分子生物实验备考资料.docx
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分子生物实验备考资料
专题一、核酸的分离纯化及电泳检测
专题二、PCR技术及基因克隆
专题三、RealTimePCR技术及其应用
专题四、核酸测序与人类基因组计划
专题五、基因芯片与转录组测序
专题六、分子杂交技术及其应用
专题七、双向电泳与质谱检测（可手动补充）
分子生物学是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
专题一、核酸的分离纯化与电泳检测
掌握核酸分离纯化的原则；
保持核酸结构的完整性（防止降解）
尽量排除其它分子的污染，提高纯度
掌握核酸提取的基本步骤；
1、核酸的释放（裂解细胞、释放核酸）
2、核酸的分离纯化
（1）加入SDS
（2）加入浓盐溶液（如NaCl）（3）酚/氯仿抽提
3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤（沉淀是浓缩核酸最常用的方法,常用的有机沉淀剂
乙醇、异丙醇、聚乙二醇）
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力（核酸与碱性蛋白的结合）、氢键和非极性的范德华力。
掌握核酸浓度和纯度的检测方法；
1紫外分光光度法鉴定核酸1）紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
2）紫外分光光度法分析纯度
2荧光光度法鉴定核酸1）测定核酸含量
2）荧光光度法鉴定核酸纯度
补充：
1、在波长260nm紫外光下，1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37μg/ml；RNA为40ug/ml。
2、分光光度计先校正零点。
3、230nm（小分子杂质）、260nm（核酸）和280nm（蛋白质）的OD值
4、纯的DNA样品OD260/OD280=1.8（1.7~1.9）
OD260m/OD230>2.0
纯的RNA样品OD260／OD280=2.0（1.7~2.0）
OD260/OD230>2.0
3核酸的保存
（1）DNA
①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；
②长期保存样品中可加入1滴氯仿。
（2）RNA
①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc（pH5.2）或双蒸灭菌水中，-70℃保存;
②可以沉淀形式贮于乙醇，可在-20℃中长期保存;
③最常用无Rnase水或高压后的DEPC水溶解RNA，冻贮于-70~-80℃。
掌握核酸电泳的方法；
电泳（Electrophoresis）：
是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象。
电泳技术：
利用带电粒子或者分子在电场中移动速度不同而达到对粒子或分子进行分离的技术。
电泳的相关参数
电荷：
决定其在电场中的迁移方向。
分子大小：
决定了在特定电场强度下一定时间内分子在介质中的迁移距离。
电场强度：
决定了带电粒子或分子在电场中的迁移速度。
介质密度：
决定了特定分子在其中的迁移距离，因此决定其对不同分子的分辨能力。
指示剂：
溴酚蓝（300bp）
二甲苯青（4000bp）
染色剂：
溴化乙锭
常用缓冲液
TAE：
Tris-乙酸可用于核酸纯化。
TBE：
Tris-硼酸不用于核酸纯化。
TPE：
Tris-磷酸缓冲容量大，不可用于核酸纯化。
基因组DNA的提取方法：
酚抽提法
基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）
3）其他的基因组DNA提取方法
4）DNA样品的进一步纯化
5）DNA片段的回收
2质粒的提取和纯化
碱裂解法提取质粒
质粒DNA的纯化与回收
RNA的分离和纯化：
排除RNase的污染是RNA制备成功与否的关键
3）mRNA的分离和纯化
核酸纯化的用途PCR、RealTimePCR、DNA测序、分子杂交、基因芯片、转录组测序
例题
下列哪个不是核酸提取的步骤之一？
（D）
A核酸的释放B核酸的分离纯化
C核酸的浓缩、沉淀与洗涤D核酸的扩增
下列哪个试剂不能用于核酸的沉淀？
（C）
A乙醇B异丙醇C异戊醇D聚乙二醇
用紫外光度法测定核酸浓度时，在波长260nm紫外光下，1OD的吸光度相当于双链DNA浓度为？
（A）
A50μg/mlB40μg/mlC37μg/mlD60μg/ml
纯化RNA时，下列说法不正确的是？
（D）
A需要洁净的实验环境BTrizol法是常用的方法之一
C所用的枪头和离心管等必须是无RNA酶的D和纯化DNA要求差不多
RNA的水溶液可以在-20℃冰箱里长期保存。
（×）
OD260/OD280是检测核酸纯度的一个重要指标。
（×）
碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法。
（√）
下列关于核酸电泳的说法，不正确的是？
（A）
A分子量越大，泳动越快B电压越高，泳动越快
C琼脂糖浓度越大，泳动越慢D电泳时缓冲液应没过凝胶
DNA电泳时，样品从正极向负极泳动。
（×）
琼脂糖浓度越高越适于分离大片段DNA。
（×）
同琼脂糖相比，聚丙烯酰胺用作DNA电泳的胶支持物时通常用于分离小片段DNA。
（√）
配制琼脂糖凝胶时，是直接用蒸馏水溶解琼脂糖。
（×）
专题二、PCR技术及基因克隆
掌握基因克隆的五个步骤；
经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程，通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
分、切、连、转、选
基因克隆需要什么？
目的基因、载体、宿主
掌握PCR的原理、步骤、反应体系、特点、应用等；
PCR：
聚合酶链式反应
PCR的原理
是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。
PCR过程的“三个步骤”
变性（90℃-98℃）：
双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。
退火（25℃-65℃）：
系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
延伸（70℃-75℃）：
在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
PCR反应体系的“五个要素”：
模板、引物、dNTP、缓冲液（其中需要Mg2+）
、DNA聚合酶
引物是人工合成的两段寡核苷酸序列
PCR反应的特点：
特异性强、灵敏度高、简便、快速、对标本的纯度要求低
PCR的应用：
基因克隆，DNA测序，分析突变，诊断，人类基因组工程，各种肿瘤检测
PCR的种类：
基因组PCR、反（逆）转录PCR、实时定量PCR等
例题：
在一个PCR循环中不包含下面哪个步骤？
（D）
A.变性B.延伸C.退火D.杂交
下列哪个物质不是PCR反应时所必需的？
（B）
A.引物B.Ca2+C.Taq酶D.模板
下列哪个不是PCR的特点？
（D）
A.特异性强B.灵敏度高C.简单快速D.试验成本高
PCR反应中变性、退火、延伸的大致温度分别为？
（A）
A.95,55,72B.95,72,55C.72,95,55D.55,72,95
掌握载体必需具备的基本特点；
载体：
是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。
载体的功能：
运送外源基因高效转入受体细胞
为外源基因提供复制能力或整合能力
为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
基本特点：
能在宿主细胞中进行独立的复制
具有多克隆位点，可插入外源DNA片段
有合适的筛选标记，如抗药性
大小合适，易于分离纯化
拷贝数多
质粒消除：
受环境因素影响导致质粒丢失的过程。
质粒不相容性：
同一复制和维持机制的不同质粒不能在同一宿主细胞内稳定共存，在细胞分裂时将进入不同的子代细胞。
克隆载体（CloningVector）：
可携带插入的目的DNA进入宿主细胞内并能自我复制的DNA分子。
此种DNA分子含有能在宿主中复制的位点和便于筛选的遗传标志。
表达载体（ExpressionVector）：
在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
例题：
下列对质粒载体描述不正确的是（A）
A.只要酶切位点合适，可以作为任意大小DNA片段的载体
B.一般有克隆位点C.必需有报告基因
D.可自主复制
下列哪个不是用于基因克隆的载体必需具备的条件？
（C）
A.复制起始位点B.筛选标记基因
C.表达元件D.多克隆位点
下列哪个质粒与临床分子生物学检验关系最为紧密？
（B）
A.F质粒B.R质粒C.T质粒D.Col质粒
细菌一旦获得质粒就不可能再丢失。
（×）
质粒有不相容性。
（√）
掌握限制性内切酶、连接酶的特点；
限制性内切酶：
定义：
能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。
限制性内切酶（RE）：
识别特定的核苷酸序列和具有特定的酶切位点 、特异性很高、常由4～6个核苷酸组成、一般具有回文结构、少数内切酶识别序列中的碱基可以有规律地替换
DNA连接酶：
1、DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。
2、T4噬菌体DNA连接酶可连接DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。
3、大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端DNA分子。
4、DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶。
例题：
已知某一内切核酸酶在一个线状DNA上有3个切点，因此，用此酶切割该DNA可得到几个片段？
（D）
A.1B.2C.3D.4
限制性核酸内切酶可对（A）的特异性部位进行切割？
A.双链DNAB.单链DNAC.多肽链D.mRNA
对限制性内切核酸酶的作用，下列描述哪个不正确？
（B）
A.识别序列长度一般为4~6bpB.只能识别和切割原核生物DNA
C.识别序列具有回文结构D.切割生物DNA分子
下列哪项不是重组DNA的连接方式？
（C）
A、粘性末端与粘性末端的连接B、平端与平端的连接
C、粘性末端与平端的连接D、人工接头连接
一个识别4个碱基的限制性内切酶在基因组上的出现频率大约是4-6。
（×）
了解感受态的定义、转化的方法和蓝白斑筛选的原理。
感受态细胞：
为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取DNA的能力。
经过这种处理的细胞被称作感受态细胞
蓝白斑筛选：
白色菌落代表该菌中外源DNA已经插入到质粒上,蓝色代表没有插入或插入失败。
例题
细菌能够吸收转化因子的生理状态称为（B）
A：
吸附态B：
感受态C：
转化态D：
超能态
原核表达系统最常用的宿主细胞为（A）
A：
大肠杆菌B：
酵母C：
哺乳动物细胞D：
枯草芽孢杆菌
将质粒转入大肠杆菌的过程属于？
（B）
A：
接合B：
转化C：
转染D：
转导
利用蓝白斑筛选法筛选重组克隆时，白色菌落代表该菌中外源DNA已经插入到质粒上。
（√）
专题三、RealTimePCR技术及其应用
实时荧光定量PCR
掌握实时荧光定量PCR的定义；
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。
普通PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化。
通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系。
实时荧光定量PCR的优点：
实时监控、精确测定（对样本中的起始材料量进行准确定量）、检测动态范围、单管
通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量。
掌握Ct值和荧光阈值的定义；
Ct值是扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。
荧光阈值（thresholdvalue）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上。
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
掌握实时荧光定量PCR的绝对定量方法；
定量原理
C（t）与初始模板浓度的对数值成线性关系；
初始模板量越多，C（t）值越小
通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。
（标准曲线法的绝对定量：
原理是将预先已知含量的标准品稀释成不同浓度的样品并作为模板与待测样品同时在实时荧光PCR仪进行扩增，所得结果根据经系列稀释的并且已知含量的标准品经扩增后得出的标准曲线，横坐标为标准品起始拷贝数的对数，纵坐标为Ct值）对比。
对待测样本进行定量时，根据待测样品的Ct值，即可从标准曲线方程中计算出待测样品的起始拷贝数。
相对定量：
表达量要相对恒定，不受处理因素的影响。
）
了解SYBRGreenI和TaqMan的特点；
非特异性荧光标记：
1、SYBRGreenI
特异性荧光标记：
2、TaqMan
SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光
方法2--TaqMan法，5′端标记有报告基团（Reporter,R）
3′端标记有荧光淬灭基团（Quencher,Q）
了解实时荧光定量PCR的相对定量方法；
1、定量PCR实验基本流程
选择基因，设计引物
准备模板（DNA或RNA）
PCR反应（DNA/cDNA+引物探针+PCRmix）
填样品表（样品名、孔位，样品类型、探针颜色）
设置参数（循环参数、反应体积、熔解曲线）
运行PCR，自动分析数据
进一步分析数据（基线、阈值、CT值、相对表达等）
定量PCR进行绝对定量的优势
敏感性高、大范围拷贝数样品同时检测、省时有效
相对定量方法
了解熔解曲线分析及其用途。
熔解曲线主要是用来分析PCR产物的特异性，随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线
例题：
下列关于实时荧光定量PCR的说法，不正确的是（C）
A．需要引物、模板和DNA聚合酶B．需要荧光标记
C．对扩增的产物进行定量D．对起始模板进行定量
以下是经过PCR扩增后得到的Ct值，哪个样品的DNA原始拷贝数最多（A）
A．样品A，Ct=20B．样品B，Ct=22
C．样品C，Ct=24D．样品D，Ct=26
实时荧光定量PCR是对PCR产物进行定量的技术。
×
实时荧光定量PCR可用来检测基因表达的水平。
√
在实时荧光定量PCR研究中，SYBRGreenI是一种特异性荧光探针。
×
实时荧光定量PCR反应中，利用TaqMan探针研究时需要结合熔解曲线分析。
×
实时荧光定量PCR研究时，初始模板量越多，Ct值越小。
√
专题四、核酸测序与人类基因组计划
掌握什么是基因、基因组和基因组学；
元素周期表的发现奠定了二十世纪物理、化学研究和发展的基础
“基因组序列图”将奠定二十一世纪生命科学研究和生物产业发展的基础！
基因组（Genome）：
生物有机体的单倍体细胞中所有DNA的总称，包括细胞核内的DNA和各种细胞器中的DNA。
基因组学（Genomics）：
研究基因组的结构、功能及表达产物的学科。
包括三个不同的亚领域，即结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学。
掌握单核苷酸多态性的定义；
短串联重复序列（STR）也叫简单序列重复。
多态性主要来自重复序列拷贝数的变化
单核苷酸多态性：
指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。
掌握双脱氧链终止法DNA测序的原理；
Sanger的双脱氧链终止法：
通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的序列，合成的互补单链可在不同位置随机终止反应。
DNA聚合酶的双脱氧链终止原理：
1该酶能以单链DNA为模板，合成出准确的DNA互补链序列；
2如果以2’,3’-双脱氧核苷三磷酸为底物，掺入到新合成的寡核苷酸链的3’端后，DNA链的延伸被终止。
手工法测序、自动化测序
掌握全基因组鸟枪法的步骤；了解逐步克隆法的原理；
了解人类基因组计划相关内容；
人类基因组计划概述：
人类基因组计划准备用15年时间，投入30亿美元，完成人类全部24条染色体的3×109脱氧核苷酸对（bp）的序列测定。
HGP的主要任务：
主要任务包括作图、测序和基因识别。
作图和测序是基本的任务，在此基础上解读和破译生物体生老病死以及和疾病相关的遗传信息。
HGP的最终目标：
通过国际合作，阐明人类基因组全部DNA序列；
识别基因；
建立储存这些信息的数据库；
开发数据分析工具；
研究HGP实验所带来的伦理、法律和社会问题；
人类基因组计划1%测序中国实验室
了解焦磷酸测序法的原理；
焦磷酸测序原理
了解第二、三代测序的种类；
第二代测序技术：
454测序、Solexa-Illumina测序
第三代测序技术：
以单分子实时测序和纳米孔为标志
了解细菌人工染色体、酵母人工染色体。
细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome,BAC）：
利用细菌的F质粒及其调控基因构建。
克隆能力在125~150kb左右。
酵母人工染色体技术（yeastartificialchromosome,YAC），利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。
例题：
Sanger链终止测序法中用于终止DNA合成的化合物为单脱氧核苷酸。
（X）
下列哪一个不是双脱氧链终止法测序反应体系里的成分？
（D）
A．DNA聚合酶B．ddNTPC．dNTPD．焦磷酸
Sanger链终止法是一种基于边合成边测序的方法。
（X）
下列关于Sanger链终止测序法和PCR的描述不正确的是？
（C）
A．都需要DNA聚合酶；B．都需要dNTP;
C．都需要一对引物；D．都需要模板。
全基因组鸟枪法中需要构建100kb左右的大片段文库。
（X）
和逐步克隆法相比，鸟枪法对计算机性能的要求更高。
（Y）
在人类基因组计划中，中国承担了10%的测序工作。
（X）
人类基因组序列约3000Mb。
（Y）
单核苷酸多态性达到了多态位点数目的极限。
（Y）
SNP中大多是颠换，即一种嘌呤碱基替换为一种嘧啶碱基。
（X）
专题五、基因芯片与转录组测序
掌握变性、复性和核酸分子杂交的概念；
变性：
在酸、碱、热及某些变性剂等因素存在的条件下，DNA分子双链间的氢键断裂，双链DNA分子解离成两条无规则的卷曲状单链DNA的过程。
增色效应：
260nm
Tm值：
50%
复性：
变性因素去除后，两条DNA单链通过碱基互补重新结合成稳定的双链结构的过程。
退火：
缓慢冷却
淬火：
骤然冷却
核酸分子杂交：
不同来源的单链核酸分子在合适的条件下，通过碱基互补形成双链杂交体的过程。
掌握核酸探针的定义和种类；
核酸探针：
指能与待测的靶核酸序列互补杂交的已知序列的核酸片段。
种类：
基因组DNA探针：
来源是染色体DNA
cDNA探针：
来源是mRNA
RNA探针：
来源是mRNA
寡核苷酸探针：
人工合成
主要特点:
DNA探针：
制备方法简便、探针稳定、标记方法较成熟多样、含有内含子序列，杂交效率低
cDNA探针：
具备DNA探针的优点，但不含有内含子
RNA探针：
杂交的特异性更高。
杂交的效率较高。
非特异性杂交也较少，本底降低。
寡核苷酸探针：
杂交的时间比克隆探针短、杂交信号强、制备方便，价格低廉、探针质量稳定
探针的制备方法：
（1）DNA重组技术
（2）PCR扩增（3）化学合成
掌握Southernblot、Northernblot、Westernblot的定义和基本实验流程；
分子杂交技术：
1、Southernblot
2、Northernblot
3、Westernblot
4、原位杂交（insituhybridization）
5、斑点杂交（dothybridization）
1、Southernblot：
DNA分子杂交技术，双链DNA分子的变性并和带有互补序列的同源单链间的配对过程
2、Northernblot：
一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
流程：
制备RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应
灵敏度要好于基因芯片，不如定量PCR
3、Westernblot蛋白质印迹法，又称免疫印迹法
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
流程：
蛋白样品的制备、SDS-PAGE、转膜、封闭、一抗杂交、二抗杂交、底物显色
掌握荧光原位杂交的定义；
原位杂交（ISH）：
是将核酸分子杂交技术与组织细胞化学、免疫组织化学技术相结合，在保持细胞形态的条件下，检测与探针互补的核酸序列在细胞中的空间位置，从而对单一细胞中DNA及mRNA进行定位研究的一种技术。
用荧光标记的核酸探针与待测标本中的核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，达到对染色体或基因异常的细胞、组织标本进行检测和诊断的目的。
了解核酸标记物的种类、标记方法和检测方法。
探针标记物的种类：
放射性核素、非放射性探针
核酸探针的标记方法：
酶促法、缺口平移法、随机引物法、PCR法
核酸探针的检测：
放射性探针
放射自显影或液体闪烁计数器
非放射性探针
直接法：
酶促显色法、荧光法、化学发光法
间接法：
偶联反应
显色反应（酶促显色法、荧光法、化学发光法）
斑点杂交：
将样品点在支持膜上进行分子杂交的技术。
例题：
核酸探针的种类不包括？
（D）
A.基因组DNA探针B.寡核苷酸探针
C.cDNA探针D.抗体探针
下列哪个不属于分子杂交的实验流程之一？
（D）
A.电泳B.转膜C.杂交D.测序
Westernblotting是用来研究（C）的技术。
A.DNAB.RNAC.蛋白质D.mRNA
Northernblotting是用来研究（B）的技术。
A.DNAB.RNAC.蛋白质D.mRNA
原位杂交技术是从（A）技术衍生而来的？
A.FISHB.SAGE
C.GISHD.Southern杂交和Northern杂交
为了分析小鼠肝脏组织中某一特定基因在不同条件下表达水平的变化，可能采用的实验手段为？
（A）
A.NorthernblottingB.酵母双杂交
C.SouthernblottingD.荧光原位杂交
探针标记物的种类主要有放射性核素和非放射性标记物。
Y
核酸探针的标记方法主要有酶促法和化学法。
Y
专题六、基因芯片与转录组测序
掌握基因芯片的概念；
将大量DNA或寡核苷酸密集排列所形成的探针阵列固定于支持物上，再与标记的数以千记的DNA片段同时进
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