病毒学实验技术.docx

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病毒学实验技术

实验一鸡胚接种

器材：

鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化—病毒接种（NDVED—76、IBV—效价测定（HAHI）

一．精卵的选择、孵育和检卵

1.受精卵的选择

1）最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响

2）最好是白克蛋

3）受精卵必须新鲜，保存在5-20C不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。

2.孵育

1）孵箱温度保持37.5—38.5C

2）相对湿度：

50-60%

3）保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后

4）孵育后第三天开始，每天翻卵一次

3.检卵

孵育后第4天开始，每天检卵一次。

4日卵可见血管。

未受精卵不见血管鸡胚。

死胚血管模糊，无胎动。

二．鸡胚的结构

1．卵壳上有细孔，以行气体交换

2．壳膜行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流

3．气室呼吸和调节压力

4•绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管一Q—卵壳孔交换

5．尿囊腔胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。

6．羊膜腔胚胎浸泡于其中羊水

7．卵黄早期养分

8．卵白晚期养分

三．接种前处理

1．做接种记号

2．消毒

四．接种途径

卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体

1．卵黄囊接种法虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖

方法一：

1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下

2）碘及酒精消毒气室端

3）钢锥在气室中央锥一小孔

4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚

5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚

方法二：

1）2）同一

3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒

4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚

5）封孔，续孵，弃24h内死胚

2．绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱疹病毒分离和增殖

方法一：

1）10-12日龄胚，画气室，消毒

2）在气室端开一1.5X1.5口

3）灭菌镊子撕去一小片内壳膜

4）滴入接种物

5）胶布或透明纸封口方法二：

（人工气室）

1）在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mmfi勺烤焦圈］

2）消毒，刀撬起卵壳造成卵窗

3）在气室端中央钻一个小孔

4）用针尖挑破卵窗中心勺壳膜，勿损伤其下勺绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出

5）橡皮乳头于小孔上吸气，形成人工气室，可见绒毛尿囊膜上滴加勺生理盐水下渗

6）用1mlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上

7）胶布或透明纸封口，熔蜡封孔

8）鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上3．尿囊腔接种法用于正粘病毒，副粘病毒分离和增殖

1）选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒

2）钢锥锥一小孔

3）注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-1cm，0.1-0.2/胚

4）熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚静脉接种：

蓝舌病毒；脑内接种：

狂犬病毒

实验二原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）

器材：

鸡胚碘酊棉球，酒精棉球照蛋灯蛋座大剪子眼科剪镊子平皿培养基胰酶水浴锅大青霉素瓶吸管吸球细胞瓶瓶塞一．实验目勺：

了解原代细胞培养勺一般方法和用途

二．实验步骤：

1.取9-12日龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒

2.无菌夹起鸡胚置于无菌平皿

3.眼科剪镊去头、四肢及内脏，Hank'S洗液两次

4.剪碎近于乳糜状

5.将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，Hank'S两次，然后加入4倍量的（5ml）

0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO5.6%、7.5%、8.8%）,混匀后置37C水浴20-30分钟，

期间每10min摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）

6.消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰酶液，加含有犊牛血清的Hank'S液生长

液约10ml，轻摇后吸去，重复一次，目的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用

7.加入生长液10ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织

块下降，轻吸出细胞悬液于离心管中

8.平衡后以2000r/min10min，弃上清，用10mlHank'S液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶中，2ML/瓶。

使细胞量约为50万个/ml，再补加Hank'S生长液至10ml，37C培养

实验三传代细胞培养

（传代细胞=遗传突变/理化学物质作用/致瘤病毒作用=异倍体癌变细胞；多来自动物或人的肿瘤组织及部分来自突变的正常细胞。

成长旺盛，繁殖快速，但易遭支原体和病毒污染—细胞源性/非-细胞源性如毒种、血清、胰酶、操作人员口鼻手等）

一、试剂

1.细胞分散剂：

0.25%胰酶，250ML装，4C保存

胰酶

2.5g

NaCl

8.0g

KCL

0.2g

NqHPO・12H0

2.89g

KH2PO4

0.2g

加ddH20至

1000ml

加压过滤除菌，分装于小瓶备用。

（细胞消化液：

将胰酶2.5g、NaCl80.0g、KCL4.0g、葡萄糖10.0g、NaHCO5.8g依次溶于900.0mlddH2O中，待完全溶解后，定容至1000.0ml,过滤除菌，分装后置-20C保存备用）

2.培养基

DMEM培养液：

1袋DMEMF粉溶于950mlddH2O中，加入3.7gNaHCO,用1mol/lHCL调PH值至6.8-7.0，定容至1000ml，0.22卩m滤膜过滤除菌，室温保存备用。

生长液：

含10%卖牛血清的DMEM培养液（可室温保存）。

（细胞生长液：

在DMEM培养液中加入10%勺新生牛血清，100IU/mL青霉素、100卩g/ml链霉素，4C保存备用）3.双抗：

母液20000u（ug）/ml，用量：

500mlDMEM加入5ml，可4C保存。

4.血清：

500ML装，用前在56C水浴灭活30MIN,每500MLDME加入50ML

5.器材：

吸管（5、10ml）、细胞瓶、胶塞（含盐水瓶塞）、吸球、75%酒精棉球等。

2.操作步骤

1.先配置生长液（500mlDMEM加入50ml血清和5ml双抗，混匀）

2.取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液，可用适量生长液冲洗。

3.吸弃，加入3-4ml胰酶/10ml细胞浸没细胞层，亦可先洗涤细胞层后弃之），于37C培养箱放置几分钟或室温3-5min（PK-15）（7-8min，Marc-145），镜下观察至细胞间出现空隙或稍松动或稍变圆或稍拉网（PK-15）或细胞变圆（Marc-145）后，尽弃胰酶消化液（注意：

时间要掌握好，勿消化过头，如拉网状或脱落）。

4.加入生长液（约6-7-9ml/10ml瓶），反复吹打几次，（先正面吹打，在反面吹打）使细胞分散成游离单个细胞（镜检，细胞呈单个，成双、3-4个团块即可），然后分装于3个小瓶中（PK-15），补足生长液至10ml（或吹散成单个细胞后，加入3个细胞瓶所需生长液30ML再分装，10ml/瓶，要利用原瓶，其生长较好），37E培养箱培养1-2天即可长成单层。

如是分装6孔细胞板，每孔加入3-4ml，用吸管抽吸一下孔内细胞悬液使之均匀不成团生长。

24孔板，1ml/孔。

96孔板，一般将病毒与细胞同时接入，详见毒价测定法。

细胞长好后，接毒前可用维持液洗涤并吸弃。

接毒量根据病毒浓度而定，一般100-200ul/孔，吸附45-60min，然后加入维持液。

37C培养30-40h（PRV，观察CPE出现70-80%CP田寸可收获，不论如何，病毒于40h前收获，以免病毒释放到细胞外。

对于污染孔，小心吸弃，加入适量双抗，首次作冲洗，二次作抗菌。

对可能污染孔，加入适量双抗如10ul/24孔。

细胞板的处理：

胰酶处理—自来水冲净—用镊子夹棉球擦洗掉上面的细胞残留物—浸泡酸液过夜—自来水冲洗—用双蒸水洗涤—控干—将细胞板和板盖正象平铺于干净或消毒过的报纸紫外灯下照射消毒杀菌过夜—次日将盖合上—用下面的报纸包好—近期使用。

常用传代细胞：

1.IBRS-2（仔猪肾上皮传代细胞株）；

2.Vero（非洲绿猴肾细胞）；

3.Marc-145（MA-104进一步克隆而来）;

4.BHK-21（乳仓鼠上皮传代细胞株）;

5.MDCK（犬肾上皮细胞）；

6.F81（猫肾细胞）；

7.PK-15（仔猪肾上皮传代细胞株）；

8.Hela（人子宫颈癌细胞）；

9.PAM（肺泡巨嗜细胞）;

10.CL2621（猴肾细胞系）

实验四细胞的冻存与复苏

器材：

吸球离心管细胞吸管胰酶血清二甲基亚砜细胞冻存管一．细胞的冻存（缓慢的冰冻和迅速的融解）

1．细胞冻存液

A液：

含40%血清的DME培养液

B液：

含20%二甲基亚砜（DMSO低温保护剂）的DMEI培养液

2•操作：

取刚长满单层的细胞，加入胰酶消化后，用DMEN培养液吹散后装入离心管中，

500-3000r/min5-10min，用适量的A液悬浮，再加入等体积的B液，分装于细胞冻存管中，置4°C或液氮气相中，按5min1cm的速度逐渐往下降直至液氮中长期保存。

或：

配制含10%DMS和20%血清的DME培养液，按10ml细胞瓶制备1-2个冻存管计，一般配制10ml，取刚长满单层的细胞，加入胰酶消化后，先加入生长液终止胰酶作用，去掉首瓶生长液，加入冻存液吹散后，移入第二瓶吹打，依此类推，处理完所有细胞瓶，分装于细胞冻存管中，1.8ml/管，置-40C过夜或置液氮中长期保存。

二．细胞的复苏

将冻存于液氮中的细胞取出，迅速置于37-40C左右水浴中，并不停地摇动，使其快速解冻融解（40-60秒内），然后加入10倍量营养液后，500r/min离心10min,去掉上层冻存保护液，用生长液悬浮（由10ml细胞培养物制成的冷冻细胞，在融解和离心沉淀后可再悬浮于10ml营养液中），再置于细胞瓶中培养（可预先用成长液洗涤一下）。

或不离心直接转移到细胞培养瓶中，每毫升细胞悬液加入10倍量预热至37C的培养液（血清量可提高至10-15%）o等其贴壁几小时后（4-12小时，一般6小时左右贴壁），再换入新的生长液继续培养至长成单层后换液，并考虑传代。

附：

细胞室温保存：

将已长成单层的细胞于换液后（维持液含血清5-10%），置室温或

20-22C避光保存，一般可保持细胞的生活力达半个月以上（但BHK-21最多能保存7天左右）。

不宜在4C保存，因4C保存易发生退化，并较快从培养瓶壁脱落；继续传代培养时，细胞活力也明显降低。

三．细胞的保存：

1．细胞培养物的常温短期保存

1）实验室中细胞短期保存

1将已长成单层的细胞换液后置室温或20-22C下避光保存，可达15天以上。

2将细胞培养温度由37C降至32C甚至30C，可隔15-30天传代一次。

2）长途运送细胞培养物的保存取刚刚长成单层的细胞培养物，弃去营养液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留空气，随后用橡皮塞紧瓶口，并作适当的包扎。

运输途中的温度应保持在15-25C左右，到达

目的地后，置37C培养一天，再行传代。

2．细胞培养物的长期保存

将刚长满单层的细胞，按细胞传代方法消化吹散后，装入离心管中，1500-3000rpm

5-10min，用适量含有20%卖牛血清、10%!

甲亚砜的DMEMI浮，分装于细胞冻存管中，置4C2h，-20C2h，-70C过夜，然后置于液氮中长期保存。

或置于液氮气相中按5min1cm的速度逐渐往下降直至液氮中长期保存。

实验五病毒在细胞中的的培养

1.取长满单层的细胞一瓶（100ml）,倒去培养液。

加入适量液冲洗并吸弃。

2.加入2ml的病毒液，使铺满细胞单层，37C感作45-60min

3.取出，加入维持液至10ml，然后再置37C培养箱培养

4.待75-85%以上细胞出现病变时，收毒（一般于40h前收毒，以免病毒释放出细胞外）

实验六病毒感染力（TCID5。

）的测定

器材：

细胞胰酶培养基吸管吸球96孔细胞培养板移液器吸头青霉素瓶

一.实验步骤

1.在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1-10-10

2.将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100UL

3.然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3*105个/ml

4.设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排

5.逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天

6.结果的计算，按Reed-Muench两氏法或KABE法进行

二•计算方法

距离比例=

1.Reed-Muench两氏法

病毒液稀释度

出现CPE孔数

未出现CPE孑L数

累计

出现CPE孔所占

的%

出现CPE孔数未出

现CPE孔数

10-1

100（27/27）

10-2

100（19/19）

10-3

91.6（11/12）

10-4

40（4/10）

10-5

0.7（1/14）

10-6

0（0/21）

高于50%病变率的％-50%=91.6-500.8

高于50%病变率的％低于50%病变率的%91.6-40

lgTCID5°=距离比例*稀释度对数之间的差+咼于50伽变率的稀释度的对数

+（-3）=-3.8

TCID5q=10"./0.1ml

■48

（10./ml）

.Karber法

病毒稀释度

出现CPE孔的比率

10-1

8/8=1

10-2

8/8=1

10-3

7/8=0.875

10-4

3/8=0.375

10-5

1/8=0.125

=0.8x（-1）

lgTCID5o=L-d（s-0.5）

L=最高稀释度的对数；D=ffi释度对数之间的差；S=m性孔比率总和

IgTCID50=-1-（-1）X（3.375-0.5）=-3.875TCID50=10'3'875/0.1ml

实验七中和实验（固定病毒一一稀释血清法）

器材：

细胞胰酶培养基吸管吸球96孔细胞培养板移液器吸头青霉素瓶病毒液被检血清标准阳性（阴性）血清

一•原理动物感染病毒后，体内能产生抗病毒抗体，抗体能与病毒粒子特异性的结合，使病毒丧失感染力。

2.步骤

1.将测好TCIC5。

病毒稀释成200个TCID50病毒悬液

2.在96孔微量培养板中将灭活作连续倍比稀释（在96孔微量培养板中先加入50ul的生长液，再加入50ul待检血清，混匀后，吸50ul至下一孔，如此直至（1:

256）每个稀释度作4孔

3.在上述各孔中加入50ul稀释好的200个TCI6D的病毒悬液，混匀后放入37C5%CO培养箱中作用45-60MIN

4.同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照（0.2TCID50,2TCIC5。

，20

TCID50，200TCIDsq）和正常细胞对照

5.感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放入37E5%CO培养箱中培养，逐日观察并记录结果

6.结果计算，按Reed-Muench两氏法或Kaber法进行

距离比例=

三、计算方法Reed-Muench两氏法

血清稀释度

CPE

孔数

无CPE孔数

累计

CPE

孔数

无CPE孔数保护率（%

4（10）

100

16（10-1.2）

64（10-1.8）

256（10-2.4）

1024（10-3.0

）4

高于50%保护率的％-50%=83-50/83-40=0.7

高于50%^护率的％-低于50%保护率的%

高于50%勺保护率血清稀释度的对数+距离比率*稀释系数的对数=-1.2+0.7X（-0.6）

=-1.66-1.66的反对数=1/46

即：

46稀释的待检血清可保护50%勺组织培养免于CPE

用途：

中和实验用于

1.疾病诊断

2.病毒分离株的鉴定

3.不同病毒分离株的抗原关系研究

4.疫苗免疫原性的评价

5.免疫血清的质量评价

6.测定实验动物血清中抗体的存在

例：

PRV中和实验

1.材料准备0.25%胰酶、BHK-21细胞、微量移液器、96孔细胞培养板、CO培养箱，倒置显微镜

2.操作步骤

2.1TCID50测定

2.1.1病毒培养和收获PRV接种于长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养液的10%37C培养，待出现CPE后，冻融，收获病毒

2.1.2病毒的测定DEME10倍稀释病毒，每个稀释度取100ul加入96孔细胞培养板中然后加入经0.25%胰酶的BHK-21细胞100ul（细胞含量以105/ml左右为宜），每个稀释度作8个重复，设空白细胞对照。

37C5%C2培养箱中

1.1.3TCID50测定逐日观察CPE并记录CPE孔数，直到对照细胞老化脱落为止，按

Reed-Muench法计算

2.2中和实验

将无菌采集的待检血清56C水浴灭活30min,用DME作倍比稀释，在96孔微量培养板中先加入50ul的生长液，再在第一孔加入待检血清50UL，吸50UL至下一孔，如此直至（1:

256）每个稀释度作2-4重复。

在上述各孔中加入50ul稀释好多200个TCID5。

的病毒悬液，混匀后放入37C5%C£培养箱中作用1小时，同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常对照，感作完成后每孔加入经0.25%胰酶消化的BHK-21细胞悬液，放37C

5%CS养箱中培养，逐日观察并记录结果

2.3计算抗体中和效价逐日观察CPE并记录CPE孔数，直到对照细胞老化脱落为止。

按

Reed-Muench法计算抗体中和效价。

如抗体中和效价为1:

2及1:

2以上，则判为PRV抗体

阳性。

例：

微量中和实验（改良法）首先在MARC-145ffl胞上增殖病毒，并测定其TCID50值，分离被检血清，56C灭活30MIN后在96孔细胞培养板中将血清作连续倍比稀释，从1:

2到1:

256,每个稀释度作4个重复，每孔50.0卩l，37C5%C£培养箱中作用1h，再于每孔中滴加2-5X105个/ml的Marc-145细胞悬液100.0卩l，轻轻摇匀后，放回培养箱中继续培养4-6天，观察细胞病变情况，按Reed-Muench两氏法计算被检血清中抗PRRS啲特异性中和抗体的滴度。

同时设有血清毒性对照，标准阴、阳性血清对照以及病毒和正常细胞对照。

鸡胚孵化一一鸡胚成纤维细胞制备一一病毒接种（PRVTCID50――中和实验测血清效价

实验八乳胶凝集实验

一．乳胶的处理

（一）乳胶的预处理

1.将10%^白乳胶轻轻摇匀，吸取2ml于试管内，加PBS8ml使乳胶浓度为2%

2•在2炕白乳胶内加入10%夷蛋白酶1.1ml，充分混合均匀，置56C水浴18h，其间摇动5-6次，使其作用完全。

3.取出乳胶，4C保存备用

（二）乳胶的致敏

1.吸取经预处理的2%空白乳胶9.6ml于小玻璃瓶内

2.用微量移液管吸取150ul40倍浓缩的PRV-Ag容液滴加到盛有等量（9.6ml）2烷白乳胶的小玻璃瓶内，边滴边摇动，使其充分混合均匀，置37C作用15-30min或室温2h，即为乳胶抗原。

可分装于小离心管，4C保存备用，切勿冻结

二、乳胶凝集实验操作方法

1.定性实验

用微量移液器吸取待检材料、阳性血清、阴性血清各20（约1滴）分别滴于载玻片不同位置上，然后在各液滴旁加量（20ul）乳胶抗原（如乳胶抗原出现分层，轻摇匀即可使用），用牙签将其搅匀，摇动载玻片1-2min，3-5min内观察结果，但有些弱阳性反应者需在20min时再观察一次，如不凝集，判为阴性。

如待检材料为新鲜血液，为防止血液凝固，应先滴加乳胶抗原于载玻片上，然后吸取血液与乳胶抗原迅速混匀，摇动玻片观察结果

如待检材料为乳汁，最好先离心，去沉淀，吸取上清作LAT检测

2．定量实验

先将血清在微量反应板或小试管内做倍比稀释，吸取各稀释度血清1滴（约20ul）于载玻片上，各滴加等量（20ul）乳胶抗原于一旁，如上述方法进行，判定，以出现“++”以上凝集者为阳性

++++全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边沿，液滴完全透明

+++大部分乳胶凝集，颗粒明显，液滴稍浑浊

++约50%乳胶凝集，但颗粒较浑浊

+有少许凝集，液体仍浑浊

乳胶致敏（PRV——乳胶凝集实验测血清效价并与中和效价进行比较

实验九HA、HI实验

器材：

血凝板吸头青霉素瓶吸管吸球红细胞离心管一．蚀斑技术

V蚀斑，即空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。

原理：

将病毒作10倍

连续的倍比稀释，随后各取定量，接种于已长成的单层的敏感细胞上，并覆盖一层固体介质中性红琼脂糖，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能感染和破坏附近的细胞。

经过几个增殖周期后，形成肉眼可见的变性细胞内即蚀斑后计数，即可计算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位

用途：

1）病毒纯化（克隆）；2）测定病毒悬液中感染病毒的含量（蚀斑减数实验）；3）检测不产生CPE的病毒，因有的在一般单层细胞上不形成CPE但可以在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。

二．蚀斑减数实验

将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层的敏感细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基维数，进行蚀斑测定，比较病毒——正常血清组以及病毒——待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。

以实验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定的依据，血清稀释度就是其蚀斑减数实验效价。

三．交叉保护实验

先将实验动物进行主动或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检病毒的种类或类型。

但周期长，需大量实验动物。

应用：

用已知病毒/已知血清鉴定未知血清（未知病毒）/未知病毒。

实验动物：

家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠注意：

选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系、以及适宜的接种途径和剂量。

用途：

1）分离病毒，并借助干扰那范围实验鉴定病毒

2）培养病毒，制造抗原和疫苗

3）测定各毒株之间的抗原关系（中和实验和交互保护实验）

4）制备高免血清和单克隆抗体

5）作V感染的实验研究，包括V毒力测定、建立病毒病模型动物

病毒的分离和鉴定：

（方法途径）细胞病变；电镜观察；TCID5o测定；中和实验；免疫荧

光实验；对理化学因子的敏感

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