红枣酒活性成分在发酵过程中的变化研究大学本科毕业论文.docx

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红枣酒活性成分在发酵过程中的变化研究大学本科毕业论文

编号1151507132

毕业论文

（2015届本科）

题目：

红枣酒活性成分在发酵过程中的变化研究

学院：

农业与生物技术学院

专业：

葡萄与葡萄酒工程

作者姓名：

王克阳

指导教师：

焦扬职称：

副教授

完成日期：

2015年6月10日

二○一五年六月

河西学院本科生毕业论文（设计）诚信声明

本人郑重声明：

所呈交的本科毕业论文（设计），是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

本科毕业论文（设计）作者签名：

二〇一五年六月十日

第一部分摘要1

附件3：

农业与生物技术学院指导教师指导毕业论文情况登记表

第一部分

摘要

摘要：

为了研究红枣果酒在不同条件下（果胶酶的添加量、酶解的温度、酶解的时间、可溶性固形物、SO2的添加量、酵母的添加量和发酵的温度）发酵过程中的活性成分的变化，以临泽红枣为原料，采用Plackett-Burman设计法和响应面分析法对主要影响因素进行优化。

通过筛选设计及响应面分析，实验表明：

果胶酶的添加量、初始SO2的添加量、发酵的温度对红枣酒多糖和多酚的影响较显著。

通过最陡爬坡及Box-Benhnken实验对关键因素进一步优化，分析出：

果胶酶的添加量2.5g/L、SO2的添加量45mg/L、发酵的温度22℃为红枣果酒酿造工艺的最佳条件。

关键词：

红枣果酒；酿酒条件；多酚；多糖；Plackett-Burman设计法和Box-Benhnken实验

Activeingredientsinredwinefermentationprocessofchangestudy

Abstract

Abstract：

Inordertostudytheredjujubefruitwineunderdifferentconditions（pectincontentofenzyme,theenzymesolutiontemperature,andthetimeandthecontentofsolublesolids,SO2,theaddingofyeastandfermentationtemperature）changesoftheactiveingredientintheprocessoffermentation,asrawmaterialsofjujubeinlinze,Plackett-Burmandesignandresponsesurfacemethodologytooptimizethemaininfluencingfactors.Filterdesignandresponsesurfaceanalysis,experimentsshowedthatpecticenzymecontent,initialSO2addition,fermentationtemperatureforredwineeffectofpolysaccharidesandpolyphenols,morenotable.ThroughthesteepclimbingandBox-Benhnkenexperimentsonakeyfactortofurtheroptimize,analyze:

Pectinaseaddition2.5g/L,45mg/LSO2addition,fermentationtemperature22℃thebestconditionforjujubefruitwinebrewingprocess.

Keywords：

Redjujubefruitwine;Vintagecondition;PolyphenolsandPolysaccharides;Plackett-BurmanmethodandtheBox-Benhnkenexperiment

第二部分正文

红枣酒活性成分在发酵过程中的变化研究

引言

甘肃种植枣树历史悠久，位于河西走廊中部的临泽，房前屋后、路旁田埂，旷野荒滩种的都是枣树（邹天福2006），临泽枣虽然不大，但其色泽、肉细、含糖量高、无虫蛀而闻名遐尔。

临泽红枣具有极高的营养保健价值，有“百果之王”、“天然维生素”的美誉，红枣中除含大量果糖、葡萄糖外，还含有低聚糖和多糖，红枣营养丰富，据测定：

鲜枣含糖24%，蛋白质1.2%，脂肪0.2%，还含有钙、磷、铁等矿物质，是集药、食、补三大功能为一体的保健果品（刘孟军2009）。

民间也有“日食三枣，长生不老”之说，红枣历来深受广大群众的喜爱。

红枣除鲜食外，还可晒制干枣，加工制成蜜枣、熏枣，脆枣、酒枣等。

我国红枣栽培历史悠久，资源丰富，但目前红枣的加工方式落后，产品形式单一，附加值低（纪庆柱2008）。

在红枣的品质、科技含量，外观包装方面都存在缺陷，影响产品的价格和销售（张立树等2013）。

为了充分发挥红枣资源优势，以红枣为原料开发研制红枣果酒，不仅可以丰富市场上果酒产品的种类，还具有广阔的市场前景，能带来可观的效益。

纯粹的发酵枣酒和其它果汁与枣汁一同发酵的果酒的生产工艺多是仿照葡萄酒的生产工艺建立的（苑学习和张丽颖1993）。

现代亟需发展的枣酒是红枣破碎制浆后经低温发酵和陈酿而成的低酒精度果酒饮品（沈莞绅和冯谦1990）。

这种枣酒保留了红枣特有的风味和原有的营养成分，是一种特色高档滋补果酒（赵霖1998），在以后会受到大众的喜爱。

红枣多糖和多酚是其两类主要保健功能成分（林静雅2012）。

多糖和多酚类物质具有明显的生理和药理活性，现代医学研究证明经常食用富含它们的食物能够预防由活性氧导致的相关疾病：

癌症、糖尿病、肥胖症等（张文2002）。

但在枣酒的加工中，多酚和多糖的含量及其功能变化的规律尚未被人们认识。

因此，本文将多酚和多糖变化动态作为主要内容，旨在找出枣酒加工过程中影响多酚和多糖变化的主要因素，为枣酒工艺优化提供依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

红枣临泽红枣，要求个大均匀、无病虫害、无腐烂；高台美乐酿酒葡萄，要求个大均匀、无病虫害、无腐烂。

果胶酶（天津市利华酶制剂技术有限公司），活性干酵母（上海康禧食品饮业有限公司），白砂糖（市售，符合GB317.1-1998，一级）。

手持糖量计（泉州光学仪器厂），离心机（型号：

TGL-16G，上海安亭科学仪器厂），分光光度计（型号：

722型可见分光光度计，厂址：

上海光谱仪器有限公司），pH计（型号：

pHS-3C酸度计，厂址：

成都世纪方舟科技有限公司），数显恒温水浴锅（型号：

HH-8恒温水浴锅，厂址：

国华电器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（型号：

DHG-9246A，厂址：

上海科学仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1红枣酒工艺流程

葡萄→挑选、破碎→果浆

↓

红枣→清洗、浸泡、烘烤、脱核→破碎→果浆→混合浆→酶解→主发酵→分离→低温处理→陈酿

↑

加果胶酶、（加糖）、SO2处理、加干酵母

1.2.2红枣原料的预处理处理

红枣：

去杂、清洗、沥干后，可稍加烘烤。

烘制温度100℃，烘制以枣肉收缩、枣皮微绽、不发生焦糊现象至有枣香散出。

葡萄：

挑选颗粒完整的无病害的葡萄，出去葡萄梗，清洗干净，备用。

1.2.3工艺说明

1）枣与葡萄混合后，体积不到200mL时需补加水；

2）添加果胶酶后，酶解的温度为45℃，酶解的时间为12h左右，要过夜；

3）酵母的添加的量为0.8g/L，酵母需活化后再添加。

1.3实验内容

1.3.1单因素预试验

首先，对红枣进行烘烤与不烘烤两种预处理，葡萄进行去皮与不去皮两种预处理，选择红枣：

葡萄：

水=1:

4:

5的比例混和得到四种混合浆，在相同的条件下进行发酵。

然后，在前一次试验的基础上，选择烘烤的红枣与不去皮的葡萄，选择红枣：

葡萄：

水分别按照不同比例（1:

5:

4，2:

5:

3，2:

4:

4，3:

5:

2，3:

4:

3，3:

3:

4）混合得到六种混合浆，在相同条件下进行发酵。

1.3.2Plackett-Burman（PB）设计

Plackett-Burman试验就是筛选试验设计，主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于响应变量的显著影响，采用的试验设计方法，主要通过对每个因子取两水平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性。

本次试验选择果胶酶的添加量、酶解的温度、酶解的时间、可溶性固形物、SO2的添加量、酵母的添加量和发酵的温度七个发酵条件为影响因子，每个因素取高低2个水平（-11），用DesignExpert8.0软件进行实验设计见表1。

表1Plackett-Burman设计各因素与水平

因子

水平

-1

1

A

果胶酶的添加量（g/L）

1.0

5.0

B

酶解的温度（℃）

20

50

C

酶解的时间（h）

1

3

D

可溶性固形物

20

28

E

SO2的添加量（mg/L）

30

60

F

酵母的添加量（g/L）

0.6

1.2

G

发酵的温度（℃）

20

26

1.3.3最陡爬坡实验设计

由于响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近似真实情形，因此利用最陡爬坡实验尽可能地逼近最大发酵条件对红枣酒中活性成分的影响的最佳条件区域后，才能建立有效的响应面拟合方程（刘松和李祝2013）。

最陡爬坡法的爬坡方向和变化步长由PB实验结果得到的各变量系数决定，如果系数为负，则该因素水平应为递减，反之递增，找出峰值，从而快速的接近最大响应区域（汪彬彬和车振明2011）。

1.3.4中心组合设计

Box-Behnkendesign，是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法（刘松和李祝2013）。

以爬坡设计得出的实验结果为依据进行Box-Behnken设计，对实验记性回归分析并且进行误差分析并求得最优值，得出响应分析结果进而确定最佳条件，最后依据回归方程绘制响应面分析图（栾庆祥等2013）。

其中，每个因素取三个水平，以（-1，0，1）编码，制定相应的实验表进行3因素3水平共17个试验点的实验后，对实验结果进行响应面分析。

1.4测定方法

1.4.1多酚含量的测定

样品的测定1mL样品+1mL福林溶液+5mL0.4mol/LNa2CO3溶液（摇匀）→置于40℃水浴中加热20min，冷却（25min左右），在760nm处，测定吸光值。

结果以红枣中含有相当没食子酸的毫克数表示。

空白对照：

1mL蒸馏水+1mL福林溶液+5mL0.4mol/LNa2CO3溶液（40℃水浴）。

1.4.2多糖含量的测定

样品的测定准确吸取1mL酒样+3mL95%乙醇（沉淀过夜→冰箱内静6h→3000r/min的速度离心15min，弃上清）→沉淀+2mL95%乙醇（洗涤2次，离心，弃上清）→沉淀稀释→1mL样品+1mL6%苯酚溶液（摇匀）→5mL浓硫酸（小心加入，摇匀），置于沸水浴中加热2min，冷却（25min左右），在490nm处，测定吸光值。

按标准方程计算多糖含量。

空白对照：

1mL蒸馏水+1mL6%苯酚溶液+5mL浓硫酸（沸水浴）。

1.4.3可固的测定

手持糖量计直接测定法（罗平1991）

1.4.4总酸的测定

酸碱中和滴定法（GB/T15038-2006）

1.4.5酒精度的测定方法

密度瓶法（GB/T15038-2006）

1.5数据处理

使用Excel2003和Design-Expert8.0进行数据处理和分析，Origin8.0软件作图。

2结果分析与讨论

2.1发酵过程中红枣酒活性成分的变化预实验

对红枣进行烘烤与不烘烤两种预处理，葡萄进行去皮与不去皮两种预处理，选择煮过的红枣与不带皮的葡萄、烘烤的红枣与不带皮的葡萄、煮过的红枣与带皮的葡萄、烘烤的红枣与带皮的葡萄，按照红枣：

葡萄：

水=1：

4：

5的比例混和得到A、B、C、D四种混合浆，在相同的条件下进行发酵。

考察预处理条件对红枣酒多酚和多糖含量的影响，结果如图1、图2所示。

图1多酚随发酵时间的变化图2多糖随发酵时间的变化

由图1可知，发酵刚开始，除C外，多酚含量上升，第四天时，多酚含量整体呈下降趋势，发酵第10天，D的含量最高；由图2可知，除C外，多糖含量随发酵刚开始时上升，第4天时，呈整体下降趋势，发酵第12天，D的含量最高。

因此，经过烘烤的红枣与带皮的葡萄对发酵后的红枣酒多酚和多糖影响较大，选取烘烤的红枣与带皮的葡萄作为以下实验的条件。

在前一次试验的基础上，选择烘烤的红枣与带皮的葡萄，以红枣：

葡萄：

水选择烘烤的红枣与带皮的葡萄分别按照不同比例1:

5:

4，2:

5:

3，2:

4:

4，3:

5:

2，3:

4:

3，3:

3:

4不同比例混合得到A、B、C、D、E、F六种混合浆，在相同条件下进行发酵。

考察预处理条件对红枣酒多酚和多糖含量的影响，结果如图3、图4所示。

图3多酚随发酵时间的变化图4多糖随发酵时间的变化

由图3可知，多酚含量随发酵时间的延长呈上升趋势，发酵第10天其中F（3:

3:

4）的含量最高；由图4可知，多糖随发酵时间的延长，先下降，又上升，发酵第10天，其中F（3:

3:

4）的含量最高。

因此当选择烘烤的红枣与带皮的葡萄以红枣：

葡萄：

水=3:

3:

4进行发酵后，该条件对红枣酒多酚和多糖影响较大，选择烘烤的红枣与带皮的葡萄以红枣：

葡萄：

水=3:

3:

4作为以下实验的条件。

2.2Plackett-Burman实验

通过单因素实验，确定了果胶酶的添加量，酶解的温度，酶解的时间，可固，SO2的添加量，酵母的添加量，发酵的温度在红枣：

葡萄：

水=3:

3:

4条件下对红枣酒活性成分影响显著，因此选择这七个因素进行优化实验设计。

考察红枣酒中影响多酚和多糖的主要因素，Plackett-Burman实验设计及结果见表2，分析结果见表3、表4。

表2Plackett-Burman实验设计与结果

序号

A

果胶酶添加量（g/L）

B

酶解温度（℃）

C

酶解时间（h）

D

可固

E

SO2添加量（mg/L）

F

酵母添加量（g/L）

G

发酵温度（℃）

Y

多酚

（mg/mL）

Z

多糖（mg/mL）

1

1

1

-1

1

1

1

-1

4.16

51.59

2

-1

1

1

-1

1

1

1

3.74

59.54

3

1

-1

1

1

-1

1

1

4.01

43.39

4

-1

1

-1

1

1

1-

1

3.57

55.45

5

-1

-1

1

-1

1

1

-1

3.19

34.13

6

-1

-1

-1

1

-1

1

1

3.18

47.49

7

1

-1

-1

-1

1

-1

1

3.32

43.27

8

1

1

-1

-1

-1

1

-1

3.00

44.99

9

1

1

1

-1

-1

-1

1

2.01

30.03

10

-1

1

1

1

-1

-1

-1

2.09

33.48

11

1

-1

1

1

1

-1

-1

1.46

27.30

12

-1

-1

-1

-1

-1

-1

-1

4.14

39.41

表3多酚Plackett-Burman实验设计回归分析结果

模型

平方和

自由度

均方

显著性

贡献率

重要性排序

A-果胶酶添加量

0.48

1

0.48

0.73

0.4399

4

B-酶解温度

0.44

1

0.44

0.67

0.4590

3

C-酶解时间

0.12

1

0.12

0.18

0.6916

1

D-可溶性固形物

2.56

1

2.56

3.93

0.1184

7

E-二氧化硫

0.88

1

0.88

1.35

0.3101

5

F-酵母添加量

0.31

1

0.31

0.47

0.5302

2

G-主发酵温度

1.20

1

1.20

1.84

0.2459

6

利用Design-Expert.8.0软件对数据进行方程回归拟合，得到多酚含量Y编码自变量果胶酶添加量A、酶解温度B、酶解时间C、可固D、SO2的添加量E、酵母添加量F、和发酵温度G之间的多项回归方程：

Y=+3.16-0.20×A-0.19×B-0.099×C-0.46×D+0.27×E+0.16×F+0.32×G

表4多糖Plackett-Burman实验设计回归分析结果

模型

平方和

自由度

均方

显著性

贡献率

重要性排序

A-果胶酶添加量

45.84

1

45.84

0.67

0.4597

5

B-酶解温度

32.19

1

32.19

0.47

0.5311

4

C-酶解时间

13.08

1

13.08

0.19

0.6850

3

D-可溶性固形物

257.96

1

257.96

3.76

0.1246

6

E-二氧化硫

2.88

1

2.88

0.042

0.8477

1

F-酵母添加量

9.00

1

9.00

0.13

0.7356

2

G-主发酵温度

485.15

1

485.15

7.07

0.0565

7

利用Design-Expert.8.05b软件对数据进行方程回归拟合，得到多糖含量Y编码自变量果胶酶添加量A、酶解温度B、酶解时间C、可固D、SO2的添加量E、酵母添加量F、和发酵温度G之间的多项回归方程：

Y=+42.51+1.95×A-1.64×B-1.04×C-4.64×D+0.49×E+0.87×F+6.36×G

对表3中的数据进行回归分析，表3中对红枣酒中的活性成分影响较大的因子依次是C>F>B，即酶解时间>酵母添加量>酶解温度；对表4中的数据进行回归分析，表4中对红枣酒中的活性成分影响较大的因子依次是E>F>C，即SO2>酵母添加量>酶解时间，综合所述，选择果胶酶的添加量、初始SO2的添加量、发酵的温度为下一步实验的关键因素。

综上所述，果胶酶的添加量、初始SO2的添加量、发酵的温度对红枣酒多糖和多酚的影响较大。

2.3最陡爬坡实验确定发酵条件

根据PB实验可知，果胶酶的添加量、初始SO2的添加量、发酵的温度对红枣酒多糖和多酚的影响较突出。

根据这三个因素估计系数的正负效应，依次增大或减小，检测最终发酵液活性物质的变化，从而确定发酵温度、初始SO2浓度和糖的添加量范围，结果如表5所示。

表5最陡爬坡实验设计及结果

序号

果胶酶的添加量（g/L）

SO2的添加量（mg/L）

发酵的温度（℃）

多酚

（mg/mL）

多糖

（mg/mL）

1

1

30

20

2.76

27.36

2

2.5

45

22

2.73

28.61

3

4

60

24

2.74

26.11

4

5.5

75

26

2.75

26.74

5

7

90

28

2.66

26.83

6

8.5

105

30

2.44

20.95

实验结果显示，表5爬坡设计实验中，第1组实验对多酚含量影响较大，第2组实验对多糖含量影响较大。

综上所述，考虑到红枣本身含有多糖，发酵结束后多糖含量的变化有待探究，因此选取对红枣果酒的活性成分影响较大的第2组实验，即选取果胶酶的添加量2.5g/L、SO2的添加量45mg/L、发酵的温度22℃为三个因素的最大响应值区域，以此作为中心组合实验的中心点。

2.4中心组合实验结果

三个重要因子最适合浓度范围确定后，以果胶酶的添加量2.5g/L、SO2的添加量45mg/L、发酵的温度22℃为中心点实施响应分析。

设计因素及编码值如表6，Box-behnken实验设计及结果如表7，Box-behnken实验设计及结果分析如表8、表9。

表6Box-behnken设计各因素及编码值

因素

水平

-1

0

1

A

果胶酶添加量（g/L）

1.5

2.5

3.5

B

SO2的添加量（mg/L）

35

45

55

C

发酵温度（℃）

18

22

26

表7Box-behnken实验结果

序号

A

果胶酶添加量（g/L）

B

SO2的添加量（mg/L）

C

发酵温度（℃）

多酚

（mg/mL）

多糖

（mg/mL）

1

-1

-1

0

2.00

11.86

2

-1

1

0

2.01

30.92

3

0

1

-1

2.05

19.52

4

0

0

0

1.99

27.18

5

-1

0

1

1.76

24.87

6

0

-1

-1

1.91

35.38

7

-1

0

-1

1.98

40.19

8

-1

1

0

1.74

30.57

9

-1

-1

0

2.32

36.62

10

-1

0

1

1.90

27.72

11

0

0

0

1.96

28.61

12

0

1

1

1.98

24.51

13

0

0

0

1.98

32.17

14

0

-1

1

2.08

26.11

15

1

0

-1

1.95

28.43

16

0

0

0

1.82

30.57

17

0

0

0

2.01

33.48

2.4.1多酚最佳发酵因素的确定

表8Box-behnken实验的回归分析结果

平方和

自由度

均方

F值

P值

方程项

0.19

9

0.021

1.75

0.2368

A

3.264E-003

1

3.264E-003

0.27

0.6209

B

0.035

1

0.035

2.88

0.1333

C

4.112E-003

1

4.112E-003

0.24

0.5798

AB

0.089

1

0.089

7.26

0.0309

AC

8.224E-003

1

8.224E-003

0.67

0.4387

BC

0.014

1

0.014

1.16

0.3177

A2

1.562E-003

1

1.563E-003

0.13

0.7310

B2

0.003

1

0.003

2.71

0.1437

C2

5.676E-003

1

5.676E-003

0.47

0.5171

残差

0.085

7

0.012

失拟项

0.062

3

0.021

3.54

0.1266

纯误差

0