NEMHS纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究.docx

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NEMHS纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究

NE（MHS）纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究

【摘要】目的:

制备包裹有MAGE1Hsp70和SEA的复合抗原的纳米乳剂疫苗NE（MHS）（nanoemulsionencapsulatedMAGE1Hsp70/SEA）,评判其抗肿瘤免疫学特性。

方式:

采纳磁力超声法制备纳米疫苗NE（MHS）,评判其粒径、包裹率及稳固性;NE（MHS）免疫动物,IFNγELISPOT和LDH杀伤实验检测疫苗激活机体特异性细胞免疫反映情形;肿瘤解决实验检测纳米乳剂疫苗的抗肿瘤效应。

结果:

（1）成功制备出粒径为（20±5）nm的NE（MHS）,其药物包裹率为87%,于4℃放置6个月后或3000r/min10min离心后无分层;

（2）与其他组相较,NE（MHS）组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFNγ的T细胞数量明显增多（P<）,CTL对B16MAGE1的特异性杀伤作用明显增强;NE（MHS）组B16MAGE

1肿瘤成瘤时刻长、成瘤率低。

结论:

NE（MHS）纳米乳剂疫苗具有良好的理化性质,能够刺激机体产生强烈的MAGE1特异性的细胞免疫,能有效预防表达MAGE1的肿瘤细胞解决,是一种很有希望的新型抗肿瘤疫苗。

【关键词】纳米乳剂肿瘤疫苗MAGE1Hsp70SEA

肿瘤疫苗作为预防肿瘤患者术后复发和转移的有力手腕,最近几年来已取得普遍的研究和应用。

目前,已有多种疫苗进入临床实验时期。

可是由于肿瘤免疫反映的复杂性,肿瘤疫苗距成为医治型疫苗并真正走向临床实际应用尚有距离。

考量各方面因素、综合各设计方案,本实验拟在已有研究的基础上,对所构建的肿瘤基因工程纳米疫苗进一步改良,并研究其抗肿瘤免疫学特性,为疫苗走向临床前研究打下实验基础。

　　1材料和方式

　　材料

　　大豆油、poloxamer18八、span80购自美国Gibco公司。

C57BL/6小鼠由第四军医大学动物中心提供。

MAGE1Hsp70蛋白、SEA蛋白由本实验室表达纯化制备。

转MAGE1基因的小鼠黑色素瘤细胞由本实验室叶菁博士构建。

ELISPOT检测试剂盒购自法国DIACLONE公司。

　　Cytotox96检测试剂盒购自美国Promega公司。

　　油包水型纳米乳剂NE（MAGE1/Hsp70+SEA,MHS）的制备

　　采纳磁力超声法。

具体:

mg复合抗原（融合蛋白MAGE1/Hsp70与超抗原SEA按摩尔比100∶1混合）、80g/LSpan20、180g/LPluronic188和mL大豆油,双蒸水调整体积为mL,混合均匀取得油相;在3000r/min磁力搅拌下,将油相逐滴加入mL双蒸水水相中;将混合物移至真空高速剪切乳化机上,在kpa真空下,23000r/min,高速剪切40min,温度操纵在80℃以下;冰浴下40kHz超声5min,反复3次,即取得纳米疫苗（g/L）。

用μm的滤膜过滤除菌后,于4℃保留。

　　NE（MHS）的性质鉴定

　　形态观看

　　将制成的NE（MHS）100倍稀释于生理盐水中,取100μL滴于400目铜网上,1min后吸去上清,10g/L磷钨酸染色1min,自然晾干后在透射电子显微镜下观看其形态。

　　粒径检测

　　将搜集的图象经运算机图象分析求得NE（MHS）的平均粒径。

　　包裹率及稳固性测定

　　采纳SephedexG100凝胶层析法,洗脱液为PBS,流速为mL/min。

取NE（MHS）mL上柱,搜集游离峰即为游离的MHS。

将搜集的游离MHS用分光光度计测定A280值。

同时制备不同浓度的MHS标准蛋白样品,用分光光度计测定其光度值,并绘制浓度与

光度值的标准曲线。

以标准曲线为依据,计算出NE（MHS）中游离MHS的含量。

包裹率按公式计算:

包裹率=（W总－W游）/W总×100%。

（W总为制备时所用MHS的总量,W游为游离的MHS的量）。

将制备的NE（MHS）置于4℃冰箱保留6个月后或3000r/min10min离心后,电镜观看纳米乳剂形态,明确其稳固性。

　　纳米乳剂蛋白疫苗的细胞免疫反映

　　动物的分组、免疫和小鼠脾淋巴细胞的分离与活化取4～6周龄的二级C57BL/6小鼠（H2b）,雌雄不拘,体质量（18±2）g,随机分为6组,每组6只。

分组情形为:

（1）PBS对照组:

PBSmL/鼠;

（2）NE（－）对照组:

空白纳米乳剂mL/鼠;（3）MAGE1Hsp70免疫组:

注射MAGE1Hsp70融合蛋白14μg（150pmol/L）;（4）NE（MAGE1Hsp70）免疫组:

注射纳米乳剂包裹的MAGE1Hsp70融合蛋白疫苗14μg（150pmol/L）;（5）MAGE1Hsp70/SEA免疫组:

注射MAGE1Hsp70融合蛋白14μg（150pmol/L）和SEA蛋白μg（pmol/L）;（6）NE（MHS）免疫组:

注射纳米乳剂包裹的MAGE1Hsp70/SEA复合蛋白疫苗14μg（150pmol/L）。

各组别离在1d、11d和21d腹腔注射免疫,注射体积均为每次150μL/鼠。

末次免疫后10d,无菌取小鼠脾脏,Ficoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。

　　分泌IFNγ的MAGE1特异性T细胞的检测（IFNγELISPOT）

　　别离以所取得的小鼠脾淋巴细胞为效应细胞,别离以转染MAGE1阳性的B16细胞和未转染MAGE1的B16细胞为靶细胞,每组同时设立不加靶细胞的阴性对照孔和PHA刺激阳性对照孔。

用抗小鼠IFNγ的底层抗体包被PVDF板,反映孔加入按20∶1比例的效应细胞和靶细胞,37℃反映20h后洗涤并加上层抗体及酶标二抗。

避光显色20min,蒸馏水冲洗终止反映。

1200dpi扫描读取斑点数。

用实验孔斑点数减去阴性对照孔斑点数后求出每组的平均值。

　　细胞毒性实验（Cytotox96,Promega）

　　以小鼠的脾淋巴细胞为效应细胞,以转染MAGE1阳性的B16细胞和未转染MAGE1的B16细胞为靶细胞,按效靶比（E∶Tratio）∶一、5∶一、10∶1混合2组细胞,37℃培育4h后采纳LDH法检测杀伤率。

　　肿瘤解决实验

　　C57BL/6小鼠60只,雄性,随机分为6组,每组10只。

小鼠腹腔注射疫苗,分组及免疫剂量同实验别离于第一次免疫后7d、14d后以相同剂量追加免疫2次。

末次免疫后7d于小鼠右后肢皮下接种1×105B16MAGE1细胞。

观看并记录小鼠成瘤率,绘制KaplanMayerr曲线。

　　统计学处置

　　所有数据的统计和分析采纳软件进行,组间比较采纳方差分析,P<为组间具有统计学意义。

KaplanMayer存

活曲线的Fisher’sexact查验分析不同分组的生存期。

　　2实验结果

　　纳米疫苗NE（MAGE1Hsp70/SEA）的性质

　　纳米乳剂为乳白色的均质胶体混悬液,在透射电子显微镜下观看发觉纳米乳剂呈球形（图1）,大小较均匀,将搜集的图象经运算机图象分析得出纳米乳剂平均粒径为（20±5）nm。

经计算得出,包裹率为87%。

于4℃放置6个月或3000r/min10min离心后,外观仍然为均质胶体混悬液,无分层和沉淀现象。

电镜观看颗粒大小无转变。

　　ELISPOT检测脾淋巴细胞IFNγ释放细胞数量

　　B16MAGE1为靶细胞时,MH、NE（MH）、MHS和NE（MHS）组均有特异性T淋巴细胞,与空白NE组、PBS组相较,IFNγ释放细胞频数有统计学意义;其中NE（MHS）组免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对MAGE1的特异性T细胞的数量高于MHS组（P<）,NE（MH）组高于MH组（P<）,MHS组高于MH组、NE（MHS）组高于NE（MH）组（P<）。

以B16为靶细胞时,各组都可见少量非特异分泌IFNγ的细胞（图2）。

　　细胞毒性实验

　　在效靶比为∶一、5∶1和10∶1的情形下,PBS组、NE（）组脾淋巴细胞对B16MAGE1细胞无杀伤作用;MH组、NE（MH）组、MHS组和NE（MHS）组脾淋巴细胞对B16MAGE1细胞的特异性杀伤作用均高于PBS组、NE（）组,而且NE（MH）组、NE（MHS）组特异性杀伤作用别离明显大于MH组、MHS组,说明以纳米乳剂为药物载体包裹融合蛋白或复合蛋白后,对表达MAGE1的肿瘤细胞的特异性杀伤作用明显强于未包裹MH、MHS疫苗,能诱导产生较未包裹MH、MHS疫苗更强的特异性CTL;6组中以NE（MHS）组免疫的小鼠脾淋巴细胞特异性杀伤能力为最高。

各组对B16的杀伤能力均低（图3A、B）。

　　纳米疫苗对肿瘤解决鼠的爱惜成效

　　PBS组和NE（）组的小鼠均在10d内成瘤;21d时,MH组10只小鼠全数成瘤,MHS组和NE（MH）成瘤小鼠别离为7只和3只,而NE（MHS）组10只小鼠中均无肿瘤生长;32d时,NE（MH）组和NE（MHS）成瘤小鼠别离为6只和3只,而其他组10只小鼠均成瘤;NE（MHS）组最后1只小鼠的成瘤时刻为56d。

可见NE（MHS）对表达MAGE1抗原肿瘤解决的小鼠有明显的爱惜成效（图4）。

　　3讨论

ELISPOT和LDH释放实验结果显示,经纳米乳剂包裹的NE（MHS）、NE（MH）疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中MAGE1特异性T细胞数量别离较未包裹的MHS、MH裸蛋白明显升高,NE（MHS）与NE（MH）相较,以前者为最高;NE（MHS）免疫的小鼠诱导的CTL对B16MAGE1的特异性杀伤率明显大于MHS蛋白疫苗,NE（MH）大于MH,NE（MHS）大于NE（MH）,证明与其他组相较,纳米乳剂包裹的MHS复合蛋白疫苗能诱导最强的MAGE1特异性的细胞免疫反映,其作用明显强于未经包裹的复合蛋白疫苗和未加入SEA的NE（MH）蛋白疫苗。

肿瘤解决实验显示纳米乳剂复合抗原疫苗NE（MHS）能有效延迟B16MAGE1瘤细胞对小鼠解决的成瘤时刻、降低成瘤率。

　　纳米乳剂疫苗取得上述良好免疫成效,要紧缘故分析如下:

一是选择肿瘤特异性抗原MAGE1为疫苗的核心。

肿瘤疫苗发挥关键作用的成份是肿瘤抗原。

MAGE1是到目前为止经实验证明的具有良好激活机体抗肿瘤免疫反映的少数肿瘤特异性抗原（TSA）之一。

MAGE1不仅在黑色素瘤表达,同时在其他多种肿瘤中均有不同程度的表达,但在除睾丸和胎盘外的正常组织中均不表达,故成为肿瘤特异性免疫医治理想的靶分子[1,2]。

二是采纳Hsp70MAGE1融合蛋白,利用Hsp70的分子伴侣作用增强APC细胞对抗原的加工递呈,从而有效增强肿瘤疫苗的抗肿瘤免疫成效。

咱们以往的实验结果显示[3,4],Hsp70能够增强MAGE1Hsp70融合基因疫苗和MAGE3Hsp70融合蛋白疫苗的CTL效应;将Hsp70与肿瘤抗原融合表达的融合蛋白是二者联合利用的最有利形式。

三是加入超抗原SEA可有效激活CD4+T细胞,协同增强肿瘤抗原的免疫成效。

在机体抗

肿瘤免疫反映的进程中,仅有CD8+T的激活并非能起到有效的杀伤肿瘤作用,CD4+T细胞的参与是必不可少的。

超抗原葡萄球菌肠毒素A（SEA）是一种具有壮大免疫激活性能的超抗原,能够有效激活CD4+T细胞,进而激活CTL,致使对肿瘤细胞的杀伤,具有高效免疫活性。

研究结果显示,pg级的SEA即可引发高效的免疫激活效应[5],动物实验显示可有效激活系统和肿瘤局部的免疫活性,抑瘤成效明显,荷瘤动物的生存期明显延长,且未观看到明显的毒副作用和免疫耐受现象的显现[6]。

咱们的研究还发觉,将超抗原SEA以1∶100的比例与MAGE1肿瘤抗原混合,即可诱发高效的针对表达该抗原的肿瘤细胞的免疫排斥反映,同时,由于用量极低,尚可有效幸免毒性和免疫耐受的显现。

四是选择纳米乳剂为疫苗载体,充分发挥纳米药物载体的优良特性。

（1）纳米乳剂爱惜、缓释肿瘤抗原,进而增强其生物利费用。

专门是油包水型（W/O）纳米乳剂

其外油层表面具有隔间和爱惜内容物免遭酶及体液的破坏作用,随着油相脂解,包裹在里面的蛋白质缓慢释放。

这种缓释作用持续刺激免疫系统,生物利费用相应提高。

（2）纳米乳剂可增进APCs提呈抗原。

咱们的实验证明[7],用纳米乳剂包裹模式蛋白BSA的体外细胞摄取实验中已发觉,载药纳米乳剂可明显增强DC和巨噬细胞对所载药物的摄取。

（3）纳米乳剂具有亲淋巴系统被动靶向特性[8]。

有实验证明,纳米乳剂经局部注射后能定向进入淋巴循环,聚集在区域淋巴结内;经淋巴引流的纳米乳剂还可刺激局部淋巴结淋巴细胞增殖产生特异性免疫应答;（4）纳米乳剂乳化进程温和,可不能改变多肽类药物的生物活性;且所用成份均为生物材料,低毒、平安[9]。

肿瘤的低免疫原性和机体的低免疫反映性大多数情形下在同一机体是同时存在的,肿瘤免疫医治想取得预期的医治成效,必需从多方面综合入手。

设计者需同时考虑到调动机体的特异和非特异免疫,激活CD8+和CD4+T细胞和改善APC细胞抗原提呈功能、增加疫苗的生物利费用等多方面因素[10]。

在本实验制备的肿瘤基因工程纳米疫苗能够增强所载抗原的生物利用率,增进抗原的摄取提呈,增强机体的抗肿瘤免疫反

应,是一种高效的肿瘤疫苗。

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（2）:

127-135.·论著·

　　T7噬菌体衣壳蛋白P11的原核表达、纯化及其单克隆抗体的制备