基因工程原理讲义基因克隆的质粒载体.docx
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基因工程原理讲义基因克隆的质粒载体
第六讲基因克隆的质粒载体
中国科学院遗传与发育生物学研究所
2017年8月
基因克隆的质粒载体
一、导言
1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体
其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。
2．质粒的类型多种多样
F质粒：
F因子或性质粒（Sexplasmid），它能够使寄主染色体上的基因与F因子（Ffactor）一道转移到原先不存在该质粒的寄主受体细胞中去。
R质粒：
通称抗药性因子（Resistantfactor,Rfactor），编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞中去。
Col质粒：
所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌素可使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。
3．质粒载体
70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。
二、质粒的一般特性
1．质粒DNA（细菌质粒定义）
*1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,cccDNA）。
除了酵母的杀伤质粒（Killerplasmid）是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。
但是质粒DNA的复制又必须依赖于寄主提供核酸酶及蛋白质。
*2.质粒DNA分子大小
文献中有3种说法：
小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质；
大的可达105KD，两者相差上百倍。
1Kb～200Kb（Sambroketal.）
5Kb～400Kb（Lehninger）
MD（megadaltons）=106D（兆道尔顿）
1.5Kb≈1MD
*3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系
一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状态，但在一定条件下又可以可逆地整合到寄主染色体上，并随之一道复制和细胞分裂而传到后代。
*4.质粒DNA的分子构型
SC构型：
即共价闭合环形的cccDNA所呈现的超螺旋构型。
走在凝胶的最前面。
OC构型：
即开环DNA（ocDNA）所呈现的构型，其中一条DNA链保持完整的环形结构，另一条链上则出现有一个至数个的缺口。
走在凝胶的最后方部位。
L构型：
发生双链断裂形成的线性DNA分子所呈现的构型，通称L型。
走在凝胶中间部位。
2．质粒克隆载体必须具备的条件（三种共同的组成部分）
①具有复制区或复制因子（replicator）
复制因子：
是指一段特定的质粒DNA，它含有质粒DNA的复制起点（ori）（originofreplication），以及编码质粒DNA和质粒复制所需要的DNA序列结构。
*注意复制因子（replicator）和复制子（replicon）之间在概念上的差别。
复制子（replicon）：
系指含有一个复制起始位点的DNA复制单位，例如细菌染色体、病毒基因组、质粒基因组等，凡其DNA能够进行自主复制的遗传单元均称为复制子。
*在一般的情况下，一个质粒只含有一个复制起点，构成一个独立的复制子。
但在少数的情况下，由融合产生的质粒也会含有两个复制子，但其中只有一个有活性。
②具有抗菌素抗性基因
一种理想的质粒克隆载体应具有两种抗菌素抗性基因，以便为寄主细胞提供易于检测的表型性状作为选择记号，而且在有关的限制酶识别位点上插入外源DNA片段之后形成的重组质粒，至少仍要保留一个强选择记号。
③具有若干限制酶单一识别位点
这样的分子结构特性，可以满足基因克隆的需要，而且在其中插入适当大小的外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能。
④具有较小的分子量和较高的拷贝数
这类质粒的优点在于：
a.低分子量质粒易于操作，克隆了外源DNA片段之后（一般不超过15Kb）仍可有效地转化给受体细胞；
b.含有较高的拷贝数有利于质粒DNA的制备，增加克隆DNA片段（基因）的产量；
c.低分子量的质粒分子中对某种限制酶具多重识别位点的机率也就相应下降；
3．质粒DNA编码的表型
①质粒DNA的分子量较小，仅占细胞染色体的一小部分，一般约为3%。
②质粒DNA尽管分子量小，但却编码着重要的遗传性状：
a.抗性特征：
抗菌素抗性、重金属抗性、毒性阴离子抗性，以及其它抗性。
b.代谢特征：
抗菌素及细菌素合成；简单的碳水化合物（例如乳糖、蔗糖等）的新陈代谢；复杂碳水化合物（甲苯、苯胺）及卤代化合物的新陈代谢；蛋白质新陈代谢；……固N作用；H2S的合成；柠檬酸的利用；欧文氏菌的色素形成；产碱杆菌的反硝化活性；产碱杆菌和欧文氏菌的硫氨素的合成；
c.修饰寄主生活方式的因子：
大肠杆菌肠毒素的合成；金黄色葡萄球菌剥脱性毒素的合成；炭疽杆菌外毒素的合成；苏芸金芽孢杆菌-内毒素的合成；破伤风杆菌神经毒素的合成；大肠杆菌定居抗原的合成；大肠杆菌及链球菌等的溶血素的合成；肠道细菌的血清抗性；耶尔森菌的毒力；炭疽芽孢杆菌的荚膜的合成；大肠杆菌中铁的运转。
d.其它特征：
盐杆菌细胞中气泡的形成；
链霉菌之痘疱形成的（致死接合）；
肺炎克氏杆菌中的Kik+IncN质粒的致死效应；
土壤杆菌对细菌素的敏感性；
麻风杆菌之半透明/不透明菌落的变异；
Nod+Flx+豌豆根瘤菌的根际蛋白质的合成；
Caedibacter包涵体的产生；
葡萄球菌之内肽酶活性。
4．质粒DNA的转移
①接合型质粒和非接合型质粒
*接合型质粒（conjugativeplasmid）：
又叫自我转移质粒，具有自我复制基因。
控制细菌配对和质粒接合转移的基因；
*非接合型质粒（non-conjugativeplasmid）：
亦叫不能自我转移的质粒，具有自我复制基因，但失去了控制细胞配对和接合转移的基因，因此不能够从一个细胞转移到另一个细胞。
加上大肠杆菌素基因——大肠杆菌Col质粒
非接合型质粒
加上抗菌素抗性基因——大肠杆菌R质粒，也称R因子。
带上一段寄主染色体DNA——F因子
接合型质粒（F因子）加上大肠杆菌素基因——大肠杆菌素Col质粒
加上抗菌素抗性基因——大肠杆菌R质粒，R因子
②接合型质粒F因子是最有代表性的接合型质粒：
F因子在寄主菌中的三种存在方式：
a.染色体外双链环形DNA，F+细胞
b.染色体外双链环形DNAF细胞
+
寄主染色体DNA片段
c.以线性DNA形式整合到Hfr细胞
寄主染色体DNA上。
接合型质粒F因子的接合转移：
F+细胞和F-细胞，以及性须pilus结构
↓
F+细胞和F-细胞混合培养，通过性须作用，细胞配对，这个过程称细菌的接合作用（conjcogation）
↓
在细胞配对期间，F+细胞中的F因子接滚环复制模型，经过性须通道进入F-细胞（单链）
↓
F-细胞变成F+细胞
质粒的接合转移与基因工程的安全载体问题：
从基因工程的安全性角度考虑，我们感兴趣的主要是非接合型质粒：
理由是：
①接合型质不但自身转移；②还可引起寄主染色体片段转移；③而如果F因子整合到寄主染色体上，则会牵动染色体发生高频转移；④引起其它非接合型质粒发生迁移作用。
5．质粒DNA的迁移作用（mobilization）
①质粒DNA迁移作用的概念
由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程叫做质粒DNA的迁移作用。
非接合型质粒由于分子量小不足以编码转移过程所需的全部基因，因而不能够发生自身转移，但如果寄主细胞中存在着共存着一种接合型质粒，那么它们通常也就可以被转移。
②质粒DNA迁移作用原理
ColE1质粒是一种可迁移的非接合型质粒
ColE1质粒迁移的生化过程：
迁移条件
bom位点，（位于ColE1质粒分子上）
mob基因编码的核酸酶，又叫迁移蛋白
*1.bom位点又叫nic位点，迁移蛋白作用于nic位点，从而引动非接合型质粒发生迁移作用。
mobgene=接合性动员基因conjugativemobilizationgene.
nicsite=自我转移的接合型质粒在起始接合性DNA转移时，在转移起点oriT进行链特异性及以部位特异性的单链切割的DNA部位。
*2.许多质粒载体在构建过程中已失去了nic位点，故此不能被迁移。
种nic-质粒的转移途径是形成融合质粒，从而使它们在形体上变成接合型质粒的一部分。
*3.重组缺陷（recA）寄主菌株的使用
在重组缺陷的寄主菌株中，nic-质粒就不会同接合型质粒发生重组，因此在recA寄主中，nic-质粒比nic质粒较为稳定。
*4.图4-5解释
6．质粒DNA的复制类型
①低拷贝数质粒——“严紧型”控制的（stringentplasmid）
高拷贝数质粒——“松弛型”复制控制的（relaxedplasmid）
②质粒拷贝数定义：
在文献中常用有两种定义
A．常用定义：
生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含的质粒DNA分子数。
B．特殊定度：
培养在富裕培养基中快速生长的细菌细胞，可拥有3-4条染色体DNA，而在碳源供应不足的培养基中缓慢生长的细菌细胞，平均只有1.1条染色体DNA。
因此有的文献中质粒拷贝数定义是：
每个细菌细胞中每条染色体平均具有的质粒DNA分子数。
C．本书定义：
在LB液体培养基中生长的每个细胞中含有高于20个以上质粒DNA者，叫做高拷贝质粒（High-copy-numberplasmids）；低于20个的则称为低拷贝质粒（low-copy-numberplasmids）。
7．质粒的不亲和性问题（incompatibility）
不亲和性，即不相容性
1定义：
是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。
2注意：
只有当有确切的证据表明第二种B已经进入含有A质粒的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和B是不亲和的质粒。
3不亲和群的概念：
彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群（incompatibilitygroup）。
彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。
同一不亲和群的南粒在亲缘关系上则比较接近。
④质粒不亲和性的分子基础
质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的：
*1负反馈调节环（negetivefeed-backloop）
大多数质粒产生可控制质粒复制的阻遏蛋白质，其数量与细胞中质粒拷贝数成正比。
在质粒拷贝数少的情况下，细胞中阻遏蛋白质亦相对降低，于是阻遏蛋白质与质粒DNA中靶序列相互作用，使之发生复制。
随着质粒DNA复制的结果，质粒拷贝数上升，于是所编码产生的阻遏蛋白质也就随之增多。
细胞中阻遏蛋白质浓度增多的结果，会形成二聚体，于是失去与质粒DNA结合并促使其发生复制的能力。
结果质粒复制停止，也就是说质粒拷贝数是受阻遏蛋白质的负反馈调节：
负反馈调节环（negetivefeed-backloop）
当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白时，其复制活动便被抑制了。
当质粒处于低拷贝数和低浓度的阻遏蛋白时，其复制活动更会继续时行。
*2.同一个细胞含两种相容质粒
由于这两种相容质粒亲缘关系远，故它们所产生的阻遏蛋白质就不会互相影响另一个质粒的复制。
于是这两种相容的质粒在同一细胞中都保持着自己的正常拷贝数。
*3.同一细胞含两种不相容的质粒
鉴于这不相容的质粒亲缘关系密切，它们所产生的阻遏蛋白质不仅影响自身质粒DNA复制，还会彼此影响对方质粒DNA的复制。
这就出现了两种阻遏蛋白质联合调控质粒复制速率。
↓
质粒拷贝数控制体系无法辨别这两种不相容性质粒，只是随机地选择其中一种进行复制。
于是出现拷贝数偏差。
↓
两种不相容质粒往往拷贝数不相当，其中高拷贝数的对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的要差一些。
因此在复制抑制剂（阻遏蛋白质）浓度低的情况下，高拷贝质粒仍可复制，从而最终使低拷贝质粒被淘汰掉（稀释掉）。
三、质粒DNA的分离与纯化
1．氯化铯-EtBr密度梯度离心原理
（1）寄主染色体DNA与质粒DNA高级结构的差异
*所谓质粒DNA的分离纯化的分子本质是，在细胞破裂后释放出来的染色体DNA和质粒DNA的混合物中，如何将质粒DNA与染色体DNA区分开来，得到只有质粒DNA的过程。
*但是由于质粒DNA与染色体DNA在化学结构上并没有什么差别，因此，要使质粒DNA与其寄主染色体DNA区分开来，达到分离与纯化的目的，就必须从两者DNA的高级结构上寻找突破口。
实验表明，在细胞裂解和DNA的分离过程中，大分子量的细胞染色体DNA容易断裂成相应的线性片段，而质粒DNA由于分子量小，结构紧密，因此仍能保持完整的状态。
氯化铯-EtBr密度梯度离心法，就是根据这种寄主染色体DNA与质粒DNA在高级结构上的差别（或说是异质性）而建立的一种经典的分离纯化质粒DNA的技术。
（2）CsCl的作用
在氯化铯密度梯度离心中，氯化铯是作为介质其密度为1.7g/cm3，经过一段超速离心平衡之后，便形成了1-1.9052g/cm3的连续的浮力密度梯度。
已知大肠杆菌寄主染色体DNA、质粒DNA、大肠杆菌寄主染色体DNA和RNA等4种大分子物质，具有不同的浮力密度，因此经过超离心平衡之后，便会分布在CsCl连续密度梯度介质的等密度位置上，从而达到了彼此分离的目的：
a.RNA大分子浮力密度=2.0g/cm3，沉于离心管底
b.蛋白质分子浮力密度介于1.3-1.4g/cm3，浮于液面
c.DNA大分子浮力密度约为1.70g/cm3，在中间部位
（3）EtBr的作用
*1.溴化乙锭分子的插入作用。
由于EtBr是具有扁平的分子，可以插入到DNA分子的碱基之间，即通过这种在碱基间的嵌入作用而结合在DNA分子链上，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。
*2.各种不同来源的DNA分子在浮力密度之间差别不大，例如大肠杆菌染色体DNA为1.7g/cm3，174噬菌体DNA为1.718g/cm3；而同一种DNA分子的不同构型，其浮力密度均为1.70g/cm3。
因此在氯化铯连续密度梯度中难以区分，形成十分接近的区带。
*3.不同构型的DNA分子结合EtBr的能力不同。
OC构型和L构型的DNA（包括E.coli染色体DNA片段），因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合大量的EtBr分子。
导致密度下降！
SC构型的DNA（质粒cccDNA），由于没有游离的末端，只能发生有限的解旋反应，结果便限制了与EtBr的结合能力。
因此，在加入EtBr之后，cccDNA比OCDNA及SCDNA，在浮力密度上要上升0.04，达到很好分离的目的。
因此，在EtBr达到饱和浓度的条件下，质粒cccDNA就要比线性的染色体DNA片段以及L构型和OC构型的质粒DNA，具有更高的密度，这样通过氯化铯密度梯度离心之后，就会平衡在不同位置上，从而达到纯化质粒DNA的目的。
2．氯化铯密度梯度离心纯化质粒DNA的优缺点
（1）优点：
可以获得高纯度、高质量的质粒DNA
许多种与基因克隆有关的实验，例如限制性内切酶的消化作用、探针制备的缺口转译、DNA序列分析等，都需要高纯率的、不含污染物的质粒DNA制剂，对此微量碱法一般来说是不适用的。
（2）缺点及注意事项
*1.氯化铯价格昂贵，因此非必要的情况下，要尽量避免使用；
*2.EtBr（Eethidinmbromid），是一种强烈的致癌化学物质，务必小心操作，避免伤害人体和造成环境污染。
*3.通过CsCl梯度纯化DNA时，就不要使用SDS，因为它不溶于CsCl溶液，当然可用其它的去污剂，例如Sodiumsarcosinate代替。
*4.由于在有CsCl的条件下，可见光有可能造成DNA发生单链缺口（Nick）（失去一个磷酸二酯键），所以在加入EtBr之前，应用锡箔纸包裹容器或是在暗室中操作（避光的环境）。
异戊醇：
isopropanol
异丁醇：
isobutanol
EtBr经异戊醇抽提后，便被分配到上相中去（粉红色）
*5.EtBr影响酶切反应，故应将其从DNA溶液中除去办法是加异戊醇或异丁醇，但两者得光用DNAbuffer饱和。
*6.EtBr是扁平的分子，它与DNA分子相互作用，插入两个核苷酸之间，从而降低了DNA分子在CsCl中的密度共价闭合环形（ccc）的DNA结合EtBr的量要比开放环形（OC）的及线型的DNA的少得多，因此通过CsCl梯度，便可以容易地将cccDNA同其它型的DNA分离开。
*7.在使用BeckmanL5-65型超速离心机时，建立CsCl梯度的条件：
转子型号
转速（PPM）
离心时间
离心温度
Type50
44,00060,000
40-44hours48h
5℃
Type65
44,00060,000
40hours24h
5℃
VTi65
50,000
20-24hours
5℃
Vti70.1
60,000
24h
*8.用长波紫外光显示DNA带，并戴保护镜
在254，300或366nm波长的紫外光照射下，EtBrDNA复合物便会马上发出荧光。
但短波UV会使DNA出现单链缺刻或是形成二聚体，所以观察DNA及取样时均使用长波段紫外光（366nm）。
*9.从DNA溶液中除去EtBr
加入1体积经缓冲液饱和的异戊醇（isopropanol）或异丁醇（isobatanol）到DNA溶液中，混匀后静置片刻，EtBr便被抽提到上相中去（呈末了红色）。
由于isopropanol或isobutanol两者均能从DNA溶液中移去水，从而使DNA得到浓缩。
这样也就改变了DNAbuffer的体系的体积，所以事先得用DNAbuffer饱和isopropanol或isobutanol。
应尽量除净EtBr，因它影响酶切反应。
四、质粒DNA的复制与拷贝数的控制
1．ColE1质粒DNA复制调节的机理（FromL.SnyderandW.Champrees.P.111-112）
（1）RNAI和RNAII分子：
RNAI和RNAII这两种分子都是由ColE1DNA转录产生的，是控制ColE1质粒复制的两种关键因素。
RNAI和RNAII分子的互补关系：
由于这两种RNA分子是根据同一区段DNA的正反链合成的，因此两者的序列是彼此互补的。
RNAI是由ColE1质粒的inc基因编码的一种小分子量的RNA分子，它通过干扰RNAII分子的加工而抑制质粒DNA分子的复制。
RNAII也是由ColE质粒DNA编码的另一种小分子量的RNA分子，它可形成质粒DNA复制的引物，并在复制起点形成RNA-DNA杂交分子。
（2）RNase的功能：
RNase是一种核酸内切酶，它切割RNAII分子释放出3-OH作为DNA聚合酶I催化的DNA复制的引物。
但是，除非RNAII被RNaseH加工，否则它无*（见P.5-16页）
这种蛋白质形成二聚体，增强了RNAI和RNAII之间的碱基配对作用。
结果RNAII（引物）的加工便被抑制，甚至于在RNAI分子处于相对低浓度的情况下亦是如此。
2．质粒DNA拷贝数的控制
（1）天然质粒拷贝数的控制
实验证明，一个细胞中每种质粒拷贝数的多寡是通过控制DNA合成的启动速率来调节的。
低拷贝质粒——在细胞分裂前只需复制少数几次就够了。
高拷贝质粒——在细胞分裂前需要复制多次才能达到足够数量的拷贝数。
（2）杂种质粒拷贝数的控制
pSC134质粒是由ColE1和pSC101重组形成，这两个质粒的拷贝数分别为18个和6个。
①从ColE1ori开始的复制，pSC134拷贝数可达16个，大体接近ColE1的拷贝数。
图
ColE1及其派生质粒的复制调节：
RNAII分子在其能够引发质粒DNA进行之前，必需经受RNaseH的加工。
（RNAII分子必须经过RNaseH加工之后，才能引动质粒DNA进行复制）。
“起点origin”表示RNA引物和DNA之间的转换点（transitionpoint）。
在大部分时间中，RNAI和RNAII分子结合，从而抑制（RNaseH）对RNAII的加工，结果质粒的拷贝数受到了调节。
PRNAI和PRNAII是分别代表RNAI和RNAII转录的启动子。
RopProtein二聚体增强了RNAI和RNAII之间的起始配对。
法作为引物启动质粒DNA的复制，因此质粒DNA的复制活动也就停止了。
由于RNAI和RNAII这两种RNA分子的序列是彼此互补的，故可形成双链的RNA双螺旋分子。
这种结构的形成便阻止了RNAII分子的加工，从而阻止了质粒DNA的复制。
（3）ColE1质粒维持其拷贝数的机理
上述这些情况解释了为什么ColE1质粒能够维持其拷贝数的原因：
*1.因为RNAI分子先由ColE1质粒DNA编码合成的，所以当质粒拷贝数增多时，便可合成出较多数量的RNAI分子。
而高浓度的RNAI分子又反过来干扰大多数RNAII分子的加工，于是质粒DNA的复制便被抑制。
当细胞中质粒的拷贝数达到大约16个时（ColE1质粒的拷贝数是每个细胞16个），质粒DNA的复制便几乎被完全抑制。
*2.除了RNAI之外，质粒编码的一种叫做Rop的蛋白质，也帮助维持ColE1质粒的拷贝数。
3．质粒复制控制的分子模型：
*抑制蛋白质稀释模型（Inhibitordilutionmodel）
关键论点是：
阻遏蛋白质是组成型合成，其浓度同质粒的拷贝数成正比。
*自体阻遏蛋白质模型（Autorepressormodel）
关键论点是：
阻遏蛋白质的合成受负反馈（Negativefeedback）机理调节，而且其浓度是恒定的。
1．抑制蛋白质稀释模型
观点：
a.质粒DNA的复制，是受一种由质粒DNA编码的抑制蛋白质Cop调控的。
b.细胞中Cop蛋白质的浓度是同质粒分子的拷贝数成正比。
c.Cop蛋白质抑制质粒DNA复制活性的作用方式有两种途径：
第一种途径：
直接抑制途径。
通过同质粒DNA的复制起点（Ori）结合，直接地抑制质粒的复制。
第二种途径：
间接抑制途径
通过阻断起始蛋白质的合成，间接地抑制质粒DNA的合成。
*一般认为单体状态的Cop抑制蛋白质没有活性，只有它处于多体状态时是才有活性的；单体抑制蛋白质和多体抑制蛋白质间的平衡，完全取决于细胞中的抑制蛋白质自身的浓度；
作用机理：
在细胞生长过程中，体积加大→抑制蛋白质的浓度随之下降→形成单体的抑制蛋白质→失去抑制活性，结果对质粒DNA的复制的抑制作用也就被撤除了→质粒DNA复制启动→拷贝数不断上升→到一定程度形成多体形式的抑制蛋白质→具有抑制活性→重新导致质粒DNA复制活性的抑制。
2．自体阻遏蛋白质模型
第一种解释：
质粒DNA的复制是由一种叫做起始因子蛋白质Rep引发的；
这种Rep蛋白质是质粒DNA复制启动作用的限速因子，它的浓度决定着每个细胞每个世代之质粒分子的最终复制总数；
Rep=起始因子蛋白质
起始因子蛋白质Rep的编码基因rep和自体阻遏蛋白质编码基因atr，同属于一个操纵子，共转录成一个mRNA分子；
Atr=自体阻遏蛋白质
自体阻遏蛋白质通过同启动子-操纵单元（P/O）的结合作用，调节质粒DNA的转录作用，以维持细胞中Atr和Rep蛋白质处于恒定的水平；
由Atr蛋白质调节产生的Rep蛋白质，是通过同复制起点（ori）的结合，引发质粒DNA的复制。
第二种解释：
Rep蛋白质是一种具有双重功能的蛋白质：
a.它既有自体阻遏蛋白质的功能，可同P/O区结合而抑制转录作用；
b.它又
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