Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞.docx
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Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
（一） 原理
Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。
渗透压很低（<20mosm／kgH２O）,粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力（200～1000g）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。
由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。
此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
（二）操作方法及注意事项
1.不同浓度（密度）Percoll溶液的制备:
先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85％NaCl或0.15MPBS）稀释到所需浓度。
Percoll浓度（％） 70 60 50 40 30 20
比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
2.不连续密度梯度Percoll层的制备:
先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。
在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。
3.装样：
样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。
4.离心：
一般采用离心力为400g，时间20～25min。
由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。
5.取样：
当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。
收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
（三）分离纯化细胞举例
1.富含NK活性大颗粒淋巴细胞（LGL）的纯化:
按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管（或塑料管）分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。
一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。
2.纯化淋巴母细胞和除去死细胞：
分别叠加50％和30％Percoll液。
收取经PHA（或其它抗原、有丝分裂原）刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC（如肾综合征出血热患者），按要求装样、离心和取样。
位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。
收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。
（四） 人不同血细胞的漂浮密度
表 人不同血细胞的漂浮密度
──────────────┬──────────────────
细 胞 漂浮密度 │细 胞 漂浮密度
──────────────┼──────────────────
红细胞 1.09-1.11 │淋巴细胞 1.052-1.077
粒细胞 │B淋巴细胞 1.062-1.075
嗜酸性 1.09-1.095 │T淋巴细胞 1.065-1.077
嗜中性 1.080-1.085 │淋巴母细胞 1.065-1.077
单核细胞 1.050-1.066 │自然杀伤细胞 1.050-1.070
血小板 1.030-1.060 │
──────────────┴──────────────────
（五）问与答
问：
请问percoll连续梯度怎么配制？
比如15%---75%的percoll连续梯度?
答：
根据你需要的具体密度梯度决定的，根据要分离的不同细胞种类，数量等等，也有用原液配的。
也有用80％配的，不一定的。
另外，percoll本身是低渗透压的，要用高渗透压溶液配成生理等渗透压溶液，然后使用，不然，细胞容易破裂。
一般是先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85％NaCl或0.15MPBS）稀释到所需浓度。
即取Percoll原液与10倍浓缩的PBS以9：
1的比例混合，此时溶液为100％Percoll，比重是1.127，毫克分子渗透压浓度为290mOsmol/kg
Percoll浓度（％） 70 60 50 40 30 20
比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
Percoll是经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone,PVP）处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。
Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。
将1份10XPBS与9份Percoll贮存液混合，制成等渗Percoll悬液，此悬液被认为是100％Percoll悬液，其密度为1.1294g/ml。
用PBS或细胞培养液稀释100％Percoll而获得所需密度的Percoll分离液用于相应细胞的分离。
若分离淋巴细胞应使用1.0777g/ml，配制时用稀释液稀释60％即可。
取比重1.077的Percoll分离液Xml与离心管中，将等倍稀释的抗凝血1/2Xml小心叠加在分离液上，经水平离心（1500rpm）后，便得四个细胞层，从而分离出淋巴细胞。
表层为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单核细胞，下层富含淋巴细胞。
该法是纯化淋巴细胞和单核细胞的一种较好的方法，淋巴细胞纯度高达98%，单核细胞纯度可达78%。
基本原理：
本文分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。
此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。
试剂与器材
·外周血单个核细胞
·PBS1×和PBS10×（无Ca2+、Mg2+），含0.5mMEDTA
·胎牛血清（56℃，30分钟加热灭活）
·HCl1mol/l
·Percoll分层液（密度=1.130g/ml,商品）
·4g/L台盼蓝染液（溶解在PBS液中）
·50ml聚丙烯圆锥管
·毛细吸管
·移液管（1、2、10ml）
·CO2孵箱
·超净台
·有旋转桶转子装置的离心机
·PH计
易生物仪器库：
易生物试剂库：
操作步骤：
所有的操作应该在无菌条件下进行
（一）不同密度Percoll分层液的配制
1.Percoll分层液储备液的制备：
取未稀释的Percoll原液（从瓶中取）9ml+1mlPBS10×（无Ca2+、Mg2+），用HCl1PH至7.4
2.Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：
取Percoll储备液3.12ml（前一步配制）+1.88mlPBS1×（无Ca2+Mg2+）
3.Percoll分层液（Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：
取Percoll分层液（Ⅰ）2.68ml+2.32mlPBS1×（无Ca2+、Mg2+）
4.Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：
取Percoll分层液（Ⅱ）2.32ml+2.68mlPBS1×（无Ca2+、Mg2+）
（二）不连续密度梯度制备
1.将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在这层液体的表面上轻轻铺上2mlPercoll分层液（Ⅱ）（密=1.069g/ml），后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）
2.20℃，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟（慢慢增加速度，无制动停转）。
（三）单核细胞的分离
1.离心后单核细胞存在于Percoll分层液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度较小的部分）之间的界面中。
2.用毛细吸管仔细收集单核细胞。
3.用含1-5%胎牛血清的PBS1×液洗涤细胞3次，4℃，400×g离心5分钟，弃上清液。
4.若需要进一步实验，将细胞重新悬浮于培养基中。
5.用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。
结果：
本法回收的细胞中单核细胞占70-100%（存活率应大于90%），淋巴细胞占0-20%，粒细胞占0-5%，红细胞占0-7%，血小板小于0.5%。
实验要点
1.为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。
2.所有操作过程应在18-20℃中进行。
3.仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。
4.洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。
5.如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠，以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。
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1.不同浓度（密度）Percoll溶液的制备:
先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85％NaCl或0.15MPBS）稀释到所需浓度。
Percoll浓度（％） 70 60 50 40 30 20
比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
2.不连续密度梯度Percoll层的制备:
先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。
在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。
3.装样：
样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。
4.离心：
一般采用离心力为400g，时间20～25min。
由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。
5.取样：
当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中''则需要逐层收集。
收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
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Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
撰写 金伯泉
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（一） 原理
Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。
渗透压很低（<20mosm／kgH２O）,粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力（200～1000g）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。
由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。
此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
（二）操作方法及注意事项
1.不同浓度（密度）Percoll溶液的制备:
先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85％NaCl或0.15MPBS）稀释到所需浓度。
Percoll浓度（％） 70 60 50 40 30 20
比重g／ml 1.0901.0771.0671.0561.0431.031
2. 不连续密度梯度Percoll层的制备:
先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。
在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。
3. 装样：
样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。
4. 离心：
一般采用离心力为400g，时间20～25min。
由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。
5. 取样：
当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中,则需要逐层收集。
收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
（三）分离纯化细胞举例
1. 富含NK活性大颗粒淋巴细胞（LGL）的纯化:
按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll,如用10ml试管（或塑料管）分离,每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×10８悬于１ml培基中，按要求装样、离心和取样。
一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。
2. 纯化淋巴母细胞和除去死细胞：
分别叠加50％和30％Percoll液。
收取经PHA（或其它抗原、有丝分裂原）刺激PBMC,或含有较高比例异型的PBMC（如肾综合征出血热患者），按要求装样、离心和取样。
位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Percoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。
收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。
（四） 人不同血细胞的漂浮密度
表 人不同血细胞的漂浮密度
──────────────┬──────────────────
细 胞 漂浮密度 │细 胞 漂浮密度
──────────────┼──────────────────
红细胞 1.09-1.11 │淋巴细胞 1.052-1.077
粒细胞 │B淋巴细胞 1.062-1.075
嗜酸性 1.09-1.095 │T淋巴细胞 1.065-1.077
嗜中性 1.080-1.085 │淋巴母细胞 1.065-1.077
单核细胞 1.050-1.066 │自然杀伤细胞 1.050-1.070
血小板 1.030-1.060 │
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。
取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑
（1）细胞纯度；
（2）细胞获得量；（3）细胞活力；（4）使用方法的简易程度和本室条件等。
目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
（一） 原理:
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1.077±0.001的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografin）（F／H）分层液。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。
吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
（二） 方法:
1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。
水平离心2000rpm×20分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。
中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带（如下图），单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
此外，还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度（细胞数／1毫升细胞悬液）＝
4个大方格内细胞总数
────────── × 10４×2（稀释倍数）
4
6. 细胞活力检测：
死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。
计数200个淋巴细胞。
计算出活细胞百分率。
活细胞数
活细胞百分率＝────── ×100％
总细胞数
用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。
（三） 试剂和材料:
比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺（商品名为淋巴细胞分离液）。
Hank's液（无Ca２＋、Mg２＋）
10％小牛血清RPMI1640
0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。
肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。
短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
无菌干燥注射器针头。
碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
血球计数板、显微镜、水平式离心机。
（四） 注意事项:
1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
（五） 附录
1. Hank's液（无Ca２＋、Mg２＋）配制法
NaCl8.0克
KCl0.4克
Na２HPO４·12H２O0.12克
KH２HPO４ 0.06克
葡萄糖 1.0克
双蒸水 1000毫克
1％酚红液 2毫克
将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
2. 细胞分层液配制法
9％聚蔗糖 24份
34％泛影葡胺 10％
混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤器过滤除菌。
４℃冰箱保存备用。
3. 磷酸缓冲液（PB）
原液:
A液:
0.2MNaH２PO４溶液
NaH２PO４ 27.6克
或NaH２PO４·2H２O 31.2克
蒸馏水 溶解至 1000毫升
B液：
0.2MHa２HPO４溶液
Ha２HPO４·12H２O 71.6克
蒸馏水溶解至1000毫升
各种不同PH值PB的配法
───────────────────────────────────────
PH 7.07.27.47.67.88.0
───────────────────────────────────────
A液（ml）39.028.019.013.08.55.5
B液（ml）61.072.081.087.091.094.5
───────────────────────────────────────
举例:
0.1M PH7.2PB
A液 28毫升
B液 72毫升
加蒸馏水 100ml
4. 血球保存液
葡萄糖 2.05克 枸椽酸钠 0.8克
氯化钠 0.42克 蒸馏水 100毫升
将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶（100毫升）。
经10磅、10分钟高压灭菌。
4℃保存备用。
5. RPMI-1640培养液:
RPMT-1640（FLOW公司出品） 1袋
三蒸水 1000毫升
电磁搅拌30分钟：
1N HCl调PH7.2～7.4（约加2.5毫升），过滤除菌，作无菌试验，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养液:
RPMI-1640 95毫升
0.1M丙酮酸钠 1毫升
0.2M谷氨酰胺 1毫升
1M Hepes1毫升
7.5％NaHCO３1毫升
青霉素、链霉素（各1万单位） 1毫升
完全RPMI-1640培养液
不完全1640培养液 90毫升
灭活胎牛（或新生牛）血清 10毫升
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