合工大生物工程毕设.docx
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合工大生物工程毕设
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毕业论文及设计
设计（论文）题目利用根霉发酵产富马酸工艺及年产500吨生产线设计
学院名称生物与食品工程学院
专业（班级）生物工程（2010-2班）
姓名（学号）王凌军（20106332）
指导教师李兴江
系（教研室）负责人叶明
中文摘要
摘要:
富马酸是一种重要的平台化合物和精细化学品,广泛应用于材料、医药、食品及饲料添加剂等领域,市场潜力巨大。
国内外有机酸发酵中,富马酸发酵的方法分为两种,即“化学法”和“生物法”。
以米根霉为菌种,通过生物发酵法生产富马酸,应用单因素和正交实验设计法，在摇瓶实验中，通过逐个改变基本培养基中某一成分的浓度，添加不同大小的接种量以及对培养时间等因素进行探索,考察它们对富马酸产量的影响，确定最优工艺条件。
结果表明,最佳发酵时间为80h，最适发酵条件为温度32.0℃、转速为170r/min、起始糖浓度为120.0g/L、碳酸钙加量80.0g/L。
本课题通过优化培养基成分和培养条件，为工业生产使用淀粉为原料，米根霉为菌种来提高富马酸产量提供相关依据和参数。
关键词：
米根霉葡萄糖富马酸工艺设计
Abstract
Abstract:
Fumaricacidisanimportantplatformchemicalsandfinechemicals,whichwidelyusedinthefieldofmaterials,medicine,foodandfeedadditives，havinghugemarketpotential.InthefermentationofFumaricacidaroundtheworld,Fumaricacidfermentationcanbedividedintotwomethods:
theBiologicalandchemistry.WeselectRhizopusoryzaeasthestrainofBiologicalfermentationtoyieldFumaricacid.Intheexperimentofflasks,addingdifferentsizesofinoculumandusingdifferenttimefortraining，throughsinglefactorandorthogonalexperiment,throughchangingtheconcentrationofacomponentonebyoneinthebasicmedium.Theresultshowedthebestfermentationperiod（80h）andthebestfermentationconditionasfollows:
temperature（32.0℃）,rotationspeed（170r/min），theinitialcontentofglucose（120.0g/L）,theinitialcontentofcalciumcarbonate（80.0g/L）.
Keywords:
RhizopusoryzaeGlucoseFumaricacidProcessDesign
1引言
1.1富马酸的性质和用途
富马酸,又名反丁烯二酸，延胡索酸。
分子式：
C4H4O4。
分子量：
116.07。
英文名：
fumaricacid，trans-Butenedioicacid。
外观：
无色晶体。
熔点：
299～300℃ 相对密度：
1.635（20／4℃）。
溶解性：
溶于水，微溶于冷水、乙醚、苯，易溶于热水，溶于乙醇。
反丁烯二酸的化学性质与顺丁烯二酸相似。
图1.1富马酸的结构
反丁烯二酸用于生产不饱和聚酯树脂，这类树脂的特点是耐化学腐蚀性能好，耐热性也好；反丁烯二酸与乙酸乙烯的共聚物是良好的粘合剂，与苯乙烯的共聚物是制造玻璃钢的原料，反丁烯二酸所制得的增塑剂无毒，可用于与食品接触的乙酸乙烯乳胶。
该品是医药和光学漂白剂等精细化学品中间体，在医药工业中用于解毒药二巯基丁二酸的生产，将反丁烯二酸用碳酸钠中和，即得到反丁烯钠，进而用硫酸亚铁置换得到反丁烯二酸铁，是用于治疗小红血球型贫血的药物富血铁。
该品作为一种食品添加剂——酸味剂，用于清凉饮料、水果糖、果冻、冰淇淋等，大多与酸味剂富马酸并用，反丁烯二酸与氢氧化钠反应制成的单钠盐，也用作酸味调味品，还用作合成树脂、媒染剂的中间体。
1.2富马酸的生产与制备方法
目前，在工业上主要是通过化学合成法以及生物合成法来制备富马酸。
富马酸的化学合成方法主要包括有顺丁烯二酸酐（顺酐）异构法和糠醛氧化法二种。
顺酐主要广泛用于合成树脂、涂料、农药、润滑油添加剂、医药、纸张处理剂、食品添加剂、稳定剂等方面，是用量比较大的有机原料。
糠醛则是一种以农林副产品水解获得的重要有机化工原料，它在医药、兽药、农药、染料、香料、涂料、塑料、电绝缘材料、助剂、试剂、溶剂、粘合剂、饲料添加剂、食品、合成树脂、合成橡胶及合成纤维单体等工业部门有着十分广泛的用途。
化学合成法制备富马酸面临着的重要难题是石油资源的短缺所引起的生产成本提高和对环境的污染。
石油作为一不可再生资源，其储量是有限的．石油的短缺使世界石油市场供需严重失衡，导致石油价格飞涨，同时以石油为原料制备的苯、甲苯、乙烯、乙二醇等大宗化学品的价格也大幅上涨，使下游制造业的成本增加。
因此，寻找新的资源和能源，建立新的大宗化学品合成平台是刻不容缓的，这关系到人类文明的可持续发展。
富马酸的生物合成法包括有酶催化转化法和微生物发酵法2种。
20世纪90年代中期所出现的酶催化转化法一般是以马来酸为底物，在马来酸异构酶的作用下制备富马酸。
该方法有较高的转化效率以及产率。
而微生物发酵法所用菌种主要有以马来酸作为底物的产碱假单胞菌 和以葡萄糖作为底物的霉菌。
20世纪初期开始的霉菌发酵产富马酸的研究工作．现随着科学技术的进步，富马酸得率也提高到了30％～40％。
不过，早期受技术水平的局限，对微生物的生长代谢的了解不够深入，一直未能进行工业化的生产。
根霉属中的米根霉是富马酸发酵经常使用的菌种，米根霉有淀粉糖转化能力，发酵所需营养也简单，只需要简单无机氮源。
同时菌丝与发酵液容易分离，而后提取方便，产品较纯。
米根霉产酸在好氧的条件下进行，要求通气以保持好氧条件，糖对富马酸转化率一般在50％左右。
1.3课题的意义以及国内外的研究现状和发展趋势，尚待研究的问题
1.3.1课题的作用、意义
富马酸是一种重要的平台化合物和精细化学品,可广泛应用于材料、医药、食品及饲料添加剂等领域,市场潜力巨大。
利用可再生生物质为原料发酵生产富马酸符合当前社会对绿色环保、健康安全及可持续发展的总体需求。
本课题研究富马酸发酵条件及工艺参数，优化根霉发酵产富马酸的条件，为工业生产提高富马酸产量提供相关依据和参数。
1.3.2国内外的研究现状和发展趋势
目前全世界富马酸的生产能力为400000t/a，其中我国富马酸年产量达到50000t左右。
我国富马酸的应用范围较小，用途也比较单一，主要消费领域为不饱和聚酯树脂、纸浆料助剂、食品、医药等领域。
随着其应用领域的不断拓展，尤其作为一种平台化合物从它出发可以合成很多四碳化合物，在石油资源日益枯竭的情况下,采用微生物发酵法进行富马酸的工业化生产受到了越来越多的关注,发酵法生产富马酸还是处于实验室研究状态。
但目前发酵法生产富马酸的生产成本比较高，还无法和化学法竞争。
但随着科技的不断发展,利用各种新兴手段不断改良现有菌种及工艺,必将实现发酵法生产富马酸的大规模工业化。
1.1.3尚待研究的问题
（1）米根霉产富马酸的条件选择，以及过程的控制；
（2）对高产量的菌种扩大以及进一步为工厂化生产做好准备；
（3）对发酵工厂的设计。
1.4课题研究的主要内容及拟解决的问题
本课题研究富马酸发酵条件及工艺参数，优化米根霉发酵产富马酸的条件，为工业生产提高富马酸产量提供相关依据和参数。
2材料与方法
2.1实验材料:
2.1.1菌种
米根霉CICC40506（合肥工业大学保藏菌种）
2.1.2培养基
种子培养基：
PDA培养基
物质
浓度（g/L）
马铃薯浸出液
200
葡萄糖
20
琼脂
20
发酵培养基：
葡萄糖100g/L，（NH4）2SO45g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，ZnSO4·7H2O0.1g/L．温度为：
32℃，摇床转速170r／min，250mL三角瓶装培养液50mL,一次性添加CaCO380g／L用于调节pH值。
2.2实验方法
2.2.1试管培养
种子培养基，32℃，培养5～7d．
2.2.2摇瓶种子培养
种子培养基，32℃，培养5～7d．
2.2.3摇瓶发酵培养
取冰箱中保存的活化菌种，加入20mL生理盐水，用接种环搅拌，制成孢子悬浮液，取5mL孢子悬浮液接种于装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，添加一定量CaCO3，32℃，170r／min摇床培养60h。
2.2.4实验试剂和仪器
表2.1试剂
序号
药品名称
规格
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
葡萄糖
硫酸铵
七水合硫酸锌
七水合硫酸镁
磷酸二氢钾
碳酸钙
氢氧化钠
琼脂
七水合硫酸亚铁
木糖
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯
分析纯
表2.2仪器
设备、仪器名称
型号
数量
超净工作台
SWCJCO
1
恒温培养箱
HZQ-F160
1
不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅
YXQ-SQ46-280S
1
电热恒温鼓风干燥箱
DHG-9240A
1
紫外可见分光光度计
721
1
恒温摇床
DNP-9052
1
电子天平
AR1140
1
2.3分析方法
2.3.1富马酸的测定：
本实验测定富马酸含量的方法是滴定法。
应用KMnO4滴定法快速检测米根霉发酵液中富马酸含量,通过研究富马酸滴定体系下的酸度以及发酵培养基中的葡萄糖和代谢副产物如乳酸、苹果酸、乙醇、草酰乙酸、丁二酸等对KMnO4滴定结果的影响,发现应用KMnO4滴定法测定米根霉发酵液中富马酸的含量,与HPLC检测法测定的含量误差在3%以内,平均回收率为96.86%,相对标准偏差（RSD）为0.27%.以上结论表明,KMnO4滴定法可有效应用于快速检测米根霉发酵液中富马酸的含量.
2.3.2还原糖的测定：
用DNS法测定残糖含量，样液稀释100倍，取1ml，再加入2mlDNS沸水浴2min，再加入9ml水，最后用可见光分光光度计测定540nm处的吸光度。
2.3.3单因素变量
所谓“单因素变量”,即控制其它因素不变,而仅改变其中的某一因素,观察其对实验结果的影响。
它与控制某种因素的变化幅度,在不同条件下重复实验,观察其实验结果的影响程度的平行原则不同,它往往与在实验中设立对照组联合使用。
其基本思想与孟德尔的豌豆杂交实验中先只研究一对相对性状,再研究多对相对性状实有异曲同工之妙;其基本方法是实验设计中不改变实验背景环境（不变因子）,只改变实验中的某一条件（单因素）,观察这一因子变化产生的后果,逐级比较,通过一系列的单因子变量实验,取得一组数据,从而得到实验结果。
在本次实验中，主要通过单因素变量法研究了发酵时间、培养基中碳氮含量、无机盐含量、无机盐种类对米根霉发酵积累富马酸的影响。
2.3.4正交试验
正交试验设计（Orthogonalexperimentaldesign）是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。
是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。
当分析因设计要求的实验次数太多时，一个非常自然的想法就是从析因设计的水平组合中，选择一部分有代表性水平组合进行试验。
因此就出现了分式析因设计（fractionalfactorialdesigns），但是对于试验设计知识较少的实际工作者来说，选择适当的分式析因设计还是比较困难的。
例如作一个三因素三水平的实验，按全面实验要求，须进行3^3=27种组合的实验，且尚未考虑每一组合的重复数。
若按L9（3^3）正交表安排实验，只需作9次，按L18（3^7）正交表进行18次实验，显然大大减少了工作量。
因而正交实验设计在很多领域的研究中已经得到广泛应用。
3米根霉发酵产酸的结果与讨论
3.1培养条件的初步优化
实验时，采用单因素变量法以及正交试验法对发酵培养基成分、接种量、发酵条件进行初步优化。
3.2结果与讨论
3.2.1接种量对富马酸产量的影响
接种量是指移入种子液的体积和接种后培养液体积的比例。
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。
但接种量过大或者过小，均会影响发酵。
过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。
通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%。
本实验考察了不同的接种量对发酵生产富马酸的影响，结果如下图所示
由上图可以看出，随着接种量的变大，富马酸的产量先变大后保持不变，最终逐渐变小。
这说明存在一个最适的接种量范围既适合菌种的繁殖生长又利于富马酸的产生。
3.2.2培养基成分对富马酸产量的影响（单因素实验）
3.2.2.1时间对富马酸产量的影响：
单因素试验以葡萄糖120g/L，（NH4）2SO45g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O0.3g/L，ZnSO4·7H2O0.1g/L．并且一次性添加碳酸钙（80g/L）作为基础培养基。
实验室所存米根霉在此条件下培养8d，第一次接种后48h开始测定，然后每隔24h测定一次富马酸含量。
富马酸产量峰值为20.3g/L。
如下图所示：
由上图可以看出，随着培养时间的增长，富马酸的产量先变大后保持不变，最终逐渐变小。
这说明存在一个适合的时间范围既允许菌种的繁殖生长又利于富马酸的产生。
3.2.2.2不同碳源对根霉产富马酸的影响：
葡萄糖浓度对富马酸产量的影响：
选择不同葡萄糖浓度进行发酵，分别在基础培养基中添加80、100、120、140g/L的葡萄糖，在摇瓶中考察不同葡萄糖浓度对米根霉发酵生产富马酸的影响，结果下图所示:
由上图可知，富马酸发酵产量随葡萄糖质量浓度升高而升高，当葡萄糖质量浓度为120g/L时,富马酸产量最高。
但当葡萄糖质量浓度大于120g/L时．富马酸产量反而下降。
这是因为虽然葡萄糖作为碳源，而碳源提供细胞的碳架，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳架。
但这些并不意味着碳源越多越好，我们同时需要注意的是，微生物生长需要合适的渗透压过高的渗透压不利于微生物的生长。
3.2.2.3木糖浓度对富马酸产量的影响：
选择不同木糖浓度进行发酵，分别在基础培养基中添加80、100、120、140g/L的木糖，在摇瓶中考察不同的木糖浓度对米根霉发酵生产富马酸的影响，结果如下图所示：
由上图可知，富马酸发酵产量随木糖质量浓度升高而升高，当木糖质量浓度为120g/L时,富马酸产量最高。
但当木质量浓度大于120g/L时．富马酸产量反而下降。
但值得注意的是，木糖提供碳源对于根霉产富马酸的效果没有葡萄糖显著，所以经常使用葡萄糖为根霉提供碳源产富马酸。
不同氮源对根霉产富马酸的影响：
3.2.2.4尿素浓度对富马酸产量的影响：
选择了不同的尿素浓度进行发酵，分别在基础培养基中添加1、2、3、4、5g/L的尿素，在摇瓶中考察了不同的尿素浓度对米根霉发酵生产富马酸的影响，结果如下图所示:
由上图可知，富马酸发酵产量随尿素浓度的升高而升高，当在尿素浓度在3g/L时富马酸产量达到最大值19.5g/L。
硝酸铵浓度继续增大时，富马酸产量略有下降
3.2.2.5硝酸铵浓度对富马酸产量的影响：
在本实验中，硝酸铵提供无机氮源，而氮源主要用于合成细胞内蛋白质和核酸及代谢产物中的含氮化合物。
选择了不同的硝酸铵浓度进行发酵，分别在基础培养基中添加1、2、3、4、5g/L的硝酸铵，在摇瓶中考察了不同的硝酸铵浓度对米根霉发酵富马酸的影响，结果如下所示：
由上图可知，富马酸发酵产量随硝酸铵浓度的升高而先增大后减小，在3g/L时富马酸的产量达到最大值20.3g/L。
从折线的走势来看，硝酸铵的浓度对富马酸的影响较大。
3.2.2.6硫酸铵浓度对富马酸产量的影响：
选择了不同的硫酸铵浓度进行发酵，分别在基础培养基中添加1、2、3、4、5g/L的硫酸铵，在摇瓶中考察不同的硫酸铵浓度对米根霉发酵生产富马酸的影响，结果如下图所示：
由上图可知，富马酸发酵产量随硫酸铵浓度的升高而逐渐增大，最佳浓度为2g/L但增大的幅度相对较小，这显示硫酸铵对富马酸的产生影响较小。
无机盐浓度以及种类对根霉产富马酸的影响
3.2.2.7硫酸镁浓度对富马酸产量的影响：
选择了不同的硫酸镁浓度进行发酵，分别在基础培养基中添加0.3、0.4、0.5、0.6、0.7g/L的硫酸镁，在摇瓶中考察，米根霉发酵生产富马酸的影响，结果如下图所示：
由上图可知，富马酸发酵产量随硫酸镁浓度的升高而略有升高，当在硫酸镁浓度在0.4g/L左右时富马酸产量达到最大值。
硫酸镁浓度继续增大时，富马酸产量略有下降。
3.2.2.8磷酸二氢钾浓度
在本实验中，选择了不同的磷酸二氢钾浓度进行发酵，分别在基础培养基中添加0.4、0.5、0.6、0.7、0.8g/L的硫酸镁，在摇瓶中考察，米根霉发酵生产富马酸的影响，结果如下图所示：
由上图可知，当磷酸二氢钾浓度在0.5g/L左右时富马酸产量达到最大值。
磷酸二氢钾浓度继续增大时，富马酸产量略有下降。
3.2.2.9硫酸锌浓度对富马酸产量的影响：
选择了不同的硫酸锌浓度进行发酵，分别在基础培养基中添加0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/L的硫酸锌，在摇瓶中考察对米根霉发酵生产富马酸的影响，结果如下图所示：
由上图可知，当硫酸锌浓度在0.3g/L左右时富马酸产量达到最大值。
硫酸锌浓度继续增大时，富马酸产量略有下降。
3.2.2.10硫酸亚铁浓度对富马酸产量的影响：
选择了不同的硫酸亚铁浓度进行发酵，分别在基础培养基中添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的硫酸亚铁，在摇瓶中考察对米根霉发酵生产富马酸的影响，结果如下图所示：
由上图可知，当硫酸亚铁浓度在0.4g/L左右时富马酸产量达到最大值。
硫酸亚铁浓度继续增大时，富马酸产量略有下降。
3.2.4培养基成分对富马酸产量的影响（正交实验）以及时间对富马酸产量的影响
通过对培养基成分进行单因素方差分析得知，葡萄糖，硝酸铵，KH2PO4，FeSO4·7H2O等5个因素对富马酸产量有影响。
因此，选择了上述五个因素，设计五因素四水平的正交实验，以富马酸产量为响应值，试验设计及结果见下表，每组三个平行样，结果取平均值。
注：
在正交实验及其验证实验中，我们均以1ml发酵液滴定消耗的高锰酸钾毫升数作为数据处理的对象。
表3.2.1正交实验设计及结果
实验号
因素
实验结果
A
B
C
D
E
葡萄糖
KH2PO4
ZnSO4·7H2O
MgSO4·7H2O
（NH4）2SO4
1
1（80）
1（0.3）
1（0.08）
1（0.25）
1（4）
31.34
2
1
2（0.4）
2（0.10）
2（0.30）
2（6）
22.05
3
1
3（0.5）
3（0.12）
3（0.35）
3（8）
15.67
4
1
4（0.6）
4（0.14）
4（0.40）
4（10）
16.83
5
2（100）
1
2
3
4
14.51
6
2
2
1
4
3
20.31
7
2
3
4
1
2
18.57
8
2
4
3
2
1
13.93
9
3（120）
1
3
4
2
12.77
10
3
2
4
3
1
15.67
11
3
3
1
2
4
16.83
12
3
4
2
1
3
13.93
13
4（140）
1
4
2
3
12.19
14
4
2
3
1
4
9.86
15
4
3
2
4
1
15.09
16
4
4
1
3
2
20.31
表3.2.2直观分析表
项目
A
B
C
D
E
均值1
21.47
17.70
22.20
18.43
19.01
均值2
16.83
16.98
16.40
16.25
18.43
均值3
14.80
16.54
13.06
16.54
15.53
均值4
14.36
16.25
15.81
16.25
14.51
极差
7.11
1.45
9.14
2.18
4.50
。
正交实验的验证实验：
通过直观分析得到的最优组合为A1B1C1D1E1，同时由直接分析得到的最优组合也为A1B1C1D1E1，所以可以初步判定米根霉摇瓶发酵产富马酸的培养基最优组合即为A1B1C1D1E1，随后对实验结果进行验证实验，安排和结果如下：
实验分为两组，即对照组和验证组，两者的培养基成分如上所述外，对照组即为未改进的基础培养基，验证组使用得到的最优组合培养基，每组三个平行样（两组共30个三角瓶）,实验结果取平均值。
每天取六个三角瓶（每组三个）进行取样测定富马酸产量，培养三天后，每24小时检测一次。
因为这样既可以进行验证正交实验，又能同时研究时间对米根霉发酵富马酸产量的影响。
其实验结果如下图所示：
由上图得知，分析得到的配方（A1B1C1D1E1）比原始配方的富马酸发酵产量要高。
因此得到的配方（A1B1C1D1E1）是本人得到的最佳培养基配方。
当利用此最佳培养基配方进行发酵到第五天时，滴定1mL发酵液消耗的EDTA毫升数为5.3mL,即富马酸产量为30.76g/L。
3.2.5小结
经过培养基的初步优化，确定了出发菌株米根霉摇瓶发酵的最佳培养基组成为：
葡萄糖120g/L，（NH4）2SO44g/L,KH2PO40.3g/L,MgSO4.7H2O0.25g/L,ZnSO4.7H2O0.08g/L，碳酸钙80g/L。
相对于基础培养基，优化出的培养基的富马酸产量提高了26.1%。
同时，也研究了接种量和时间对富马酸发酵的影响，了解到富马酸发
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