SDF1αcMYC 蛋白调控速激肽受体1截短型mRNA表达的 挑战杯.docx
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SDF1αcMYC蛋白调控速激肽受体1截短型mRNA表达的挑战杯
SDF-1α、c-MYC蛋白调控速激肽受体-1-截短型mRNA表达的研究
【摘要】目的：
观察基质细胞衍生因子1α（stromalcellderivedfactor1α,SDF-1α）、c-MYC蛋白对速激肽受体-1截短型（tachykininreceptor1trucated，TACR1-Tr，）转录水平的影响。
方法：
构建c-myc基因shRNA表达载体；用小干扰RNA方法沉默乳腺癌细胞MCF-7的c-myc基因，分成c-myc+细胞组和c-myc-细胞组，相关实验组加SDF-1α细胞因子中和抗体，用实时定量PCR检测TACR1截短型受体（TACR1-Tr）mRNA表达水平。
结果：
c-myc基因shRNA表达载体构建成功；在正常培养条件下，c-myc-细胞组的TACR1-Tr转录水平低于c-myc+细胞组（P<0.05）；加了SDF-1α中和抗体后，c-myc-组TACR1-Tr的mRNA表达水平高于c-myc+组（P<0.05）。
结论：
MCF-7细胞在正常培养条件下，c-MYC蛋白可以反式激活TACR1-Tr的转录；但加入SDF-1α因子中和抗体后，c-MYC蛋白失去了这种激活作用。
【关键词】基质细胞衍生因子1α；速激肽受体-1；shRNA；c-myc
ThestudyofSDF-1α，c-MYCproteinregulatetachykininreceptor
1-trucatedmRNAexpression
【Abstract】Objective:
InordertoinvestigatehowSDF-1αandc-MYCproteinregulatesTACR1-trucatedexpression.Method:
c-mycshRNAvectorwasconstructed,smallinterferingRNAwasemployedforsilencingc-mycgeneinMCF-7breastcancercell.SDF-1αneutralizedantibodywasusedinc-myc+cellgroupandc-myc-cellgroup,whileotherc-myc+cellgroupandc-myc-cellsgroupwereculturedundernormalcondition.themRNAlevelofTACR1-TrucatedwasdeterminedbyReal-TimePCR.Result:
c-mycshRNAvectorwasconstructedsuccessfully,inthenormalpresenceofSDF-1α,thelevelofTACR1-TrmRNAinc-myc-cellgroupwerelowerthanthatinc-myc+cellgroup（P<0.05）.ButinthepresenceofSDF-1αneutralizedantibody,TACR1-TrmRNAlevelofc-myc-cellgroupwashigherthanthatofc-myc+cellgroup（P<0.05）.Conclusion:
inthenormalculturecondition,c-MYCproteinmaytransactivateTACR1-TrtranscriptioninMCF-7cell;inthepresenceofSDF-1αneutralantibody,c-MYCproteinlosttheactivityoftransactivatingforTACR1-Trtransciption.
【Keywords】stromalcellderivedfactor1α;tachykininreceptor1;shRNA;c-myc
【前言】前速激肽原PPT-I是高度保守的单拷贝基因，通过替换剪切和转录后修饰产生几个属于速激肽（tachykinins）家族的肽，如P物质和神经激肽A等，并以不同的亲和性结合三种受体（tachykininreceptor-1,2,3）[1]。
PPT-I肽与神经内分泌系统有关联，在中枢神经系统和一些肿瘤组织呈构成性表达，也有研究发现骨髓基质细胞表达PPT-I肽，调节骨髓造血活动[2-4]，其中P物质和神经激肽A等作为中间递质参与机体多个器官功能活动[5,6]，在PPT-I肽各类受体中，速激肽受体1（tachykininreceptor1,TACR1）在乳腺癌细胞骨转移过程中扮演极为重要的角色，TACR1分为全长型（TACR1-Fl）和截短型（TACR1-Tr）两种受体，属于G蛋白偶联7次跨膜受体。
在乳腺癌细胞中，PPT-I基因过表达常导致TACR1-Tr以及几个相应的细胞因子产生，而在正常乳腺上皮细胞TACR1-Tr表达量低，甚至难以检测，而TACR1-Fl表达量比较高，在恶性度比较高的乳腺癌细胞,情况刚好相反，TACR1-Tr受体表达上调是乳腺癌细胞获得侵袭性的特征之一，尤其是获得骨转移特性[7-9]。
基质细胞衍生因子1α（stromalderivedcellfactor1α,SDF-1α）又称CXCL12或前B细胞刺激因子，与趋化因子受体4（CXCR4）形成CXCL12-CXCR4生物学轴，通过细胞内信号传导作用，调节相关转录蛋白，同样也调节TACR1受体表达[10],我们前期实验也表明SDF-1α表达水平与TACR1-Tr转录水平成负相关。
许多肿瘤的发生都与c-myc基因的过度表达和扩增有关，在一部分乳腺癌病例中c-myc都存在过表达[11-13]。
以往研究表明，c-MYC可以调节1500多种基因的表达,而c-MYC蛋白作为转录因子有结合基因调控区E盒（CANGTG,）的倾向（www.myccancergene.org），TACR1受体基因转录起始点上游调控区存在E盒结构，有学者通过荧光素酶报告基因实验证明了c-MYC蛋白可以直接结合以及作用TACR1基因的调控区，对下游基因进行调控[20]。
c-myc基因位于8q24，c-MYC蛋白有三个亚型c-MYC1、c-MYC2和c-MYCS[14-16]，其中最主要的是c-MYC2,其羧基端含有螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链模序结构，这一模序结构与DNA结合有关，c-MYC2与转录因子MAX结合形成二聚体，然后与E盒结合，c-MYC2氨基端发挥转录调控作用。
c-MYC蛋白可以调节细胞的增值、分化、凋亡等，在细胞周期中起着很重要的作用，尤其是诱导细胞周期调节蛋白E-CDK2，可以调控细胞进入S期[17-19]，所以c-MYC蛋白在不同的条件下所表现的功能千差万别。
由于以前的研究没有回答c-MYC蛋白如何影响TACR1基因的转录，以及细胞因子SDF-1α是否影响c-MYC蛋白的调控效应。
本研究试图用RNA干扰技术构建c-myc-和c-myc+细胞，观察c-MYC蛋白和细胞因子SDF-1α如何影响TACR1-Tr的转录。
1材料和方法
1.1材料
MCF-7人乳腺癌细胞本室保存。
DMEM/F12购自Hyclone公司，Opti-MEM®IReducedSerumMedia购自invitrogen公司。
引物用Premierprimer5和Oligo6.0设计，并在NCBI中进行比对，所有引物合成以及测序验证工作由某生物技术有限公司完成。
逆转录ReverTraAce试剂盒购自Toyobo，RT-PCR试剂盒购自Takara公司。
人SDF-1α中和抗体：
Abcam,USA。
1.2方法
1.2.1c-mycshRNA载体构建
表达shRNA的双链DNA设计从c-mycmRNA翻译起始密码下游100bp开始寻找基因沉默靶序列，按shRNA表达框设计原则进行设计，设计两条单链DNA每条单链为sense-loop-antisense结构（见表1），同时设计乱序链作为参照。
两条单链互相互补，且在链的两端设计了BamH
/Hind
粘性酶切位点结构，使得退火后形成的双链DNA可以直接连接载体。
单链合成后，用ddH2O稀释至10uM。
退火体系：
10×退火缓冲液2.5ul，c-myc上下游链各1ul，补ddH2O至28ul，在94℃水浴变性2min，关掉电源，让水浴箱自然冷却，缓慢退火，冷却后取出反应物。
pSilencer3.1TM-H1-Neo准备吸取5ul含pSilencer3.1TM-H1-Neo质粒的冻存菌液，置入5mlLB液体培养基中培养，含Ampicillin100ug/ml,37℃摇床过夜。
用TianDZ质粒小提试剂盒提取质粒,检测浓度为370ug/ml和A260/280=1.84，25ul质粒做BamH
/Hind
双酶切，体系如下：
pSilencer3.1TM-H1-Neo质粒25ul，bufferE5ul，BSA0.6ul,BamH
和Hind
各2ul。
37℃金属浴3小时。
酶切产物跑1%琼脂糖胶，把目的片段在紫外灯下迅速切下，用Biospin试剂盒回收胶中的目的DNA片段，方法见说明书。
dsDNA和pSilencer3.1TM-H1-Neo连接按插入片段和质粒摩尔浓度比为3:
1的比例，向反应管中依次加入：
质粒6ul，dsDNA2.5ul，5×buffer2.5，T4DNAligase1ul，室温连接2小时。
连接产物转化1.准备1.5ml无菌离心管，加10ul转化产物和20ul试剂A，补无菌水至100ul，冰浴待用；2.取100ulDH5α感受态细菌直接加到上述冰浴的转化产物中，混匀，冰浴20分钟，室温平衡10分钟；3.加400ul没有抗生素的LB液体培养基至上述离心管中，37℃摇床培养40分钟；4.6000g，离心5分钟，弃去液体部分，用200ulLB液体培养基重悬细菌，均匀涂布在含100ug/mlAmpicillinLB固体培养板上，37℃培养过夜。
质粒测序鉴定每个培养板挑取3个菌落，分别置入5mlLB液体培养中增菌培养过夜，第二天每管取1ml送公司测序。
去内毒素质粒pSilencer3.1TM-H1-Neo-dsDNA提取:
根据QIAGENMidi试剂盒的说明书提取去内毒素质粒。
检测浓度和A260/280。
1.2.2c-myc和TACR1-TrmRNA转录水平检测
准备12个6cm培养皿，培养MCF-7细胞并使细胞均匀分布在培养皿里，保证培养24小时后细胞融合度达到70%左右。
培养24小时后，开始转染MCF-7细胞，方法参考FuGENE说明书。
分两组：
c-myc+组转染pSilencer3.1TM-H1-Neo参照，c-myc-组转染pSilencer3.1TM-H1-Neo-c-myc质粒，每组做6孔，普通培养24小时后，两组各取三个培养皿提取总RNA，方法参考Sorlabio细胞总RNA提取试剂盒说明书；另外剩下的两组6孔，每孔培养基换成5ml含0.9ug/mlSDF-1a中和抗体的DMEM/F12培养基，继续普通培养24小时，提取总RNA.。
各孔总RNA测定浓度以及1%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。
各孔取1.5ug总RNA用ReverTraAce试剂盒逆转为cDNA，并用TakaraSYBRPremixEXTaqTM做实时定量PCR（引物见表2），检测基因为c-myc、TACR1-Tr。
1.2.3统计分析用SPSS15.0统计学软件进行分析
2结果：
2.1c-mycshRNA表达框测序验证结果见图1测序结果显示：
shRNA-pSlicencer3.1-H1-neo-c-myc构建成功（图1），包括sense-loop-antisense。
2.2各实验组c-myc和TACR1-TrmRNA表达水平
2.2.1c-myc+细胞组和c-myc-细胞组的c-mycmRNA以及TACR1-TrmRNA表达
在未加SDF-1α中和抗体时，小干扰RNA对c-myc基因的沉默效率为42.2%（表3）；c-myc-细胞组TACR1R-TrmRNA表达水平明显低于c-myc+（P<0.05）（表4，图2）。
结果表明，c-MYC蛋白水平与TACR1-Tr转录水平存在正相关，鉴于c-MYC蛋白可以直接结合TACR1基因的调控区，并对下游基因的转录起着调控作用[20]，可以认为c-MYC蛋白对TACR1R-Tr的转录，在正常条件下，起着反式激活作用。
2.2.2SDF-1α中和性抗体对c-myc-细胞组和c-myc+细胞组TACR1-Tr表达的影响
c-myc-细胞组和c-myc+细胞组在加入SDF-1α中和抗体后，c-myc-细胞组TACR1-TrmRNA表达水平高于c-myc+细胞组（P<0.05）（表5，图3）。
这一结果与没有加SDF-1α中和抗体时，情形有所不同。
MCF-7细胞分泌的SDF-1α因子被加入的中和抗体部分中和，一定程度上消除了SDF-1α因子对自身细胞的作用，所以在细胞因子SDF-1α部分缺失的前提下，c-MYC蛋白对TACR1-Tr转录调控与正常情形下相比，发生了变化，c-MYC蛋白对TACR1-Tr的转录不再表现出激活作用。
如图2和3所示的结果为RT-PCR结果示意图。
扩增曲线（图2）：
在PCR反应过程中，以循环数为横坐标，以反应管内发出的荧光信号为纵坐标所作的曲线。
采集荧光信号的时间是在每个PCR反应的延伸末期。
图2和图3所有的扩增曲线有如下特点：
（1）曲线拐点清楚，低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线没有上扬的现象；
（2）各管的扩增曲线平行性好，各反应管的扩增效率相近；（3）所有反应管都在相近的时间进入平台期，且在指数区各曲线平行性非常好，表明组内差异很小，数据不离散。
溶解曲线（图3）：
所有内参基因β-actin、c-myc的溶解曲线比较理想，只有一个单一的峰；所有反应管内TACR1-Tr溶解曲线只出现一个高大的峰，在尾部有一个稍微凸起的小峰，由于峰比较低矮，代表荧光信号弱，对整体实验结果影响不大，在可接受范围内。
所以本次RT-PCR从所有的扩增曲线和溶解曲线来看，表明引物设计科学，数据可靠，基本上能够反应各实验组基因相对转录水平。
3讨论
c-MYC蛋白有结合基因调控区E盒的倾向，参与众多基因的转录调控，从而影响细胞生物学性状，c-myc基因的突变以及过表达与肿瘤的发生发展有着很大的联系。
根据研究c-MYC蛋白也能调节TACR1基因转录，在该基因转录起始点上游也发现几个E盒结构[20]。
TACR1表达产物分为全长型和截短型，研究表明，乳腺癌细胞尤其是高转移的乳腺癌细胞，截短型受体表达明显上调，通过小干扰RNA技术沉默c-myc基因，进一步说明c-MYC如何影响TACR1-Tr的表达，通过实时定量PCR，c-myc-细胞组的TACR1-TrmRNA水平都有不同程度的下降（P<0.05），但是加了SDF-1α中和性抗体后，相对于c-myc-细胞组，TACR1-TrmRNA水平在c-myc+细胞组表现为下调，课题组前阶段实验表明，SDF-1α水平与TACR1-Tr的表达水平成负相关，说明SDF-1α通过某种途径影响到TACR1-Tr的表达。
本实验观察到的现象是：
在正常培养条件下，c-MYC蛋白与TACR1-Tr的表达水平成正相关；在加入SDF-1α中和抗体后，观察不到这种相关性，有趣的是，在有正常水平c-MYC蛋白的c-myc+细胞组，TACR1-TrmRNA水平低于c-myc-细胞组。
这些现象说明细胞因子SDF-1α被部分中和后，c-MYC蛋白对TACR1-Tr的调节作用发生了逆转，根据这些结果，我们可以推论，c-MYC蛋白对TACR1-Tr的转录有调控效应，这种调控很有可能受到细胞因子SDF-1α的影响。
然而，细胞因子SDF-1α究竟是通过什么样的细胞信号通路来完成对基因TACR1的转录调节，c-MYC蛋白对TACR1-Tr的转录调节的过程中，还有那些细胞因子参与等问题还有待研究。
表1双链c-myc序列
name
5'-3'
myc1上
AGCTTAAAAAAGCTCGTCTCAGAGAAGCTG
GCACTCGTACAGCTTCTCTGAGACGAGCG
myc1下
GATCCGCTCGTCTCAGAGAAGCTGTACGA
GTGCCAGCTTCTCTGAGACGAGCTTTTTTA
表2实时定量PCR引物
引物名称x
5'-3'
c-myc上
GACTCCAGCGCCTTCTCTCCG
c-myc下
TGTTCCTCCTCAGAGTCGCTG
TACR1R-Tr上
GACCATCTACATACACAGTGGC
TACR1R-Tr下
GGCTGAGTTGTGTGATGATAAG
hactβ上
AGTCGGTTGGAGCGAGCATC
hactβ下
GACTTCCTGTAACAACGCATCTC
图1c-mycshRNA表达框测序结果
a
c
e
g
b
d
f
h
h
图2加入SDF-1α中和抗体后，各组细胞实时定量PCR扩增的溶解曲线。
a，b为c-myc+细胞组β-actin；c，d为c-myc+细胞组为TACR1-Tr；e，f为c-myc-细胞组β-actin；g，h为c-myc-细胞组为TACR1-Tr。
A
C
E
G
J
B
D
F
H
K
图3正常培养条件下，c-myc基因沉默组与未沉默组各基因实时定量PCR扩增的溶解曲线。
A,B为c-myc+组β-actin；C，D为c-myc+组TACR1-Tr；E，F为c-myc+组c-myc。
G,H为c-myc-组TACR1-Tr；J,K为c-myc-组c–myc。
表3.c-myc+和c-myc-细胞c-myc基因的mRNA表达
Group
Ct-c-myc
Ctactin
dCt
ddCt
RQ
c-mcy+
22.09±0.33
16.45±0.16
5.64±0.36
-.0.36
1.32
c-myc-
23.01±0.02
16.45±0.16
6.38±0.04
0.37
0.77
表4正常培养c-myc+和c-myc-细胞TACR1-Tr的mRNA表达
Group
CtTACR1-Tr
Ctactin
dCt
ddCt
RQ
c-mcy+
29.22±1.7
16.45±0.16
12.74±1.82
-2.04
6.14
c-myc-
32.05±0.63
16.45±0.16
15.42±0.58
0.63
0.68
表5加入SDF-1α中和抗体后c-myc+和c-myc-细胞TACR1-Tr的mRNA表达
Group
CtTACR1-Tr
Ctactin
dCt
ddCt
RQ
c-mcy+
30.82±0.46
15.72±0.15
15.1±0.35
1.43
0.38
c-myc-
30.74±0.93
16.11±0.13
14.63±0.84
0.97
0.58
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