动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择.docx
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动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择
动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择
3
米 力 陈志南
33
（第四军医大学细胞工程中心国家863西安细胞工程基地 西安 710032
摘要 目前全世界蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过了现有生产能力。
动物细胞
规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。
当前被FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养,工艺设计是流加或灌流培养。
其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的工艺控制手段,规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。
关键词 动物细胞 大规模培养 生产蛋白收稿日期:
2003204210
3国家重大科技专项（2002AA2Z3441
33通讯作者,电子信箱:
chcerc2@
动物细胞大规模培养已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。
专家预言:
蛋白治疗药物如糖蛋白,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场,预计在下一个10年或20年会有一个更为快速的发展。
蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求
已远远超过目前全世界的生产能力[1]
。
由于动物细胞表达产品需求的紧迫性和生产工艺的复杂性,大大促进了该技术的深入研究与发展。
80年代初首先兴起了生物反应器研究,许多形式的生物反应器被用于哺乳动物细胞培养工艺的研究,如中置搅拌系统,固定单层培养和中空纤维系统等。
近10年的研究在解决动物细胞大规模培养的关键屏障技术,如限制性氧气的提供,消耗产物的积累,成熟精确的过程控制,剪切力的敏感性,和贴壁细胞培养规模化放大等问题都取得可喜
的进展[2]
。
目前动物细胞工业化生产中主要致力于提高单位细胞的生产力,确保产品质量和过程工艺设计的一致性,减少工业化生产中的污染与自动
化控制等[3]
。
以转基因动物和转基因植物为载体的重组蛋白生产在生物制药领域仍具有重要的地位,特别对于每年100kg的超大规模需求量生产。
目前被美国FDA批准的生物技术产品和已公开发表的生产工艺,都是较为成熟的工艺,并不代表当前动物细胞研究发展的趋势。
因此动物细胞大规模培养生产蛋白或抗体的工艺选择,应综合考虑产品特点、工艺难度与工艺研发时间,以加速其产品产业化的进程。
以下就目前动物细胞大规模培养成熟工艺与当前研究的问题、对策作一简述。
1 目前美国FDA批准的产品与生产工艺
1996年1月至2002年12月美国获得成功批
准的不同的治疗剂和诊断剂产品共31种,其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种（美国FDA网页http:
ΠΠwww.fda.gov。
蛋白治疗药物有单克隆抗体治疗乳腺癌的Herceptin,免疫球蛋白肿瘤坏死因子（TNF受体融合蛋白治疗类风湿性关节炎的Enbrel和灭活的甲肝疫苗Vaqta等。
动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术,并逐步形成商业化操作水平。
按技术应用专利的分类,我们将这些产品分为重组治疗药物、疫苗、组织培养产品和诊断试剂并连同他们的生产形式列于表1。
总结表1的数据,在21种产品中有11种产品是用3种主要的细胞系CHO、SP2Π0、NSO生产的重组蛋白治疗药物。
首先重组治疗药物,主要是重组蛋白或抗体,对产品应用最有代表性的需要是生产
第23卷第7期
中 国 生 物 工 程 杂 志
CHINABIOTECHNOLOGY
2003年7月
表1 BLA哺乳动物细胞培养系统来源产品详细数据a（1996~2000BLA产品名厂商批准日期产品形式细胞系方法培养液
重组蛋白
TenecteplaseΠTNKase
急性心肌梗死
Genentech6Π2Π00重组糖蛋白CHO无报道无报道
抗血友病因子GeneticsInstitute3Π6Π00重组糖蛋白CHO连续灌流无血清TrastuzumabΠHerceptin
转移性乳腺癌
Genentech9Π25Π98嵌合抗体CHO搅拌生物反应器,悬浮无血清InfliximabΠRemicade
Crohn’sdisease
Centocor8Π24Π98嵌合抗体NS0搅拌,悬浮灌流培养无血清PalivizumabΠSynagis
预防呼吸道病毒
MedImmune6Π19Π98嵌合抗体NS0搅拌,悬浮流加培养无血清
BasiliximabΠSimulect预防急性器官排斥
Novartis
Pharmaceuticals
5Π12Π98嵌合抗体鼠骨髓瘤搅拌,悬浮灌流培养无血清
DaclizumabΠZenapax
预防急性器官排斥
Hoffman2LaRoche12Π10Π97嵌合抗体SP2Π0无报道无报道
RituximabΠRituxan
淋巴瘤IDECPharmaceuticalΠ
Genentech
11Π26Π97嵌合抗体CHO搅拌,悬浮培养含庆大酶素
CoagulationfactorⅨ
重组凝集因子
GeneticsInstitute2Π11Π97重组糖蛋白CHO搅拌,悬浮,反复批式培养无血清Interferon21aΠAvonex
治疗复杂性硬化
Biogen5Π17Π96重组糖蛋白CHO搅拌,悬浮培养无报道
疫苗
轮状病毒WyethLaboratories8Π31Π98肝过滤病毒疫苗FRhL22Notrevealed含胎牛血清狂犬病毒ChironBehring10Π20Π97灭活狂犬病毒无报道无报道无报道
甲肝疫苗Merck&Co3Π29Π96灭活病毒
人二倍体
纤维母细胞
Adherent,NCFtoCostarCubes
连续流加培养
含血清
组织培养产品
自体同源培养
chondrocytesΠCarticel
软骨缺陷修复
GenzymeTissueRepair8Π22Π97自体同源细胞软骨细胞组织培养饼含血清
诊断试剂产品
人T淋巴细胞病毒用于酶联ELISAAbbottLaboratories8Π15Π97抗体
慢性感染人
T、B淋巴细胞
无报道无报道
Capromabpendetide肿瘤诊断Cytogen10Π28Π96鼠IgG1杂交瘤中空纤维反应器
无血清含牛血清
白蛋白,转铁蛋白
NofetumomabΠVerluma
肿瘤诊断
DrKarlThomae8Π20Π96鼠IgG2bFab抗体杂交瘤无报道无血清Imciromabpentetate
心肌诊断
Centocor7Π3Π96鼠IgG2Fab抗体杂交瘤无报道血清,含庆大酶素 a2000年至今又有7个动物细胞表达的重组蛋白和抗体药物被FDABLA批准,但因多数无有关工艺的报道,此表未显示
产量与质量,其生产形式至少70%是采用搅拌式生物反应器悬浮培养形式,50%以上采用无血清培养;疫苗和组织替代品其产品来源许多不用的细胞系,它需要特殊的生物反应器系统和培养液;虽然用于诊断的产品主要是单克隆抗体,类似于重组治疗,但需求量明显低,这就允许考虑多种特殊的生产形式和生物反应器系统。
因此,目前用哺乳动物细胞大规模培养生产蛋白的工业化过程,可以看作是以搅拌式生物反应器悬浮培养作为通用技术平台,使用常用的3种细胞（CHO、SP2Π0、NSO依托该平台工艺并使其生产能力提高。
平台工艺的特点是采用无血清培养和成熟的流加和灌流工艺。
2 目前公开发表工艺的研究
目前被批准的生物技术产品以及公开发表的工业化生产工艺,都建立在这个产品进入临床研究之前,因此这些技术不代表当前动物细胞研究发展的趋势,在工业化逐级放大生产过程中有些已体现出一定的滞后问题[3]。
2中 国 生 物 工 程 杂 志第23卷
当前哺乳动物细胞培养工艺中占有主流优势的是悬浮搅拌式培养工艺,特别是在重组治疗性蛋白和抗体的规模化生产。
在工业化生产中,悬浮培养工艺参数的放大原理和过程控制比其它培养系统较易理解和掌握,因此在规模化动物细胞培养生产中多选择悬浮细胞培养工艺（表1。
Moran等[4]和Schenerman等[5]悬浮流加培养CHO、NSO细胞,在Ⅰ2Ⅲ期临床研究单抗的生产放大中使用了202452100L生物反应器,工业化生产放大到50022000210000L,放大过程的工艺性能和产品特点都非常相似。
Sauer等用搅拌式生物反应器,无血清流加培养SP2Π0、NSO细胞生产人源化IgG抗体,工艺优化过程从3L215L2750L直接放大,其细胞密度,特异性抗体产生率和产品质量非常相似。
作者认为一个好的细胞培养平台系统可适用于许多不同重组蛋白或抗体的生产,选择适宜的平台系统可有意义地减少工艺过程所需的时间[6]。
悬浮贴壁细胞培养的传统方法是采用转瓶、堆积床和微载体悬浮培养,转瓶和堆积床培养的放大生产受到很大的限制,悬浮微载体培养是目前疫苗生产常采用的一种形式。
Wiktor等用悬浮微载体培养Vero细胞生产狂犬疫苗,初始工作种子在1L生物反应器培养,然后是放大至5L225L2150L生物反应器,以后还可在放大到1000L或采用多个150L的生物反应器,最后有效地感染病毒[7]。
非传统的贴壁细胞培养选用气升式生物反应器、膜透析生物反应器和填充床灌流培养等。
211 悬浮细胞培养工艺
悬浮培养适于许多细胞培养,如杂交瘤、鼠骨髓瘤（SP2Π0,NSO,对适于贴壁培养的细胞（CHO,BHK可进行细胞生长形式的驯化。
目前已发表的大量文献,就继续深入研究和进一步解释如何提高单位细胞的生产力;如何优化培养环境获得最高的产量,同时保持最好的产品质量;如何去除培养液中动物来源的成分,使大规模生产中的污染最小化;如何控制培养过程中的CO
2的积累等进行了论述。
在大规模细胞培养中,细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的最大障碍,由于在悬浮培养工艺中,细胞的死亡主要是因凋亡所致。
通过导入凋亡抑制基因（Bcl22来调节细胞抗凋亡的机制,延长细胞生存时间,促细胞活力和增加抗体的产量[8]。
悬浮培养工艺中影响细胞生产数量和质量的因素,主要应考虑细胞培养环境（营养条件、产物积累、pH、温度和渗透压,终产物（乳酸和氨毒性累积和必需营养物的添加等。
设计适应细胞生长的无血清培养基,控制营养物的添加,减少产物消耗积累是解决问题的有效手段。
1996年Xie等[9]运用化学计量法,根据动物细胞生长的需求,设计定量添加浓缩的培养液,将葡萄糖、谷氨酰氨的浓度维持在一个低水平,以改变细胞代谢方式。
在杂交瘤细胞流加培养周期超过550h,比较一般流加工艺特异性乳酸生成率减少了4倍,特异性氨生成率减少了10倍,细胞密度5×107Πml,峰值的活细胞密度大于115×107Πml,抗体累积浓度为214mgΠml[10]。
细胞培养过程的有效工艺参数控制,Enda等在两组流加悬浮培养的不同工艺参数控制（如pH,温度,结果温度控制为34℃比较37℃,平均生长率降低而特异产物生产率提高;当细胞外pH维持在>812和<619时,重组蛋白的糖基化将发生有意义的改变[11]。
另外有许多报道,批式培养在高渗透压环境可增加抗体浓度。
高渗透压不仅影响抗体的产量,还影响生长速率,生长指数持续时间和细胞的死亡率。
渗透压范围在350-400mOsm,特异性抗体产生率可较多地补偿细胞生长率和最大细胞密度的减少,以得到理想的最终抗体浓度[12]。
确保产品质量与无血清培养工艺的一致性是当前重组蛋白生产中最为关注的问题[3]。
Schenerman等在人源化抗体（Synagis放大生产过程中,用3个评价工艺参数（最大反应体积的群体倍增时间;低糖培养条件;回收后稳定时间对工艺放大过程进行了相似性比较研究,以确认工艺放大与产品质量的一致性。
结果显示在生物反应器逐级放大过程的早期,抗体表达存在着不同的糖基化形式;培养环境和条件的变化对细胞系的稳定性和抗体结构、活性滴度都没有影响[5]。
对于搅拌的剪切损害可通过反应器的优化被减少,另外在培养液中添加剪切保护剂,PluronicF68是使用最为广泛、研究最多的保护性多聚体,它可在细胞与气泡的接触面形成保护层,以减少动力学表面的张力。
212 贴壁细胞培养
贴壁细胞培养主要解决工艺放大的问题。
微载体无消化直接接种细胞的有关研究,Zhang等用
3
第7期米 力等:
动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择
一个3L~15L搅拌生物反应器内置一个旋转过滤器,灌流微载体培养CHO细胞生产重组人单核细胞集落刺激因子（hSTC,连续培养2个月,其工艺特色是直接接种微载体培养无细胞消化一步,在工艺中需要反复优化增加微载体的表面积和高微载体浓度下的搅拌形式。
确保产品质量与培养工艺的一致性对贴壁细胞培养同样至关重要。
Zhang等用完全相同的hSTC全长cDNA克隆baculovirus转染SF29昆虫细胞表达,在60L生物反应器生产,虽然生产方法和微载体灌流培养CHO细胞的产量相似,但CHO细胞生产的hSTC和SF29昆虫细胞生产的hSTC有不同的糖基化形式,因此说明糖基化形式对哺乳动物细胞表达产品的生产非常重要[13]。
目前报道的贴壁细胞生产工艺,最佳的生物反应器形式是搅拌式微载体悬浮培养系统,最大放大到10000L,并可提供最有效的优化工艺和最适宜的流加工艺设计。
最佳的工艺设计是高密度连续灌流培养,最近在30L生物反应器高密度微载体连续灌流培养Vero细胞生产人狂犬疫苗,微载体数量达到25gΠL,细胞密度可以达到12×109Πml,这项技术的进步主要是生物反应器提供一个独特的细胞沉降系统,高氧气传输系统,和高营养环境及强的pH缓冲体系[14]。
流加培养（fed2batch和灌流培养（perfusion是动物细胞培养工艺中最常用的两种操作方式。
另外可供选择的方式还有批式2反复流加（batch2refeeding。
虽然许多较老的病毒生产工艺采用批式操作（batch,新的病毒疫苗生产已采用改良的生产形式如批式2反复流加或灌流培养工艺。
流加培养工艺的基础是用搅拌生物反应器,营养物的添加主要考虑减少代谢废物的积累和营养的均衡,维持一个高细胞密度和高产物浓度。
灌流悬浮培养在生物反应器的设计上必须考虑细胞截流。
流加悬浮培养与灌流悬浮培养在操作形式上并无明显不同,两种操作形式的选择完全取决于每个产品潜在的细胞生长活力与相关产物的稳定性,以及产品的最高产量需求和质量要求。
213 悬浮和贴壁细胞生产工艺的共性问题近年来有许多有关动物细胞批式培养生产工艺中在线监控的研究,限制氧气供给,通过氧气测定优化添加工艺的研究[15]。
有关动物细胞培养的代谢和生理学研究以往多集中在乳酸和氨,在工业化生产尤其在高细胞密度时,CO
2
的积累可产生毒性或改变细胞的代谢。
Garnier等的结果是CHO细
胞可耐受的最大CO
2
浓度为33%（250mmHg时,CO2浓度18%时细胞生长受到抑制。
动物细胞通
过在线监控氧气吸收率以控制优化培养环境,CO
2溶解率的监测与控制是通过控制最小氧气需求量而实现的,BjornFrahm等,用“关气”法测定哺乳动
物细胞悬浮培养的溶解CO
2
浓度和HCO
3
浓度以
及CO
2产生率。
Pattison等报道用一个在线CO2溶解率分析（YSI8500在哺乳动物细胞和微生物发酵工艺中的应用,在30~2000L搅拌反应器微载体悬
浮培养,结果证明CO
2
积累对细胞生长、产物提高都是不利的,使用纯氧微通气以避免过多气泡伤
害,通过在线分析CO
2
溶解率,以氮气调节控制溶
解CO
2
的积累[16]。
动物细胞培养过程的污染,在规模化生产中一直是不可低估的问题。
污染原因极有可能是病毒或培养液中动物组织潜在的一些转染物,其它污染主要来源于不完善的工艺条件,被动的控制方法是使用抗生素,在商业化产品中抗生素的含量也存在着潜在的危险[17]。
无血清无蛋白培养一直是动物细胞培养的研究主题。
动物血清成分添加培养在工业化生产过程中已逐渐被FDA限制。
细胞起始在培养小瓶驯化无血清条件,后来放大到生物反应器悬浮培养最终要形成小的团块。
无蛋白和无胆固醇培养已成功地培养杂交瘤和转染谷氨酸合成酶的骨髓瘤细胞系NSO（正常胆固醇缺陷株用于生产人单克隆抗体[18]。
贴壁细胞的无血清无蛋白培养通常需挑选特殊的克隆,再克隆或适应每个新克隆。
通过分子遗传途径解决细胞依赖血清生长因素,CHO2K1细胞系转染胰岛素和转铁蛋白基因,细胞依赖自身合成所需的生长成分而有效生长[19]。
最为理想和有希望的研究是用机器人自动控制生物反应器,Lutkemeyer等已经成功显示机器人可执行20~100L反应器的无菌取样程序和提交样品到指定的分析仪器[20]。
3 结 论
回顾当前动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺中占有主流优势的是搅拌式生物反应器
4中 国 生 物 工 程 杂 志第23卷
悬浮培养,工艺设计是流加或灌流培养。
就美国FDABLAs批准公开的工艺,在动物细胞生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用以上较成熟的工业化支持技术平台,除少数特殊细胞系对工艺设计选择的多样性,对同类产品或同类细胞进行工艺研发和放大,以缩短产品工艺研发的时间,加快工业化进程。
当前大规模动物细胞培养生产所面临的挑战,是获得最大生产力的同时注重维持产品的质量;去除所有培养环境中外源因子的污染,更为精确有效的工艺控制手段,规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。
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