提高羊水细胞培养成功率的方法.docx

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提高羊水细胞培养成功率的方法

么伟1,许晓芬2,岳霞3,张丽娜4

<1.河北省复员军人医院检验科，河北邢台054000i2.镇江市妇幼保健院，江苏镇江212000；

3.邢台医学高等专科学校，河北邢台054000）

【摘要】目的探讨羊水细胞染色体培养及提高培养成功率的改良方法，更好地满足临床诊断的需要•方法对孕16〜21周孕妇实施羊膜腔穿刺术抽取羊水，用改良后的方法进行细胞培养及染色体收获。

结果对符合产前诊断指征的83例标本进行接种，培养成功率100%o83例标本中共发现4例染色体异常核型,检出率为4.82%。

其中21三体综合征1例，平衡易位1例，罗伯逊易位2例。

结论改良后培养成功率基本达到100%,成功率较之前有明显提高•

【关键词】产前诊断；羊水细胞培养;染色体核型分析;分裂相

【中图分类号】R446 1文献标识码】B【文章编号】∞I≡10.3969/j.issn.1672-3511.2011.05.072

羊水细胞培养及染色体制备是染色体病产前诊断的主要手段，自1966年Steele,Breg⑴首次报道培养羊水细胞成功,并应用于胎儿染色体疾病的产前诊断。

至今此项技术仍在产前诊断中起着无可替代的作用。

近年兴起的基因诊断由于特异性强、设备要求高、监测范围窄、实验影响因素多等缺陷仍无法取代羊水细胞培养与核型分析在产前诊断中的价值与地位。

但由于羊水细胞培养一直存在技术要求高、难度大、培养时间长、易污染、分裂相少等问题，许多医疗单位仍未能开展羊水产前诊断工作。

近十年来，随着羊水细胞的培养及其在染色体制片上的不断改进和完善，其已经逐渐在地市级医院推广开来。

由于羊水培养的影响因素较多，各实验室根据自己的现有条件（包括当地的气候如温度、湿度等），建立一套适合自己的培养方法尤为重要02009年1月〜12月，我室通过外出学习以及不断探索和改良，根据本实验室现有条件逐渐摸索出了一套较为成功的羊水培养方法,可明显提高羊水培养的成功率，把失败几率降到最小,现报告如下。

1资料与方法

1.1资料来源83例经产前筛查提示高危者和遗传咨询门诊的不良妊产史的孕妇年龄26〜40岁，孕周16〜21周，在孕妇知情同意后实施羊膜腔穿刺术。

1.2方法

1.2.1羊水采集方法B超引导定位,无菌条件下，采用7号腰穿针穿刺。

最先用5ml注射器抽取2ml羊水弃去，再换10ml注射器抽取羊水共20〜30ml,分别注入一次性无菌离心管中，立即送检。

1.2.2羊水细胞培养以1500rpm（500~800g）离心10min,弃去上清液，保留每管0.5ml羊水细胞层，吸管打散细胞，加入4.5ml羊水培养基（用移液枪和一次性移液管最好，减少了细菌污染的机会）充分吹吸打匀，分别接种于25cm2方形培养瓶（美国corning），并拧松瓶盖卧倒置于37笆恒温5%COii培养箱中开放式培养即可。

要根据细胞生长的状况来决定收获的时间，一般5天后，在显微镜下观察细胞生长情况，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛,在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时在有较好的梭形细胞克隆的情况下换上完全培养基，换液后培养24〜48小时，如细胞生长状况好，可加入秋水仙素0-04~0.08昭（一毫升注射器垂直加入20μg∕ml秋水仙素两滴）,4〜6小时后进行细胞学处理。

1.2.3羊水细胞收获采用胰酶和EDTA1:

1混合消化（0.25%EDTA-trypsin）°细胞间的连接依赖于CahMg2+存在，由于EDTA是Ca2+,Mg2÷⅜螯合剂,EDTA能结合细胞间及细胞与瓶壁间的Ca2+.Mg2÷，使细胞连接松散，消化吹打后容易分散成单个,便于充分进行低渗。

1.2.4低渗将0.5ml悬液管中加入已预温置37C的0.75MKCI低渗液4〜6ml,用滴管轻轻吸打,使其混匀，置37C水浴箱中低渗5min后，加入新鲜配置（甲醇:

冰醋酸3：

1）固定液1.5ml预固定，用滴管轻轻吸打，使其混匀37°C离心，水浴5min,1500rpm离心10min.

1.2.5固定去上清，加入固定剂8ml,轻混匀，37°C水浴10min,室温1500rpm离心10min,去上清，约留0.5ml,fi复固定1次。

1-2.6制片离心吸去上清液，留0.5ml制成细胞悬液,或吸净上清液，加入0∙5ml新配的固定液，用细长玻璃管小心吹打后吸出一滴,滴在从冰箱冷冻层中取出来的免洗玻璃片上,一般每片两滴，滴6张片（染4张，两张备用）。

放入75°C干燥箱干燥后，在显微镜

下观看染色体分散情况,

1.2.7制带如果染色体形态良好可做G带。

先将玻片在75P烤箱中烤3h后过夜，次日显带前烤15分钟。

将玻片入0.025%胰酶消化液60〜180私过两遍生理盐水，放入6%Giemsa染液中染色2〜5min,取出用流水冲洗，空气n然干燥后，即可在显微镜下观察染色体分裂相,按照人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2005）标准进行核型分析诊断。

常规计数15个，分析3个分散良好的细胞核型，异常核型的要计数30个分裂相，要求羊水染色体长短适宜，分散良好，带形清晰（图1、2）。

图I羊水染色体分裂相 图2收获前羊水地购

2结果

2.183例孕妇的羊水细胞培养，一次性羊水穿刺培养成功83例，成功率100%。

培养收获时间9〜12天，最短收获为7天，最长14天。

2.2在83例孕妇的羊水细胞培养中，有正常核型79例，异常核型4例，异常检出率4.82%,与有关报道相近口闵。

其中1例为47,XY,+2151例为46,XY,t（6；8）（q23ip23）i2例为45,XX.der（13∣21）（qlOsqlO）.

3讨论

行羊膜腔穿刺获得羊水细胞作产前诊断是目前广泛应用的技术,但这项技术对孕妇及胎儿仍存在一定的风险，可造成孕妇和胎儿的损伤、感染，流产发生率为2%3.羊水细胞主要来源于胎儿皮肤、消化、呼吸道等脱落细胞,细胞大部分是衰老和固缩的，脱落细胞中活性细胞数虽较少,体外培养相对困难;且影响羊水细胞培养成功率的因素很多⑴，其培养周期长、分裂相少、形态差、不稳定、细胞损耗大等诸多难点,给大部分实验室实际应用带来很多困难。

为确保羊水培养成功，避免导致孕妇行第2次穿刺，我们通过外出学习以及不断探索和改良，根据本实验室现有条件逐渐摸索出了一套较为成熟的羊水培养方法，并在试验中得到验证。

3∙1严格的无菊操作从羊水的采集到收获,每一步都要严格按照无菌操作来执行，操作中不要存在侥幸心理，任何一步微小的疏忽都有可能染菌。

3.2培养中的五个“二"培养必须两个人接种;使用不同公司的两种羊水培养基或同一公司的两个不同批号;分别在两个培养箱中培养；两个人收获细胞（收获中的kcl低渗、固定液、胰酶消化液都要使用不同的两线）；两个人发两份报告.这些措施可以JS免许多人为的失误和其它错误对培养过程的干扰，以提高成功率.

3-3羊水细胞采集时间高质虽的羊水细胞培养及收荻技术是进行羊水染色体分析诊断的关键。

因此我们在均在最佳采集时间16-21周之间，羊水细胞生长良好，形成的圆形、双圆形细胞较多。

16周之前羊水中脱落细胞较少，贴壁的羊水细胞相对更少,21周之后的羊水中有形成份增多,严重地影响了活细胞的贴壁.

3-4建立收获标准收获时机的把握是能否制得良好核型玻片的关键。

收获标准：

以倒置显微镜于4倍物镜下观察。

①以梭长形羊水细胞（AF细胞）为主要类型的生长细胞,形成的克隆覆盖了一个或一个以上完整视野•②培养瓶中有2〜3个此类克隆,且每个细胞克隆中存在有20个以上的圆形、双圆形或葡萄状透明细胞.③细胞克隆中央的细胞开始老化，克隆周边细胞生长旺盛为最佳收获时机。

平均在培养后8〜9天进行收获，最早7天，最长14天（孕周少，培养时间较长;孕周多，时间短）。

3.5原瓶消化羊水细胞具有接触抑制的生长特性，当克隆内细胞生长到一定程度，细胞由于相互接触而产生了生长抑制’当培养瓶底只有一个克隆时，若收获将得不到足够的分裂相而无法进行诊断。

在这种情况下，我们先弃上清用无菌消化液作用于细胞，并在显微镜下观察，当细胞收缩变圆但尚未脱离瓶壁时弃消化液，再加入新鲜培养基吹打，让细胞分散并重新贴壁生长，一般3~5d可得到足够满意的细胞克隆.因此在培养过程中，当克隆数太少时，不要轻易放弃，可将细胞进行原瓶消化，耐心等待细胞生长，当细胞基本铺满瓶壁时，再进行收获。

3-6收获方法①秋水仙素的用量：

用秋水仙素捕获中期细胞，用虽各不一样.可以用址大些，处理时间短一些，也可用最小些,处理时间长些，我们实验室用浓25mg/ml加1滴，处理4h,或用12.5mg/ml1滴，处理15h,完全根据细胞生长情况决定。

②低渗时间:

低渗液采用0∙75%KC1,这里我们强调处理时间必须恰当，如处理时间不就,染色体仍聚在一起;处理过长，细胞易破碎至收获过程中染色体丢失，我们采用恒温37E水浴低渗5min,效果很好。

（下转第页）入,彩超检查病灶周围血供丰富，而内部血流信号较少。

③类滋养细胞疾病型（1例）：

宫腔下段见回声紊乱，向前璧下段的肌层浸润,几乎达浆膜层,CDFI显示:

病灶内部及周围血管增多、增粗、周围血管呈环状，内部呈条索装。

均为低阻力型血流，本组误诊为滋养细胞疾病。

④类血块型（2例）：

子宫腔的下段见回声增强，或中等强度回声区，边界不规则，彩色显示,内部少许血流信号。

本组2例此型，其中1例误诊血凝块。

3讨论

切口妊娠属于一种特殊类型异位妊娠,病因不明，可能为剖宫产后，切口部位肌壁及内膜损伤，切口愈合不良，瘢痕过于宽大有关⑵，再次妊娠时,胚胎着床于子宫下段切口瘢痕处，由于妊娠的部位特殊⑶，孕卵着床部位肌层菲薄,多伴有绒毛或胎盘的植入,肌层收缩功能差，又处于子宫动脉分支入口处，血供极为丰富,临床如果诊断不明情况下行终止妊娠术极易发生难以控制的大出血，从而导致严重的并发症。

通过对本组31例切口妊娠的观察与分析，总结本病的超声影像学特征国：

①宫腔内及宫颈管内未见孕囊。

②子宫下段前壁肌层连续性中断，该处回声不均匀。

③子宫下段前壁切口处见无回声、孕囊或不均质回声团块。

④妊娠囊或不均质回声团块与膀胱之间的子宫肌层明显变薄,且与切口处肌层之间的界限不清，回声紊乱。

⑤彩色多普勒显示病变处血流信号丰富，一般呈低速，低阻力血流频谱。

本组误诊7例，分别诊断为宫颈管妊娠、不全流产、滋养细胞疾病、过期流产。

这说明我们在诊断切口妊娠时应该与以下几种疾病鉴别园。

①宫颈管妊娠:

孕囊位于宫颈管内而非前壁下段肌层内，与切口亦有一定距离，其膨大部分为宫颈管而非子宫下段。

②滋养细胞疾病:

两者病灶内血供都较丰富,且多为低速低阻型的，因此两者两者在血流动力学上没有明显的区别，这是需要结合临床及血液HCG,滋养细胞疾病血液HCG异常增高可资鉴别。

③不全流产:

妊娠残留物位于子宫腔内,不累及肌层。

而切口妊娠病灶位于前壁下段肌层内，且子宫下段膨大。

④血凝块:

血凝块内没有血流信号彩色多普勒可以鉴别。

4结论

对于有剖宫产病史并再次妊娠的患者，彩色超声检查时要特别观察妊囊的位置、妊囊与切口的关系、切口瘢痕处肌层厚度、妊囊与肌壁的分界以及宫颈与宫腔的情况，结合血流的分布情况与血流频谱分析,对于切口妊娠的早期诊断具有极其重要的临床价值。

【参考文献】

m刘志强，彭芝兰，杨太珠.超声在诊断及治疗剖宫产切口部位妊娠中的临床价值CJ].临床超声医学杂志,2006,8

（2）:

95-97.

[2]孙莉，常才,张钛华.20例剖腹产瘢痕部位妊娠的超声结