《牛支原体的毒力持续感染性和传播特性》.docx
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《牛支原体的毒力持续感染性和传播特性》
《兽医微生物学》
《牛支原体的毒力、持续感染性和传播特性》
摘要：
牛支原体病是由牛支原体引起的牛的一种疾病，主要有肺炎、乳腺炎、关节炎、耳炎、生殖障碍及角膜结膜炎。
牛支原体重要的研究特点主要包括表面脂蛋白的多样性、粘附、入侵宿主细胞、宿主免疫系统的调节、生物膜的形成、次级代谢物如过氧化氢的释放以及与其他细菌病原体的协同感染。
本文的目的是对当下牛支原体毒力的研究进展做一个总结，此外，还对有助于牛支原体在宿主体内持续感染和传播的因子进行了讨论。
1.引言
牛支原体1961年在美国首次被分离，这种无细胞壁的细菌属于柔膜体纲，引起牛的支原体病。
被感染的牛会有多种多样的临床表现，大多数为长期性的，包括支气管肺炎、耳炎、乳腺炎、生殖器官疾病、关节炎、脑膜炎以及角膜结膜炎。
牛支原体能够感染各种组织和器官，甚至能够从健康的牛体内分离，被认为是威胁家畜工业化生产国家的主要病原体之一。
目前为止，并没有有效的疫苗预防牛支原体的感染（2013），抗生素的治疗几乎无效且会增加菌株的耐药性。
现在对于支原体的致病性的分子机制的理解具有局限性。
他们似乎是多遗传因子的。
治病的牛支原体相较与其他细菌，并不能通过有效的毒素产出将其鉴别。
有极个别例外如肺炎支原体是可以通过ADP核糖基转移酶对其进行鉴别。
直到现在，遗传工具的缺少以及研究技术的局限性都阻碍着对牛支原体发病机理及毒力因子的研究，而对发病机理及毒力因子的研究又是开发治疗及预防措施应对牛支原体病的基础。
运用转座子突变技术获得牛支原体突变体以及新的质粒，并由此对牛支原体内染色体外的遗传物质进性复制扩增已经被报道出来。
随着这些技术的可用性以及进一步的改善，很可能在不久的将来获得牛支原体与宿主相互作用的详细信息。
本文对当前牛支原体致病机制进行了一个概述，主要对以下几个方面进行了讨论：
1.与其他细菌或病毒的混合感染；2.抗原多样性；3.粘附；4.牛细胞入侵；5.宿主免疫系统的调节；6.次级代谢物及菌膜形成。
2.与其他微生物的相互作用
在自然感染的牛体内，牛支原体经常与其他病原微生物相作用，这种相互作用可能是在尸检物的观察中导致严重肺部损害的主要原因。
与牛支原体最常关联的致病微生物有多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、睡眠嗜组织菌、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛疱疹病毒1型（BHV1）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）以及副流感病毒3型。
但是如下所述的一些研究却产生了与此矛盾的结果。
牛支原体的自然感染能够造成渗出性支气管肺炎并伴有广泛的凝固性坏死病灶，然而实验感染却会导致亚临床肺炎以及程度较轻的肺组织病变。
因此，由牛支原体引起的严重肺部疾病被怀疑是由支原体与其他造成农场管理问题的致病微生物的相互作用的结果。
此外，个体动物的年龄及机体免疫状态对病情的进展也至关重要。
牛支原体的单独感染只能在非常年幼的小牛体内引起肺炎症状，因此与病毒或细菌的协同感染，对于引起饲养场中的成年动物肺内典型的广泛的干酪样坏死性病变是必不可少的。
更确切地说，牛支原体可能与H.somni、溶血性曼氏杆菌以及多杀性巴氏杆菌这些细菌性病原体相互作用。
这在实验的小牛体内以牛支原体作为诱发因素，然后用多杀性巴氏杆菌进行二次感染，从而引发严重的呼吸系统疾病症状的试验中得到验证。
另外一些研究者认为，牛支原体在H.somni、溶血性曼氏杆菌以及多杀性巴氏杆菌引起组织病变的过程中起到了一个对组织进行预先破坏的中介作用。
在这种情况下，牛支原体能够起到抵抗抗生素或者宿主免疫系统对原发性感染的治疗或者抵御的作用。
在另一个研究中，牛支原体与H.somni重要的协同作用在饲养场的小牛体内被检测到。
80%的H.somni病例显示出牛支原体阳性，但是，并没有明显的证据表明牛支原体与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）以及溶血性曼氏杆菌存在相互协同作用。
牛支原体与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的混合感染会导致更严重的呼吸道疾病，这是由于病毒所引起的免疫抑制效应造成的。
然而，在饲养场的牛体内，牛支原体与BVDV之间的协同作用却存在着矛盾的数据，且这些数据在也是有效地。
关于牛支原体与牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）的混合感染，相较于牛支原体的单独感染，临床症状的严重程度并没有明显增加。
有趣的是，实验条件下牛支原体与BHV-1的混合感染会产生牛支原体引起的典型的器官损伤相同的结果。
的确是这样，混合感染6-8个月的饲养场小牛会引起典型的干酪样坏死性支气管肺炎，仅由支原体感染时并不会引起如此典型的症状。
此外，更高的死亡率也揭示了牛支原体与BHV-1彼此之间存在的协同效应。
3.抗原变异
牛支原体具有抗原表位多样性，也叫菌株多样性。
这种这种高频率相位突变及细胞膜表面脂蛋白的形状多样性已经在几个其他支原体菌株中得到证实。
牛支原体菌株的抗原多样性与地理起源、器官隔离、由单一菌株的亚克隆体（诱导的疾病类型）无关。
这种多样性被证明是基于几个显著的双亲性的、含有交叉反应抗原表位的完整的膜蛋白。
高频率抗原的突变被证明是受在体外牛支原体同源抗体存在的影响。
此观点支持了先前的假设，这种体系能够维持牛支原体亚种群的多样性，并以此来逃避宿主的免疫系统。
因此，宿主不能完全消除这种病原菌，造成支原体引起疾病症状的长期临床表现。
牛支原体模式菌株PG45亚克隆的抗原剖面图显示出抗原在表达以及分子量水平上的高度动态多样性。
这些抗原被证明属于一个相位和形状具有高度变异性的膜表面脂蛋白（VSPs）家族。
在模式菌株PG45中，其VSPs家族由13个不同的、自我复制的VSP基因组成，这些基因位于一个集群染色体的VSP基因座中。
这个基因座大约含有基因的长度为23kb，含有两个额外的开放阅读框（ORFs），此阅读框与可变遗传因子IS4和IS30具有高度的同源性。
ORFs编码vspA，vspB，vspC，vspE，vspF，vspG，vpsH，vspI，vspJ，vspK，vspL，vspM，vspNandvspO（图1）。
VSP基因座中的成员转录翻译为脂蛋白，这些脂蛋白与脂肪酸和半胱氨酸残基一样具有双亲性。
VSP基因含有一个保守的5’端非编码序列，可分为两个基因盒，基因盒1（cassette1）在所有VSP基因中具有99%的同源性，编码一个核糖体结合位点，基因盒2（cassette2）位于基因盒1的上游，具有高变形。
5’端非编码序列后是一个有N-端区域开放阅读框，这个N端区域在所有的菌株中具有98%-99%的同源性，并包有前脂蛋白信号肽酶，膜表面脂蛋白的C端区域表面是裸露的。
几种膜表面脂蛋白的混合表达会使得牛支原体表面具有不同的特殊结构以及抗原特性。
膜表面脂蛋白基因的混合表达仅局限于两个彼此隔离的基因之间，此时其余的VSP基因保持转录沉默。
必须指出的是，vspA与vspO的基因重组事件会产生vspC，这解释了缺乏vspA与vspC基因的混合表达会导致菌株中vspC的缺乏，以及vspA与vspC在结构上的相似性。
嵌合体vspC具有来自于vspO的高度保守的基因盒1的N-端，还具有来自于vspA高变的基因盒2的C-端，由于vspC也具有相位和大小的多样性，这也增加了抗原的多样性。
而且，当vspA，vspM，vspN，vspO缺失时，也会造成vspC遗传信息的丢失。
因此，体外实验中幸存的vspC变异体所隐匿的截短了的vsp基因座是有问题的。
抗原变异包括在特定重复区域（高频的形状变异）通过插入或者缺失造成条带的改变，结果导致vspA，vspB，vspC在10-，9-以及5-区域的不同程度的变异。
在支原体模式菌株PG45所有的vsp基因中发现了18个不同的重复区块。
从它们的N’端到C’端，具有不同的大小和氨基酸结构。
这些区块中的一些只存在于一个基因中，一些存在于几个不同的Vsps中，形成一个串联的不同重复域，负责编码80%的蛋白质（图2）。
这些重复序列与特定的vsp倒置序列一起位于保守的基因盒1中，是重组事件导致区域复制、染色体倒位、缺失的完美目标。
此外，保守的基因盒2能够作为某几个Vsps的活性启动原件以及调节下游基因的表达。
抗原表达中的高频率相位变异会导致由于染色体重组而造成表面抗原的获得或者缺失。
在体外试验中，这些事件在每个细胞每一代发生的频率为10-2到10-3。
在基因水平，通过染色体DNA限制性内切酶切割能够显示出明显的重排迹象，VspA和VspC各自不同的变异体会产生不同长度的片段。
Vsps在表达和大小方面的变异在被感染呼吸道的小牛体内得到证实。
此外，在250个野生型菌株中有98.5%表达Vsps，这是依据单克隆抗体测验的，这种单抗能够结合与VspA，VspB和VspC蛋白质的一个重复的区域（图2中的深绿色区域）。
不同的vsp基因组模式以及不同的Vsps抗原表现型似乎是极其复杂的，尽管一项关于vsp基因的多态性以及表达图谱相关性的研究表明所有的野生型菌株都具有一定的相关性，拥有一个共同的祖先。
比较模式菌株PG45与牛支原体野生型菌株，显示出在菌株特异性重复序列与vsp重复序列之间存在巨大的差异。
这可以揭示特定菌株的个体抗原特性，扩展vsp的类型。
特殊的例子是支原体野生型菌株2610，它编码一个vsp家族的新成员，这个成员起到粘附素的作用，中国菌株湖北一号表达可变的表面脂蛋白A（VpmaX），缺少在PG45中存在的蛋白质N端区域以及保守的上游DNA序列，但是却表现出粘附特性。
尽管N端和C端是保守的，在PG45（13个vsp相关ORFs）与中国菌株HB0801（6个vsp相关ORFs）的vsp基因座中vsp基因的成员差异是显著的。
这种vsp基因的高变性可能是由于个体菌株在宿主体内所遇到的选择压力的结果，也由此增加了牛支原体种群的多样性。
图1.牛支原体模式菌株PG45的vsp基因座。
图片用SnapGene1Viewer2.3.2软件根据公布的PG45全基因组序列生成。
（公布序列在Wishetal.（2011））。
ps
图2.牛支原体模式菌株PG45中的vspA，vspB，vspO基因简化后的结构特点。
白色区块（P）代表着位于ATG密码子上游的长度为150bp的高度保守的5’非编码区域。
第一个（基因盒1），包含有核糖体结合位点，而第二个（基因盒2）在vspA中是一般的活性促进子。
长度为75bp的高度同源的DNA序列编码编码vsp的信号肽，在图中为灰色区块（s），紧随其后的是黑色标记第三区块，在所有vsp基因中是保守的。
有色区块为重复的编码序列，从N端延伸到C端，这些重复的区域能够被分配到不同的vsp基因中（蓝色，红色以及深绿色），或者具有vsp特异性（亮绿色、黄色区块）。
4.粘附
粘附是支原体感染的第一步，由于粘附素直接与宿主细胞接触，因此支原体细胞膜上的粘附素表达是相当重要的。
因为支原体缺乏一连串的基因，而这些基因组参与重要的生物合成途径，支原体必须从宿主体内获得一些重要的物质，如氨基酸、核苷酸、脂肪酸。
因此支原体与宿主细胞的亲密接触对于支原体的生存是重要的。
牛支原体与宿主细胞膜的融合是为了允许交换膜和细胞内部的一些组分。
有趣的是，并没有证据表明在牛支原体内存在一个提示器，它能作为为支原体肺炎主要粘附素积累的结构，牛支原体的粘附素可能是以膜蛋白的形式分布于细胞表面。
在体外试验中，牛支原体菌株PG45粘附胚胎型牛肺细胞（EBL）受温度的影响，37℃为最大粘附温度。
细胞受体的结合能力具有饱和度的限制，在EBL细胞内感染复数（MOI）为225:
1，在牛支器官上皮细胞（BBE）内为100:
1。
细胞黏连率（3.4-19.1%）的大的变化与分离的器官无关却受宿主细胞类型影响。
在相较于致病菌株的低致病或者非致病菌株中，粘附率显著地降低。
而且，相较于上皮细胞系的粘连率，成纤维细胞显得低一些而在支气管上皮细胞（BBE）显得高一些。
此外，在体外连续传代后，牛支原体似乎失去了粘附能力。
牛支原体的粘附是蛋白质的相互作用，这在通过用蛋白酶处理牛支原体导致粘附能力的降低的试验中到证实。
此外，支原体蛋白质中的唾液酸残基被认为在细胞粘着中起着重要的作用。
在特殊蛋白质的水平，分子量为32千道尔顿的膜表面裸露蛋白P26被认为在牛支原体感染胚胎型牛肺细胞（EBL）中起主要的粘附作用。
但是，用单克隆抗体处理P26后并不能显著地减少牛支原体对BBE细胞的粘附。
另一个牛支原体的粘附相关因子膜相关糖酵解酶α-烯醇酶，因为它通过结合纤溶酶原诱导支原体粘附EBI细胞。
实际上，用纤溶酶原增强物预处理EBL细胞会使牛支原体的年富能力增强11.9%，用低浓度胰蛋白酶预处理牛支原体增加其蛋白水解活性以及对EBL细胞的粘附率，表明其他一些被低剂量胰蛋白酶激酶切活的蛋白水解酶也能够参与粘附。
Vsps也在牛支原体粘附中发挥作用，这在宿主细胞结合被免疫印迹标记的Vsps中得到证实。
此外，在细胞粘附实验中，添加纯化的Vsps减少牛支原体的细胞粘附，Vsps被保留在宿主细胞层中。
这在牛支原体粘附EBL细胞中在使用Vsps重复区域的寡肽对其进行局部细胞粘附抑制中得到证实。
牛支原体特异性单克隆抗体1E5和4D7（二者都可以识别VspA，VspB，VspC的共同表位），2A8（抗VspC）和9F1（抗VspF）被用于验证支原体的Vsps接触位点对抗体是否敏感。
结果显示，牛支原体菌株PG45余0435的部分粘附区域都可以被特异的单克隆抗体识别，而这些位点也是Vsps的粘附部分。
然而，粘附的抑制是依赖于细胞系的使用。
重复区块的插入或者缺失导致表面抗原的改变，使Vsps生成新的抗原表位或者移除一些抗原表位造成细胞粘附作用的增加或者减少，也会导致大小范围不一配体结合。
5.细胞入侵
在用牛支原体对小牛进行感染中，支原体被发现在各种类型的细胞质中，如巨噬细胞、中性粒细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、肾小管上皮细胞或者表面神经的轴突。
牛支原体抗原还会进一步在单核细胞、淋巴结、偶尔还在细支气管上皮细胞中被发现。
牛支原体在吞噬细胞中持续的存活可能是由于在被吞噬的过程中，牛支原体可能改变了吞噬后的某一步骤来实现的。
在一个体外实验中，牛支原体菌株Mb1被发现在各种牛外周血单核细胞（PBMC）亚群中持续存在，如T细胞、辅助T细胞、B细胞、单核细胞、细胞毒T细胞、自然杀伤性细胞、树状细胞以及牛红细胞。
依据细胞的类型及感染的时间，牛支原体在细胞内的不同位置信息能够被确定。
牛支原体与细胞膜一侧的细胞质基质相关联，呈弥散性分布于液泡样结构。
牛支原体对不同细胞类型及牛外周血单核细胞（PBMC）亚群的入侵存在不同的程度和效率，可能是由于牛支原体对不同细胞的粘附或入侵的受体不同或者是牛支原体针对不同的细胞产生不通的差分信号。
有趣的是，在乳房上皮细胞内并没有发现牛支原体的存在。
然而，我们在最近的体外实验中使用荧光和透射电子显微镜在初级胚胎小牛鼻甲骨细胞内发现了一个牛支原体胞内强毒株（图3）。
总之，牛支原体对上皮细胞以及免疫细胞的入侵有助于牛支原体传播进入宿主不同的感染位置，抗生素的治疗能够有效控制牛支原体的损害。
但是，对牛支原体在不同细胞内的持续存在的分子机制的进
一步研究是必须的。
图3：
牛支原体菌株JF4278感染6小时后的初级胚胎小牛鼻甲细胞差分荧光显微镜图像，感染复数（MOI）为3400:
1，细胞核为蓝色标记，纤维状肌动蛋白为红色标记。
图A：
未受感染的鼻甲骨细胞。
图B：
细胞内的支原体被染成绿色，细胞外的支原体以及附着在细胞上的支原体被染成深黄色到橙色。
600倍放大后的合并图片。
6.宿主免疫系统的调节
支原体膜蛋白是很重要的，因为他们直接与宿主免疫系统接触，牛支原体--宿主细胞相互作用似乎取决于细胞类型或外周血单核细胞（PBMCs）子集。
VanderMerwe和合作伙伴观察到在T细胞、辅助T细胞、细胞毒素T细胞、自然杀伤性细胞及γδT细胞中存在FN-γ诱导，而在单核细胞、树状细胞、B细胞并不存在IFN-γ诱导。
关于牛支原体引诱外周血单核细胞（PBMCs）的细胞凋亡也一直存在争议。
在实验条件下，牛支原体诱导淋巴细胞细胞凋亡已被报道。
然而在另一项研究中，牛支原体感染牛单核细胞后延迟细胞凋亡过程也被发现。
此外，有报道指出牛支原体既能够刺激也能够抑制宿主免疫系统。
免疫刺激似乎是通过巨噬细胞、T细胞、补体激活及细胞因子表达来上调免疫反应。
免疫抑制可能是由抗炎性细胞因子的表达或者趋化因子如白介素10（IL-10）以及抑制促炎性细胞因子的表达如IFN-γ或者IFN-α。
IL10之后调节适应性免疫反应产生辅助性T细胞Th2，导致产生大量的IgG1，起到免疫调理和免疫反应的作用。
作为一种替代途径，抑制宿主免疫应答也可以通过抑制淋巴细胞增殖、支原体淋巴细胞抑制性蛋白的生成、干扰淋巴细胞增殖对植物凝集素的反应来实现的。
因此抑制宿主免疫系统是通过下调淋巴细胞的增殖，他们的细胞因子表达并没有改变。
牛支原体限制宿主免疫应答的另一个方法是结合中性粒细胞，从而抑制它们的呼吸爆炸。
在感染的小牛体内，能够观察到宿主免疫系统的调节随着牛支原体在宿主体内长期生存与全身扩散而改变。
7.菌膜的生成以及次级代谢物
菌膜有助于细菌在环境中持续的生存以及在宿主体内造成慢性长期的疾病，此外，菌膜也能够在吞噬细胞被吸引募集并释放溶酶体酶、活性氧以及形态氮（ROS和RNS）后增加对宿主组织的伤害，而且吞噬细胞在这种条件下效率也非常低下。
几种支原体包括牛支原体在内所产生的菌膜独立于它们的致病性之外。
支原体被观察到粘附到载玻片上之后首先生成菌膜，这显示出支原体粘附宿主细胞是必要的。
不同的支原体菌膜的生长程度也有所差异，这与不同的分子类型及Vsp结构相关。
由于Vsps参与粘附，某一Vsp模型可能具有不同的粘附能力，导致生成菌膜的能力多样。
菌膜的生成有助于细菌抵抗环境因素及宿主的防御系统。
的确，牛支原体菌膜的生成有助于提高他们对高温和干燥的耐受能力，增加它们对环境的适应能力，然而却并不能改变氟喹诺酮和四环素的最低抑菌浓度（MIC）。
次级代谢物被证明参与支原体的致病性。
几种支原体物种产生的过氧化氢是一种主要的毒力因子，能够导致细胞死亡、抑制纤毛作用或脂质的过氧化反应。
在尸检材料中，过氧化氢存在于所有的分离的牛支原体菌株中。
此外，形态氮（ROS和RNS）也随着巨噬细胞和中性粒细胞的活化与募集被发现。
支原体中H2O2和来自白细胞的ROS和RNS可能会导致严重的典型的肺部干酪样损伤。
牛支原体在体外实验中生成的H2O2总量也表现出菌株特异性。
由于菌株不同，通过NADH氧化酶产生的H2O2量也从0mol到1.1mol不等。
这主要是因为NADH氧化酶的主要产物不是水便是H2O2。
体外实验的菌株可能产生过氧化氢的水平有所减少，然而其他基质的氧化效率并没有改变。
这在缺失32千道尔顿的蛋白质牛支原体在无菌培养基中连续传代后过氧化氢的产量下降了50%的试验中得到证实。
然而，L-α-甘油磷酸盐（GP）在任何菌株的测试中都没有被氧化，显示出甘油磷酸盐氧化酶（GlpO）不存在于所有的非发酵的、非精氨酸水解的牛支原体菌株中。
8.结论
在这里我们对牛支原体的各种毒力属性进行描述，对各种表面脂蛋白进行深入的探讨。
它们在逃避宿主免疫系统、适应性方面以及补偿支原体基因组表达功能的局限性方面发挥重要的作用。
此外，一些表面抗原参与支原体粘附宿主细胞，这是感染建立的必要条件。
另外一些毒力属性我们没有进行深入的研究，但是随着新的分子工具的到来，能够为我们提供对某种菌株致病性机制更好的了解方法。
菌膜的生成是牛支原体在宿主细胞或相近环境中持续生存所必须的。
此外，由牛支原体分泌的代谢物如H2O2导致的宿主细胞损伤所涉及的分子机制更值得调查了解。
最后，牛支原体在牛细胞内的入侵及细胞内的生存有助于细菌在宿主体内的持续生存与传播，也会因为抵抗牛支原体感染所采用的抗生素治疗及疫苗接种预防方法，使牛支原体产生抗性。
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