智能手机成像的晶片上基于逆转录环介导等温扩增RTLAMP讲解.docx
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智能手机成像的晶片上基于逆转录环介导等温扩增RTLAMP讲解
智能手机成像的晶片上基于逆转录环介导等温扩增Gregory L. Damhorst(RT-LAMP1,2, Carlos Duarte-Guevara技术的全血中2,3, Weili Chen2,3, Tanmay GhongeHIV-11,2, Brian T. Cunningham检测
1,2,3, Rashid Bashir1,2,3*
摘要:
期临床护理来说是一个必不可少的工具。
然而,考虑到病毒载病毒载量测量对于人类免疫缺陷病毒(HIV阳性患者长人数已达到3690万[1]。
从HIV大流行的出现到现在的近量测量所需的仪器体积、成本和操作的复杂性,在医疗基础设四十年间,抗逆转录病毒疗法已经将HIV感染从一个“死刑判决”转变成一种可控的慢性疾病:
若HIV感染能够普及标准的病毒载量测量仪器是较为困难的。
为提高该检测方施较差的偏远地区(尤其是在被HIV感染人群比例较高的地区被有效控制,则其对患者预期寿命的影响很小[2]。
从人法的普及性,人们已经开始开发可以进行即时检测的病毒载量口层面来看,无论是新感染病例数还是母婴传播病例数,或是与HIV有关的死亡率都在下降[2]。
然而,在HIV常易于操作等多种实际要求。
本文通过运用微流体和微型硅晶片检测平台,然而尚没有解决办法能够同时满足低成本、便携、规处理中缺少可普及的、适当的诊断技术来指导治疗仍平台,对经过最低程度处理的含有然是数以百万计的HIV阳性患者,尤其是在发展较为落录环介导等温扩增HIV的全血样本进行了逆转后、医疗资源稀缺地区的患者,在接受标准化治疗中面测。
集成实验检测结果表明,一滴约(RT-LAMP,并利用智能手机进行了荧光检临的最大障碍。
的CD4+T淋巴细胞计数和血浆中病毒载量检测是HIV每微升全血样品中只有3个病毒依然可以通过670RT-LAMP个病毒。
该技术在数字化技术被检测到,这相当于60nL的反应液滴中仅有治疗中两个核心诊断方法。
这两个指标对每一个感染患方法上具有重要意义,扩展该技术能够实现对RT-LAMP
者治疗的启动和治疗方案的确立起到非常重要的指导作临床护理中采集指血进行病毒载量检测。
研究结果显示,病毒HIV阳性患者在用[3]。
CD4细胞数量通常使用流式细胞仪进行测定。
由于便携式流式细胞仪的开发,该技术在偏远地区得到了的成像,都可以集成为晶片实验并且可以和移动设备兼容。
载量检测过程所需的各个步骤,从血滴的准备到RT-LAMP反应越来越多的应用[4–7]。
另一方面,病毒载量检测平台在发展中国家的普及程度远远落后于CD4细胞计数技术。
传统的病毒载量仪器基于逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR、智能手机,即时检测
关键词:
人类免疫缺陷病毒(HIV,病毒载量,环介导等温扩增,依赖核酸序列的扩增(NASBA或分支DNA(bDNA杂交技术。
虽然这些技术能够检测出浓度小于每毫升十个病1 引言
毒RNA副本的血浆样品,但是这些仪器的使用要求在实验室的条件下,并且要经过大量的样品处理和复杂、精密的加工过程[6,8–10]。
在全球范围内,人类免疫缺陷病毒(HIV的受感染
环介导等温扩增(LAMP技术是一种有希望解决上述
1
DepartmentofBioengineering,TheUniversityofIllinoisatUrbana-Champaign,Urbana,IL61801,USA;2atUrbana-Champaign,Urbana,IL61801,USA;3MicroandNanotechnologyLaboratory,TheUniversityofIllinois
*DepartmentofElectricalandComputerEngineering,TheUniversityofIllinoisatUrbana-Champaign,Urbana,IL61801,USAReceived27July2015;receivedinrevisedform26August2015;accepted8September2015
Correspondenceauthor.E-mail:
rbashir@illinois.edu
©TheAuthor(s2015.PublishedbyEngineeringSciencesPress.ThisisanopenaccessarticleundertheCCBYlicense(http:
creativecommons.org/license/by/4.0/英文原文:
引用本文:
Engineering2015,1(3:
324–335
TranscriptionLoop-MediatedIsothermalAmplification(RTGregoryL.Damhorst,CarlosDuarte-Guevara,WeiliChen,TanmayGhonge,BrianT.Cunningham,RashidBashir.Smartphone-ImagedHIV-1Reverse--LAMPonaChipfromWholeBlood.Engineering,DOI10.15302/J-ENG-2015072
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MedicalInstrumentation—Article
问题的方法[11]。
LAMP作为一种用于核酸检测的聚合酶链式反应(PCR的替代技术出现在21世纪早期[12]。
与PCR技术相比,LAMP技术在即时检测上具有很大的吸引力和较大的发展空间。
这是由于LAMP并不需要温度循环(而是等温在60~65°C,并且与PCR相比,LAMP不易受到扩增抑制物影响。
在LAMP的初级概念被提出之后,很快就有研究者提出了利用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP进行HIV检测的想法[13,14]。
自那以后也有一些报告提出了不同的检测方式,其中包括即时检测的临床应用[15–21]。
这些报告涉及的基于LAMP技术的新HIV检测方法包括一个用来检验提纯后DNA的电池供电的手持微流体系统[20],一个用于数字化LAMP检测的SlipClip装置[21],以及一个无需电力的加热装置,该装置可用来促进经最低程度处理的全血的RT-LAMP定性检测[17,18]。
然而迄今为止,还没有人提出基于一滴全血的、能够与全自动可便携设备兼容的RT-LAMP定量检测方法。
传统上,人们认为核酸扩增需要完全纯化的目标RNA或DNA以适应扩增反应。
然而LAMP的稳健性转变了人们的这一思路。
Curtis等通过使用无需电力的加热装置,利用LAMP技术对仅经过细胞裂解缓冲液处理的全血样品进行了HIV定性检测[17]。
笔者利用RT-LAMP技术对经最低程度处理的裂解的全血样品进行了HIV病毒载量的定量测量。
结果显示,在约60nL的反应滴液中,仅含的3个病毒颗粒被检测出。
笔者利用RT-LAMP检测了一滴全血的HIV病毒载量。
本文数据表明,这个方法有潜力发展成为一个不需人工处理的全自动化的移动设备。
首先,笔者比较和对比了在标准实验室热循环仪中的两种RT-LAMP反应的表现,一种利用的是在水中纯化的病毒RNA,另一种利用的是只经过细胞裂解缓冲液处理的全血中的完整病毒颗粒。
接下来,笔者采用一个简单的微流体混合装置来证明全血裂解过程可以在一个晶片上完成且不会造成分析物损失或干扰检测。
然后,笔者将样品移动到一个微晶片的平台,同样对纯化的病毒RNA和经细胞裂解液处理的全血中的病毒RNA进行RT-LAMP反应检测,并且比较和对比了标准荧光显微镜和一个未经过硬件改造的智能手机对图像采集和处理的效果。
为了证明该检测方法的稳定性,笔者还对存在丙型肝炎病毒(HCV的病毒RNA和乙型肝炎病毒(HBV的病毒DNA时的HIV进行了检测。
之后,笔者结合微流体裂解方法、微晶片反应平台和智能手机成像来证明该检测平台具有利用一滴血定量检测
HIV载量的能力。
最后,讨论了该技术的优点和缺点,以及该技术满足即时病毒载量检测这个需求的潜力。
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2 材料和方法
2.1 样本
全血。
从HIV阴性供体体内用注射器抽取全静脉血样,并转移至4mL的BDVacutainerK2EDTA收集管中。
收集管在用于实验前被置于样品架上,保存于室温。
病毒。
实验所用病毒菌株为从AdvancedBiotechnol-ogies公司购买的在H9人体T淋巴细胞系中传播的HIV-1IIIB菌株。
病毒母液浓度为6.7×1010vp·mL–1(vp是病毒粒子的简称,以纯化的形式储存在含有10mmol·L–1三羟甲基氨基甲烷、150mmol·L–1氯化钠和1mmol·L–1乙二胺四乙酸(EDTA的缓冲液中,缓冲液的pH为7.5。
实验所使用的病毒为病毒颗粒形式,被等分悬液所稀释。
稀释液为自主配置的缓冲液或是由Fisher科技提供的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS。
病毒核酸。
合成的HBVDNA(ATCC®VR-3232SD™和合成的HCVRNA(ATCC®VR-3233SD™均购自AmericanTypeCulturalCollection(ATCC。
HIV-1RNA通过使用LifeTechnologies提供的PureLink®病毒RNA/DNAMini试剂盒提纯自HIV-1IIIB全病毒颗粒。
为了使用热循环仪刻画有纯化的RNA参与的RT-LAMP反应的特性,笔者采用两种方法稀释HIV-1RNA。
方法一,全病毒颗粒被PBS稀释,每份稀释液分别通过PureLink®试剂盒进行纯化。
方法二,将10μL浓度为6.7×1010vp·mL–1的试剂
加入到190μL的PBS中以满足试剂盒的使用要求,然后在150μL无核糖核酸酶活性的水中进行纯化和洗脱,获
得最终浓度为4.47×109vp·mL–1(或者为每毫升含8.93×109个RNA副本的试剂。
在使用之前,此纯化的RNA被
分成等份并储存在–80°C的环境中。
微晶片RT-LAMP实验采用纯化的病毒RNA进行,而集成实验例外。
实验采用水中纯化的RNA是因为纯化
的RNA是逆转录核酸扩增分析的标准分析物,并且在实验中可以作为参照与裂解的全血样品进行比较。
全病毒颗粒是全血中的理想分析物,然而在技术开发阶段考虑到生物安全性等原因,最初的微晶片实验是以全血中浸入病毒RNA为样本实现的。
考虑到需要与生物安全措施兼容,在热循环仪中(并不在微晶片上进行的以全血为样本的最初“宏观”扩增实验确实包括了全病毒颗粒。
为了实现最终的、完整的集成晶片实验,笔者将一个装置嵌入
生物安全柜中来实现利用全病毒颗粒进行微晶片实验。
血细胞裂解。
笔者采用的全血裂解缓冲液是根据Curtis等的工作配置而成的[17],包含2.5mmol·L–1的KHCO3、
37.5mmol·L–1的NH4Cl和0.025mmol·L–1的EDTA。
所
有的细胞溶血实验都是以1:
4的比例将血液与裂解缓冲液
混合。
在初步实验中,用手动移液器分别计量血液和裂解缓冲液并混合,然而最终的集成实验和初步微流体混合实验采用微流体通道内的晶片上裂解。
微流体的混合是利用两个注射泵将不同的成分以1:
4的体积比进行混合。
2.2 RT-LAMP
反应组分。
RT-LAMP分析方法采纳Curtis等的研究成
果[17]。
反应缓冲液浓度为1×等温扩充缓冲液,1.4mmol·L–1的脱氧核苷三磷酸腺苷(dNTP,来自新英格兰生物实验室(NewEnglandBiolabs的10mmol·L–1的MgSO4,以及来自Sigma-Aldrich的0.4mol·L–1的三甲基甘氨酸。
在某些情况下,若有所提及,三甲基甘氨酸的浓度应为0.8mol·L–1。
在实验期间,事先以适当的比例配制大量上述反应缓冲液并将其储存在–20°C的环境下。
酶和染色DNA分别加入到缓冲液中混合以保证每一次实验都备有完全混合好的新鲜试剂。
RT-LAMP反应所用的酶是新英格兰生物实验室提供的0.64U·μL–1的Bst2.0DNA聚合酶和0.08U·μL–1的AMV逆转录酶。
Biotium公司提供的1×EvaGreen和一条经染色处理的双链DNA(dsDNA被应用于检测反应产物的反应中。
引物。
基于Curtis等研究的六个LAMP引物[17]包括:
0.2μmol·L–1的F3引物(5′-AGTTCCCTTAGATAAAGACTT-3′和B3引物(5′-CCTACATACAAATCATCCATGT-3′,1.6μmol·L–1的正向内引物(FIP(5′-GTGGAAGCACATTGTACTGATATCTTTTTGGAAGTATACTGCAT-TTACCAT-3′和背向内引物(BIP(5′-GGAAAGGATCACCAGCAATATTCCTCTGGATTTTGTTTTCTAAAAGGC-3′,和0.8μmol·L–1的正向环引物(5′-GGTGTCTCATTGTTTATACTA-3′和反向环引物(5′-GCATGACA-AAAATCTTAGA-3′。
对照实验。
所有扩增实验,无论是在热循环仪上还是在微晶片上,都包括按照被检测的阳性样本的特性而设计的阴性对照。
阴性对照是由不含RNA的水或者不含病毒RNA的经裂解的血液组成。
阴性对照样本在反应时间内的扩增被认为是污染检测的指标。
尽管每一个实验中都包含了阴性对照,但是阴性对照的荧光变化曲线没有在本文呈现。
反应平台。
在本研究中,RT-LAMP反应在研究的不同阶段是在两个不同的平台上进行的。
为了比较和对比水中纯化的RNA和裂解全血细胞中的病毒颗粒,利用Ep-pendorfMastercycler®公司提供的eprealplexReal-TimePCR系统,在0.2mL容量的反应管中进行标准的25μL反应。
为了减少由微晶片系统带来的可能的噪音,热循环仪也被应用在微流体混合模式的RT-LAMP反应中。
MedicalInstrumentation—Article
为了发展微晶片扩增技术,笔者做了若干微晶片实验。
实验起始于水中RNA和被RNA侵蚀的裂解全血(上文已经解释了前期实验采用RNA的生物安全性的原因。
每一滴在微晶片上反应的单独的悬液约为60nL,整个晶片被放置在一个铜碗上,如下所述,并在INSTECSTC200加热平台上加热。
为了采用标准的成像方法,由尼康EclipseFN1荧光显微镜进行最初成像。
之后,笔者使用的是三星GalaxyNote4智能手机。
为了比较智能手机和标准化实验成像设备在成像能力上的差别,笔者分别使用了荧光显微镜和智能手机观察反应。
反应最初在60°C的商业热循环仪中进行,之后在65°C的晶片上进行。
每隔60s用热循环仪和荧光显微镜进行一次荧光检测,在智能手机平台上检测的频率增加到每30s一次。
本文展示了显微镜下水中纯化的RNA在微晶片上反应的图像和用智能手机观察的RNA在裂解全血中的成像。
补充材料中提供了中间实验的结果(即显微镜下嵌入了RNA的裂解全血细胞在微晶片上反应的图像。
2.3 微流体溶解模块
制造。
微流体溶解模块创建的基础为先前已经报道过的设计[22]。
聚二甲基硅氧烷(PDMS玻璃微流通道是利用标准化光刻技术从一个SU-8母模制造而来的。
未被硫化的PDMS被倒在SU-8母模上,经过干燥器脱气,在60°C的热板上被硫化。
在利用DienerPICO等离子体系统对PDMS和玻璃载玻片进行溶剂脱脂和等离子氧气表面激活之前,需要先用1.5mm的活检钻孔机在PDMS中打孔以用于管道连接。
经表面活化后,PDMS和玻璃的活化表面相互接触并在60~70°C的热平台上加热,从而在PDMS和玻璃之间形成共价键。
流体装置。
包含全HIV颗粒的微流体溶解实验是在一个流体装置中完成的。
该流体装置是由注射器泵和高效液相色谱(HPLC阀门组成的,整个装置搭建在一个生物安全柜中,通过与PDMS微流体晶片表面接触进行反应。
整个过程依照二级以上生物安全防护水平方案进行。
2.4 晶片上的晶片制造。
微RT-LAMP
晶片RT-LAMP实验采用微加工硅基板[23]。
简单地说,硅晶片被加热氧化后能够形成厚约150nm的氧化硅层。
然后,该氧化物通过光刻法和氢氟酸蚀刻等处理后暴露出下层的硅。
之后,将晶片置于加热的四甲基氢氧化铵(TMAH中浸泡18h,以各向异性地蚀刻硅,从而形成能够用作反应井的倒正方棱锥。
倒正方棱锥的大概尺寸可参见本文的补充材料。
晶片准备。
所有应用于RT-LAMP微晶片实验的晶片Volume1·Issue3·September2015Engineering
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MedicalInstrumentation—Article
都按下述方式准备:
首先,将微晶片用1:
3的30%过氧化来为微晶片基底上的RT-LAMP反应拍照。
智能手机的硬氢和硫酸的溶液清洗10min,再用去离子水漂洗;之后,件在原厂的基础上没有任何改动。
为了分隔荧光团发射
每个晶片再用丙酮、甲醇和异丙醇脱脂,并吹入氮气使其干燥;为了产生疏水性表面以促进悬液的稳定性,利用Sigmacote®提供的Sigma-Aldrich对晶片表面进行反复移液、漂洗;最后,用异丙醇对晶片进行简单漂洗,吹入氮气使其干燥,并放置在铜碗中。
显微注射。
笔者使用NarishigeIM-300微量注射器与EppendorfVacuTip显微注射毛细管(内径为15μm,外径为100μm放置引物和反应悬液。
使用一个20ms的喷射脉冲,产生约60nL的液滴悬液。
在晶片清理和准备后开始显微注射,过程如下:
用水将LAMPDNA引物和Tris-EDTA(TE缓冲液稀释至最终的反应浓度;利用显微注射系统和来自WorldPrecisionSystems的三维显微操纵器(MCL-D331将液滴悬液注射到微晶片序列的全部36个井中。
该过程是在通过LeicaMZFLIII显微镜进行观察下完成的。
含有引物的滴液被完全干燥,在反应井中留下脱水的DNALAMP引物。
通过目视确认所有滴液都已被脱水后,将晶片浸入重矿物油(Fisher中并放置在干燥器中以除去气泡。
矿物油的主要功能是防止反应液滴在65°C的加热过程中被蒸发。
在脱气期间,将缺乏引物的RT-LAMP反应准备好并转移到微量注射毛细管中。
然后,将反应液滴放置在每一个反应井中使其轻轻地与反应井底部接触,在每个反应井的底部注入约60nL的液滴,然后将毛细管提出油外。
包含所有36个浸没在油中的液滴的晶片被装在铜碗中,然后转移到加热平台和成像装置中(荧光显微镜或智能手机装置。
集成实验中引物的点样和反应滴液的放置采用同样的方式,但是需要在安装有能够向个人计算机(PC提供实时视频反馈摄像头的莱卡EZ4D显微镜下进行,并且该显微镜要放置在生物安全柜中。
2.5 荧光显微镜
荧光显微镜成像通过一个具有2倍物镜的尼康Eclipse
FN1荧光显微镜和一个尼康96311B-2E/CFITC荧光滤光片完成。
笔者使用NIS元素软件来捕捉水中纯化RNA参与的RT-LAMP反应的荧光影像,影像生成需要6.3倍的显微镜和1s的曝光时间。
对显微成像的嵌入了病毒RNA的裂解全血进行的额外测量(显示在补充材料中需要8倍的
显微镜和2s的曝光时间,以弥补整体荧光强度的下降。
2.6 智能手机成像
设备。
笔者购置了一部三星GalaxyNote4智能手机用314
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波长,在相机和晶片间设置了一个Thorlabs530nm高通彩色玻璃滤镜。
笔者设计了由3D打印制作的支架(图1来水平放置智能手机,使照相机位于微晶片的正上方。
笔者还3D打印了逐渐增大的圆柱筒来安置光电二极管高输出蓝色LED光源和Thorlabs可过滤500nm波长的低通滤镜,这个装置安置在上述支架上,并以一定角度给微晶片提供光源。
LED由AgilentE364xADC电源提供的3V电能来供电,该电源配有由MATLAB脚本控制的自动开关功能。
虽然蓝色LED可以用标准的3V锂电池提供电能,但是为了能够进行电脑控制,因此选用DC电源。
图1cm(c荧光显微镜设备里微晶片和加热台的原理示意图,包括:
(i加热台,1.RT-LAMP(ii含矿物油的铜质基底,(iii荧光显微镜物镜。
(d智能手机硅晶片基底的图像。
(b扫描电镜下基底和智能手机设备。
(a置于三星智能手机上160μm深的反应井横截面。
1cm×
备的扩展图,包括:
(iLED(d-插图和智能手机相机前的波长滤镜,(iv蓝色生物安全柜里组装的设备的图像。
加热台,(ii含矿物油的铜质基底,(iiiLED光源,(v智能手机。
LAMP置于设软件。
出于生物安全性考虑,在集成实验过程中,整个智能手机拍摄设备都置于生物安全柜中。
基于这个原因,通过遥控进行拍照是必需的。
因此,笔者从GooglePlay下载了安卓应用IPWebcam[24]软件并安装到智能手机上。
这个应用软件能通过网络实时传送图像,并且
被传送的图像可通过网页浏览器实时查看。
浏览器的界面允许研究人员控制智能手机相机的焦点、曝光度和增益。
笔者通过网页浏览器按以下数值设定了拍照参数,
并以此来进行RT-LAMP反应的拍摄:
放大倍率为8,串流品质为99%,曝光补偿为4,以及10倍增益和曝光度为10的夜间模式。
笔者编写了MATLAB脚本来自动控制图像捕捉过程。
脚本与加热阶段的激活同时启动。
MATLAB脚本按以下顺序拍摄反应影像:
打开蓝色LED,延迟3s;通过IPWebcam网页浏览器界面获取图像,延迟2s;最后关闭蓝色LED。
当拍摄每个反应时,每30s重复一次该过程。
2.7 数据分析
图像分析。
由荧光显微镜或智能手机拍摄设备拍摄的图片被分别保存为TIFF(显微镜或JPEG(智能手机格式,并且分析了拍摄时的荧光强度。
在这个分析中,每个微滴在MATLAB脚本里的物理位置是人工确定的:
通过在MATLAB图片中导入并显示影像,调整方盒的位置以勾勒出微滴的位置。
灰度TIFF图像以16bit无符号整数(范围为0~65535矩阵的形式导入,代表图像中的每个像素。
灰度JPEG图像以8bit无符号整数(范围为0~255阵列的形式导入,代表图像中的每个像素。
在人工确认微滴位置以后,MATLAB脚本通过获取所有由方盒轮廓勾勒出的各微滴的平均像素值来分析各微滴。
绝对值是整数值(8bit或16bit范围的函数,同时也是曝光时间、相机增益、实验室灯光亮度和其他因素的函数。
因此,需要根据每次测量设立基准,具体描述如下。
本文中的荧光强度的量