蓝莓中花色苷的稳固性及生物活性研究.docx

资源描述

蓝莓中花色苷的稳固性及生物活性研究.docx

《蓝莓中花色苷的稳固性及生物活性研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蓝莓中花色苷的稳固性及生物活性研究.docx（28页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

蓝莓中花色苷的稳固性及生物活性研究.docx

蓝莓中花色苷的稳固性及生物活性研究

东北农业大学学士学位论文学号：

蓝莓中花色苷的稳固性及生物活性的研究

学生姓名：

刘晶

指导教师：

徐雅琴

所在院系：

理学院

所学专业：

应用化学

研究方向：

天然产物化学

东北农业大学

中国·哈尔滨

2020年5月27日

NortheastAgriculturalUniversityBachelorDissertationStudent.:

StudyontheStabilityofAnthocyaninsinBlueberriesandBiologicalActivity

StudentName:

LiuJing

TutorName:

XuYaqin

Department:

CollegeofScience

Speciality:

AppliedChemistry

ResearchField:

NaturalProductsChemistry

NortheastAgriculturalUniversity

Harbin・China

May2020

蓝莓中花色苷的稳固性和生物活性的研究

摘要:

本实验以开发利用蓝莓资源，探明蓝莓中花色苷的生理活性为要紧目的，对蓝莓中的花色苷进行提取，并对其进行稳固性和生物活性研究，为开发利用蓝莓这一植物资源提供科学依据。

实验探讨了温度、光照、pH、金属离子﹑氧化剂、还原剂、葡萄糖对蓝莓花色苷稳固性的阻碍。

结果说明60℃下对蓝莓花色苷有增色的作用，超过60℃，蓝莓花色苷将发生降解，且降解遵从一级反映动力学规律；强光对蓝莓花色苷有破坏作用，在自然光和暗处蓝莓花色苷降解相对较慢；pH对蓝莓花色苷的有显著阻碍，在酸性条件下蓝莓花色苷较稳固；金属离子Cu2+和Fe3+对蓝莓中花色苷有专门大的破坏作用，金属离子K+、Na+、Ca2+对蓝莓花色苷有增色作用；葡萄糖对蓝莓中花色苷没有太大阻碍；还原剂、氧化剂对蓝莓花色苷具有严峻的破坏作用。

通过实验证明蓝莓花色苷具有抗脂质过氧化能力和清除羟自由基能力。

蓝莓花色苷的抗脂质过氧化能力强，对脂质过氧化的抑制率达到%；且清除羟自由基的能力随花色苷浓度的增加而增加。

关键词：

蓝莓花色苷提取稳固性活性

StudyontheStabilityofAnthocyaninsinBlueberriesandBiologicalActivity

Abstract：

Inthisexperiment,weusedblueberriestoextractandseparateanthocyaninsandstudieditsstabilityandbiologicalactivity,alsoprovidedscientificbasisfortheexploitationofblueberries.

Wediscussedtheeffectsoftemperature,light,PH,metal,ions,oxidants,reducingagents,glucoseonstabilityofanthocyaninsintheexperiment.

Resultsshowedthatat60℃belowanthocyaninshadhyperchromiceffect,morethan60℃,thedegradationwouldhappenedandcompliedwiththefirstorderkineticsreaction.AnthocyaninsdecompositedmoreslowlyinthenaturallightanddarkthantheeffectofpHonanthocyaninswasmoreremarkably,thepigmentwasstableintheacidicconditions;metalionsCu2+andFe3+hadthedecompositionimpactontheanthocyanins,K+,Na+,Ca2+hadlittleeffect;Glucosehadlittleimpactontheanthocyaninsofblueberries;;ReducingagentandOxidanthadseriousdegradationeffectonitsanthocyanins.

Experimentsprovedthatanthocyaninsofblueberrieshadanti-lipidperoxidationcapacityandremovinghydroxyradicalcapacity.Thecapacityofanti-lipidperoxidationwasstrongandtheinhibitionratecouldreachto%.Thecapacityofremovinghydroxyradicalwouldincreasewhentheanthocyaninconcentrationincreased.

Keywords:

BlueberriesAnthocyaninsExtractionStabilityActivity

1前言

蓝莓及花色苷的简介

蓝莓又称越橘、蓝浆果，属杜鹃花科，越橘属连年生落叶或常绿灌木，为一类小浆果果树，分为高丛蓝莓、半高丛蓝莓、低丛蓝莓。

蓝莓果实呈深蓝色，近圆形，平均果重~2.5g。

被白色果粉，果肉细腻，种子极小，酸甜适口，而且有宜人香气，为鲜食水果佳品[1-2]。

果实蓝莓果中含有花色素苷、黄酮等多种多酚类生理活性成份，具有很强的抗氧化性。

最近几年来美国农业部和美国国家医学研究院着重对蓝莓的营养与保健作用进行了深切研究，结果说明，蓝莓的营养成份并非仅限于果糖、纤维、维生素，更重要的是富含抗氧化剂、细菌生长抑制剂、鞣花酸、鞣花单宁、叶酸、花色素苷、类黄酮等化合物，而这些化合物关于人体内自由基的清除、抑制及逆转人体衰老有紧密关系[3]。

近几年的研究结果说明，蓝莓果实具有增进视红素再合成、抗炎症、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌等多种生理活性功能[4]。

美国蓝莓协会以为,正是由于蓝莓具有的这些功效，使得最近几年来蓝莓的消费市场逐年扩大，被称为继苹果和柑桔以后的“世界第三代水果”[5]。

花色苷是一种普遍散布于自然界的水溶性天然食用色素，属于黄酮多酚类化合物，是由花色啶在自然状态下与各类糖形成糖苷，组成了花、果实、蔬菜中许多品种的品种的蓝色、红色、紫色和黄色等。

花色苷的来源十分丰硕，如葡萄、红加仑、黑加仑、覆盆子、草莓、苹果、樱桃、红甘蓝和茄皮紫等[6]。

花色苷作为一种天然食用色素，平安、无毒、资源丰硕，许多研究说明花色苷具有较多生理活性功能，包括抗氧化及排除自由基、降低血清及肝脏中的脂肪含量；降低氧化酶的活性；能够降低高血脂大鼠的甘油脂水平，改善高甘油脂脂蛋白的分解代谢；抑制胆固醇吸收，降低低密度脂蛋白胆固醇含量；抗变异、抗肿瘤、抗过敏、爱惜胃粘膜等多种功能[7]。

由于花色苷色素具有较好的着色成效及生理活性功能，因此研究花色苷对加倍深切研究其在食物工业的应用前景有着超级重要的意义。

花色苷的稳固性

花色苷的还原性比较强，其稳固性都不是很高。

溶液状态下花色苷的稳固性受到pH、温度、光、氧气、离子强度、辅助色素和本身存在浓度的阻碍[8]。

一般的花色苷不稳固的缘故是其在水溶液中存在四种互变体：

有色的黄锌盐离子AH+、醌基A和无色的假碱B、查尔酮C，它们之间存在三种平稳转换，非酰化和单酰化的花色苷在pH很低时，其溶液呈现最强的红色。

随着pH的增大，花色苷的颜色将褪至无色，最后在高pH时变成紫色或蓝色[9]。

花色苷不管是在天然体系仍是在模拟体系，其稳固性都会明显的受到温度的阻碍。

花色苷的热稳固性与其结构、pH、氧和体系中其它化合物的反映有关[10]。

光线对花色苷有两种作用，一是有利于花色苷的生物合成，二是能引发花色苷的降解。

花色苷自身缩合或与其它有机物缩合后．依照环境条件的不同，可能提高或降低花色苷的稳固性[11]。

在高浓度的糖存在下，由于水分活度降低，花色苷生成假碱式结构的速度减慢，因此花色苷的颜色取得了爱惜；在低浓度的糖存在下，花色苷的降解或变色却加速[12]。

花色苷与钙、铁、铜、铝、锡或其它金属离子的络合对颜色也能起稳固性作用。

可是，只有那些在B一环上含有邻位羟基的花色苷才能与金属离子络合。

因此，能够通过向花色苷添加某种金属离子，再观看其最大吸收波长是不是移动，来区别具有这种特定结构的花色苷和其它的花色苷[13]。

尽管金属离子对花色苷具有稳固和爱惜作用，但其效应也不是有利无害的，因为在增色的同时形成的金属一单宁络合物可致使褪色[14]。

在探讨其稳固性的阻碍因素及规律，关于花色素苷的普遍应用是有帮忙的。

本论文研究了蓝莓花以蓝莓果实为原料，系统研究了蓝莓花色苷的稳固性，以期为蓝莓花色苷的开发和利用提供科学依据。

花色苷的生物活性

花色苷具有天然缺电子特性使得其反映活性很强。

花色苷是一种天然的抗氧化剂，具有抗氧化、清除自由基等多种保健和营养功能，现已被列为有强抗氧化活性的天然产物[15]。

目前经常使用的抗氧化剂均为人工合成，如BHA（丁基羟基茴香醚）、BHT（二丁基羟基甲苯）和PG（没食子酸丙酯），实验证明人工合成抗氧化剂对人体有必然的毒副作用。

因而富含各类天然抗氧化物质的水果和蔬菜的抗氧化活性及抗氧化成份的研究备受注视，以天然抗氧化剂取代合成氧化剂是食物添加剂的进展趋势[16]。

目前国内外对紫甘薯花色苷、黑大豆种皮花色苷抗氧化作用均有研究，但对蓝莓花色苷抗氧化性国内报导较少[17]。

自由基是生物体生命活动进程中由其机体生物化学反映产生的中间产物，是含有一个未成对电子的原子或原子团。

由各类氧自由基引发的氧化作用，是致使躯体中各组分和器官损伤、病变的重要缘故之一[18]。

花色苷具有抗氧化、清除自由基等作用，花色苷的抗氧化清除自由基活性现已取得深切研究，在不同的实验体系中均表现出相当的活性[17]。

本文通研究了蓝莓花色苷的抗脂质过氧化能力及对羟自由基的清除作用，为论述蓝莓花色苷的抗氧化机制、开发蓝莓花色苷保健品提供参考。

2实验材料与方式

实验材料

2.1.1原料

2020年8月采摘大兴安岭野生蓝莓果实，冷冻保藏温度在-20℃冰柜中。

2.1.2仪器

仪器名称

生产公司

EYELA油浴锅

上海爱明仪器有限公司

W201恒温浴锅

上海申胜生物技术有限公司

电热恒温水浴锅

上海市医疗器械五厂

TDL80-2B离心机

上海安享科学仪器厂

pHS-25型酸度计

上海伟业仪器厂

202-2A型电热恒温干燥箱

天津市泰斯特仪器有限公司

B型玻璃仪器气流烘干器

郑州杜甫仪器厂

R-205旋转蒸发仪

上海申胜生物技术有限公司

SHB-3型循环水多用真空泵

郑州杜甫仪器厂

SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵

郑州长城科工贸有限公司

T6新悦紫外-可见分光光度计

北京普析通用仪器有限责任公司

JJ-2组织捣碎匀浆机

常州国华电器有限公司

CL-2型恒温加热磁力搅拌器

巩义市英峪予华仪器厂

JY92-2D超声波细胞粉碎机

宁波新芝科技股份有限公司

2.1.3试剂

试剂名称

纯度

试剂来源

95%乙醇

哈尔滨市新春化工厂

无水乙醇

分析纯

天津市天力化学试剂有限公司

氢氧化钠

分析纯

天津市天力化学试剂有限公司

盐酸

分析纯

天津市科密欧化学试剂有限公司

氯化钾

分析纯

天津市津东天正精细化学试剂厂

氯化钠

分析纯

天津市东丽区天大化学试剂厂

氯化钙

分析纯

天津市光复精细化工研究所

三氯化铁

分析纯

天津市双船化学试剂厂

氯化铜

分析纯

天津市双船化学试剂厂

过氧化氢

分析纯

天津市耀华化学试剂有限责任公司

亚硫酸钠

分析纯

天津市东丽区天大化学试剂厂

葡萄糖

分析纯

天津市东丽区天大化学试剂厂

卵磷脂（大豆）

天津市博迪化工有限公司

磷酸氢二钠

分析纯

天津市津东天正精细化学试剂厂

磷酸二氢钠

分析纯

天津市津东天正精细化学试剂厂

硫代巴比妥酸

中国医药（集团）上海化学试剂公司

硫酸亚铁

分析纯

天津市双船化学试剂厂

三氯乙酸

分析纯

上海凌峰化学试剂有限公司

水杨酸

分析纯

天津市天力化学试剂有限公司

实验方式

2.2.1蓝莓花色苷提取液的制备

称取必然质量的蓝莓果实，粉碎后，依照液料比1:

10加入95%乙醇超声提取20min。

减压过滤取得提取液，将提取液旋转蒸发浓缩除去过量的溶剂，取得花色苷粗体物的浓缩液。

浓缩液用乙酸乙酯10mL×6洗涤除去脂溶性杂质，残余物加入蒸馏水溶解取得花色苷提取液。

该提取液置于棕色瓶中放置冰箱中冷藏备用。

2.2.2蓝莓花色苷最大吸收波长的确信

取必然量的样品粗提液，在250~700nm下扫描，确信蓝莓花色苷的最大吸收波长。

2.2.3蓝莓花色苷稳固性研究

2.2.3.1温度对蓝莓花色苷的阻碍

取必然量的母液稀释后得供试色素液，将供试色素液别离置于恒温水浴40℃、60℃、80℃、100℃条件下，每隔40min取样10mL，放于暗处静置冷却后，测定最大吸收波长下的吸光度，分析温度对蓝莓红色素稳固性的阻碍。

2.2.3.2光照对蓝莓花色苷的阻碍

取必然量母液稀释后，别离置于自然光（直接照射）﹑自然光（避光照射）﹑暗处，每2天测其最大吸收波长下的吸光度，并计算色素的降解率，以此表示光对色素的阻碍。

降解率=［（A0-At）/A0］×100%

式中：

A0—初始时红色素的吸光度；

At—t天后红色的吸光度

2.2.3.3pH对蓝莓花色苷的阻碍

别离吸取必然量色素液，各加入pH为3、五、7、九、11的氢氧化钠-盐酸溶液，制备取得花色苷水溶液25mL，摇匀静止10分钟后，在室温下于最大波长下测定不同pH下色素液的吸光度，并观看颜色转变，分析不同pH对蓝莓花色苷的阻碍。

2.2.3.4金属离子对蓝莓花色苷稳固性的阻碍

别离配置2mol/L的KCl、NaCl、CaCl2、FeCl3、CuCl2标准溶液100mL。

吸取必然量色素液，加入烧杯中，别离用蒸馏水、2mol/L的KCl、NaCl、CaCl2、FeCl3、CuCl2溶液稀释到，在最大吸收波长下别离测定各样品的吸光度，记录吸光度A1；试液在室温下放置1h，再次别离取样测定吸光度A2，将加入金属离子的样品与加入蒸馏水的样品做对照，别离观看颜色和样品吸光度的转变。

2.2.3.5氧化剂（H202）对蓝莓花色苷稳固性的阻碍

别离吸取必然量色素液，以H202作为氧化剂。

配制H202浓度别离为0，%，%的花色苷溶液25mL，测定最大吸收波长下的吸光度，别离记录吸光度A0、A1、A2，以A1/A0和A2/A0计算不同氧化剂浓度下花色苷的残留率。

室温下放置1h，再次取样别离测定吸光度，以一样方式计算一小时后加入不同浓度还氧化剂的蓝莓花色苷的残余率。

2.2.3.6还原剂（Na2S03）对蓝莓花色苷稳固性的阻碍

别离吸取必然量色素液，以Na2S03作为还原剂。

配制Na2S03浓度别离为0、、L的花色苷溶液，测定最大吸收波长下的吸光度，别离记录吸光度A0、A1、A2，以A1/A0和A2/A0计算不同还原剂浓度下花色苷的残留率。

室温下放置1h，取样别离测定吸光度，以一样方式计算一小时后不同浓度还原剂下蓝莓花色苷的残余率。

2.2.3.7葡萄糖对蓝莓花色苷稳固性的阻碍

别离吸取必然量色素液，配制葡萄糖质量浓度别离为0，10%，20%的花色苷溶液25mL，测定最大吸收波长下的吸光度，别离记录吸光度A0、A1、A2，以A1/A0和A2/A0计算不同葡萄糖浓度下花色苷的残留率。

室温下放置24h，取样别离测定吸光度，以一样方式计算24h后加入不同浓度葡萄糖溶液的蓝莓花色苷的残余率。

2.2.4蓝莓花色苷抗氧化性研究

2.2.4.1蓝莓花色苷抗脂质过氧化能力的测定

1.试液的配制

（1）脂质体PBS分散系（LLS）：

300mg卵磷脂溶解于30mL10mmol/磷酸盐缓冲液（PBS），冰浴震荡。

（2）10mmol/磷酸盐缓冲液（PBS）配制：

称取8.00gNaCl、0.20gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调剂溶液的pH至，最后加蒸馏水定容至1.00L即可。

（3）三氯乙酸（TCA）-硫代巴比妥酸（TBA）-盐酸（HCl）混合液：

，，浓盐酸依序放入水中。

2.抗脂质过氧化化能力的测定方式

别离于样品管中加入LLS、硫酸亚铁、样品，混匀。

避光于37℃水浴60min，加入TCA-TBA-HCl混合液，90~100℃水浴15min，迅速冷却，以3000r/min转速离心10min，取上清液在535nm测吸光度As。

空白管以1mL重蒸水代替1mL样品，操作方式一样品管，可测得空白管的吸光度Ac。

参比管以1mL重蒸水代替1mL卵磷脂，其他的溶液和样品管一样，计算抑制率。

抑制率（%）=（Ac-As）/Ac×100%

式中：

Ac—不加花色苷溶液的脂质氧化体系；

As—加花色苷溶液的脂质氧化体系。

2.2.4.2蓝莓花色苷清除羟自由基（·OH）能力的测定

利用H2O2与Fe2+反映产生.OH，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510nm有最大吸收。

向反映体系中加10mmol/LFeSO4，10mmol/L水杨酸-乙醇，浓度为mL、mg/mL、mL、mL、mg/mL的蓝莓花色苷溶液，最后加LH2O2启动反映，37℃反映，在510nm下测定各浓度的吸光度A1。

以1mL蒸馏水代替1mLH2O2溶液作空白调零，以1mL蒸馏水代替花色苷溶液测定510nm下的吸光值A0。

考虑花色苷本身的吸光度，以1mL10mmol/LFeSO4，1mL10mmol/L水杨酸-乙醇，1mL不同浓度蓝莓花色苷溶液和1mL蒸馏水作为花色苷的本底值A2，计算清除率。

清除率（%）=[A0-（A1-A2）]/A0×100%

式中：

A0—不加花色苷溶液启动反映的吸光度；

A1—加入花色苷溶液启动反映的吸光度；

A2—加入花色苷溶液未启动反映的吸光度。

数据处置分析

实验数据以三次实验结果的平均数±标准差（mean±SD）表示。

所有数据均有三次平行。

3结果与分析

蓝莓花色苷最大吸收波长的确信

图1蓝莓花色苷的光谱扫面曲线

由图1可知：

该物质最大吸收波长一个在可见光区的522nm处，另一个在紫外270nm处。

通过测定色素的最大吸收波长即可判定是花色苷类色素[18]。

因为该物质在紫外区别离有两个明显的吸收峰，能够证明该物质是具有酰基化结构的花色苷[19]。

花色苷的稳固性

3.2.1温度对蓝莓花色苷稳固性的阻碍

3.2.1.1温度对蓝莓花色苷的阻碍

温度对蓝莓花色苷稳固性阻碍见图2：

图2不同温度对花色苷的阻碍曲线

图2说明：

40℃和60℃花色苷溶液随其吸光度随着贮藏时刻的延长而增大，而且颜色泽慢慢加深，吸光度稍有上升，表现出增色效应。

这是由于该温度有利于花色苷的聚合有关[20]，而且在该温度下花色苷易发生“吸附”作用，使花色苷可能与液泡的内膜或液泡中的任何固态物质发生物理性吸附，从而阻止水解决所引发的失色[21]。

80℃和100℃条件下，花色苷溶液的吸光度随时刻增加而慢慢变小，且温度越高，降解速度越快。

3.2.1.2高温下花色苷的热降解规律

依照文献报导，花色苷的热降解遵从一级反映动力学规律，公式为lnA=-kt+B，A为吸光度，t为时刻，k为一级反映速度常数，B为常数，色素降解反映的半衰期为t1/2=k[22]。

利用表中的数据对lnA和t进行线形回归分析，取得了不同温度下的回归方程和相关系数，从而求出不同温度下的速度常数（k）和半衰期（t1/2），结果见表1：

表180℃和100℃下花色苷热降解的一级反映动力学规律

温度（℃）

回归方程