5）用紫外—可见吸收光谱研究生色团的环境
由于生色团所处的环境可能会引起电子能级之间的差值以及发生能级间跃迁的概率改变，因此吸收峰位入max和相应的吸收峰强度εmax对环境都比较敏感。
虽然这种对环境的敏感性对定量分析不太有利，但对于用电子光谱探测生色团的环境还是比较有利的。
一般来说，一个比较疏水的环境会使生色团的吸收峰向长波方向移动即发生红移。
生物大分子结构发生变化时，其中的生色团所处的环境也会发生变化。
因此，对于生色团所处环境的探测，也可以得到生物大分子结构的相关信息。
蛋白质所处环境的pH值发生变化时，蛋白质表面可电离的氨基酸残基离解的情况可能发生变化，相应氨基酸残基的吸收谱也因此而变化，根据这些残基吸收谱的变化，可以得到这些氨基酸残基解离时的pK值，并从中得到这些氨基酸残基在蛋白质中所处位置的信息。
（6）用紫外—可见吸收光谱研究生物大分子的构象变化
生物大分子所处环境发生改变时，如pH值、温度等，其构象可能发生改变。
蛋白质构象发生变化时，生色团所处的环境发生变化，由此而产生的吸收光谱参数的变化可以作为构象变化的一个指示，即这种构象的变化可能通过吸收谱的变化表现出来。
除了生物大分子内生色团的紫外—可见吸收光谱外，过渡金属“生色团”也可以提供一定的结构变化信息，前提是所研究的体系内天然存在过渡金属离子或者是能够加入过渡金属离子作为探针。
通过比较所研究的含过渡金属离子的蛋白质与已知空间结构的模型化合物的吸收谱，可以得到相关的结构信息
由于差吸收光谱突出了吸收光谱的变化，因此常常用来研究生物大分子构象的变化。
（7）用紫外—可见吸收光谱研究生物分子及其配基的结合
生物大分子与其配基的结合，如酶与底物、抗体与抗原、受体与配基的结合等会使结合部位附近生物大分子或配基内的生色团吸收谱参数发生变化。
从生色团吸收光谱的变化，不仅可以判断生物大分子的结合部位附近有什么生色团存在，而且可以得到结合情况的信息。
（8）生化反应动力学的研究
如果某生化反应过程中一种反应物的浓度发生改变，则可以利用紫外—可见吸收光谱研究反应进行的快慢即反应的动力学。
二、荧光光谱
1、影响荧光强度的外部因素
（1）溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；
（2）温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。
（3）溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
（4）内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：
溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：
化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
（5）溶液荧光的猝灭
荧光熄灭：
荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。
荧光熄灭剂：
这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。
①碰撞熄灭：
与分子的直径、粘度、温度等因素有关。
②能量转移熄灭
③氧的熄灭作用
④自熄灭与自吸收：
当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭（浓度熄灭）
2、测量荧光的仪器主要由四个部分组成：
激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。
特殊点：
有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
问题：
紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？
（1）.样品池的材料：
与紫外-可见分光光度计的吸收池一样
（2）.吸收池的形状：
紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光
荧光分光光度计的样品池四面透光
（3）.使用注意事项：
波长范围，容易破碎，沾污问题
4、同步扫描技术
根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差（∆λ）和固定能量差及可变波长三种；
同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；
合适的∆λ可减少光谱重叠；
5、荧光分析方法
（1）特点
①灵敏度高
比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；
检测下限：
0.1～0.1μg/cm-3
相对灵敏度：
0.05mol/L奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
②选择性强
既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；
③试样量少
④提供比较多的物理参数：
激发光谱、发射光谱、荧光强度、荧光效率、荧光寿命等
（2）缺点：
应用范围小。
6、荧光分析在生物学中的应用
（1）天然荧光物质的应用：
生物学中比较重要的天然荧光分子多属具有共轮双键的系统。
如芳香氨基酸、核黄素、维生素A、卟啉、叶绿素、NADH和tRNA中的Y碱基（二氢尿嘧啶）等。
对于含有这些天然荧光物质的样品，可以直接通达量测其荧光来确定其存在，分布及数量。
①蛋白质的内源荧光;
利用蛋白质的内源荧光检测蛋白，其灵敏度高于紫外吸收法。
蛋白质的荧光来自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，它们的相对荧光强度为100:
9:
0.5。
检测蛋白质的天然荧光，可采用280nm的激发波长，发射波长范围在300-350（蛋白溶液为中性时）。
如果蛋白中不含色氨酸，只含苯丙氨酸和酪氨酸（称为A类蛋白质），则荧光光谱主要表现酪氨酸的特征，最大发射波长约为304nm。
对于含有色氨酸的蛋白（称为B类蛋白质），荧光光谱则主要表现色氨酸的特征，最大荧光发射在320-350nm之间。
对于蛋白质的荧光激发谱，至今仍然应用得不够充分。
有些问题直到现在仍不太清楚。
例如激发谱中位于230－245nm之间的峰，有人（S.V.Konev,1957）认为是蛋白质肽键的吸收了能量，并在一定条件下把能量转移给了芳香氨基酸。
但这一看法似乎并未得到普遍的认可。
利用蛋白质的天然荧光，可以检测蛋白质的结构变化。
如氨基酰化酶在十二烷基硫酸锂作用下内源荧光发射谱随作用时间的变化。
随作用时间的增加，荧光强度逐渐减小，表明随作用时间的增加，该蛋白质逐渐变性，发生去折叠，蛋白质内部的荧光生色团逐渐暴露在极性水环境中。
②天然色素的内源荧光分析:
维生素大多含有芳香环结构，本身具有较强的天然荧光，因此可以利用内源荧光检测维生素。
例如，可用345nm激发，490nm处测量，确定血液中维生素A的含量。
核黄素即维生素B2在pH7.0时，用激发波长370nm（或440nm），发射波长为565nm检测。
维生素B12在pH7的溶液中，可以用275nm激发，305nm处检测。
维生素C用490nm激发，可产生绿色荧光（530nm）。
植物、藻类或光合细菌中含有各种色素和辅助色素分子，包括叶绿素a、b、c1、c2，类胡萝卜素如β-胡萝卜素、岩藻黄质、多甲藻黄素，藻胆素如藻蓝素、藻红素等，它们都含有荧光生色团，它们的荧光激发谱和荧光发射谱都可用来鉴定色素的存在及含量，也可以用来分析光合作用过程中能量的吸收与传递。
因此，光合系统中色素内源荧光是研究光合作用的一个非常重要的信息来源，荧光光谱仪因而也就成了植物生理学家的“听诊器”，一些专用的荧光仪可以方便地携带到田间直接测量作物叶片的光合效率。
（2）外源荧光物质的应用：
由于天然荧光分子种类有限，在生物学和医学的实际中，应用得更加广泛的是荧光探针，即外源荧光技术。
目前，荧光探针的种类已经成千上万，人们可以根据所研究问题的不同，选择不同的荧光探针。
①蛋白质的荧光探针：
共价标记：
有些荧光探针可以与蛋白质上特定的基团共价结合，例如胺基（amine）和巯基（thiol）就是蛋白质中容易结合的两种基团。
蛋白质和肽中的半胱氨酸残基含有巯基，胱氨酸还原时也能形成巯基，
此外，也可以用化学方法将巯基引入蛋白质、核酸和脂。
如卤代乙酰类衍生物、顺丁烯二酰亚胺及其它一些巯基反应剂，可以和巯基共价结合；异硫氰酸盐如FITC（Fluoresceinisothiocyanate），琥伯酰亚胺酯（succinimidylesters），羧酸（carboxylicacid），磺酰氯（sulfonylchloride）等，可以和氨基共价结合。
非共价标记：
另外有一些荧光探针可以和蛋白质非共价结合。
例如：
1,8-ANS（1-氨基-8-萘磺酸酯）在水中基本不发荧光，但当结合到一些蛋白质上时，可以发出很强的荧光。
藻胆蛋白（phycobiliprotein）是在光合蓝藻和红藻中发现的天然荧光色素家族，近年来已经成为一类新型荧光探针，广泛应用于免疫荧光分析和标记各类配体。
利用蛋白质的荧光标记方法，可以研究荧光探针标记的部位微环境的极性、结构、分子运动、结合紧密程度等。
也可以利用共振能量转移原理测定基团之间的距离等。
利用荧光探针研究蛋白质结构的变化：
由于荧光探针的荧光谱对环境变化十分敏感，因此它对蛋白质分子的构象变化也就十分敏感。
利用荧光探针研究了许多酶的变化效应。
例如用DNS-Cl标记的DNS-GDH（GDH，谷氨酸脱氢酶）在有辅酶存在时的荧光光谱与没有辅酶时相比，有明显变化，表明辅酶的存在会引起GDH构象的变化。
外源荧光团标记到蛋白质上以后，也可以通过荧光偏振来检测蛋白质构象的变化。
结构变化后，蛋白质分子的运动会发生变化，从而引起荧光偏振度的变化。
研究生物分子的结合程度：
在生物学中，抗体和抗原，酶和底物，药物与受体等分子间的结合，是研究生物活性的重要内容。
生物分子结合时，标记在其中的荧光探针的荧光参数会随之改变。
通过这些参数的变化，就可了解它们结合的牢固程度，例如，结合得牢固的分子，结合后的复合物弛豫时间长，荧光偏振也就大。
如果结合得较为松散，则复合物的弛豫时间短，荧光偏振就小。
又例如，用荧光探针标记的抗原与抗体反应，由于抗原-抗体复合物的迁移率小于原来的迁移率，因此荧光偏振就增加。
利用这种办法，可以检测免疫反应的发生与否。
并进一步研究免疫反应的机制。
在底物与酶结合时，荧光标记的底物由于与酶的结合迁移率减小，偏振度增加。
因此，可以由荧光偏振度的变化来得到结合常数的信息。
②核酸的荧光探针：
由于碱基和核酸量子产率很低，因此常常需要利用荧光探针来标记核酸，达到检测核酸的目的。
有一类荧光探针可以透过细胞膜，因此这类探针既可用于活细胞核的荧光染料，又可作为固定后的细胞核的染色。
另一类荧光探剂不能透过完整的细胞膜，这类探剂可以用来标记固定后细胞的核，也可用来鉴定细胞的活性。
有些用来标记核酸的荧光染料，检测DNA的灵敏度可高达皮克量级。
吖啶橙：
AcridineOrange,AO是三环杂芳香环类染料，既可以标记DNA，又可以标记RNA。
通过嵌入核酸双链的碱基对之间
升级会员 