浙大生物化学课件15：DNA的生物合成.pptx

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生物化学浙江大学浙江大学生命科学学院生命科学学院江江辉辉第十五章DNA的生物合成第一节第一节半保留复制半保留复制第二节第二节DNA复制的酶学复制的酶学第三节第三节DNA生物合成过程生物合成过程第四节第四节DNA的损伤修复的损伤修复第五节第五节逆转录现象和逆转录酶逆转录现象和逆转录酶有关有关DNA的两个问题的两个问题n为为什什么么大大肠肠杆杆菌菌20分分钟钟就就可可以以繁繁殖殖一一代代，而而生生长最快的动物小母家鼠生长长最快的动物小母家鼠生长40天才成熟？

天才成熟？

n为什么可通过为什么可通过DNA测序进行亲子鉴定？

测序进行亲子鉴定？

中心法则中心法则基基因因：

是是为为生生物物活活性性产产物物编编码码的的DNA功功能能片片段段，这些产物主要是这些产物主要是蛋白质蛋白质或是各种或是各种RNA。

DNA的生物合成（复制）的生物合成（复制）复制的要点复制的要点n半保留复制半保留复制n有起始点、终止点和方向有起始点、终止点和方向n半不连续复制半不连续复制第一节半保留复制n当当细细胞胞分分裂裂，DNA进进行行复复制制时时，双双螺螺旋旋结结构构解解开开而而成成为为单单链链，用用于于合合成成新新的的互互补补链链。

子子代代细细胞胞出出现现新新的的DNA双双链链，其其中中一一股股单单链链是是从从亲亲代代完完整整地地接接受受过过来来的的旧旧链链；另另一一股股单单链链是是完完全全重重新合成的新合成的新链新链，且按碱基配对原则与旧链互补。

，且按碱基配对原则与旧链互补。

1、Watson和和Crick的半保留复制模型的半保留复制模型nDNA双双螺螺旋旋的的两两条条链链碱碱基基通通过过A-T、G-C之之间间的的氢氢键键联联结结，并并且且两两条条链链互互补补。

因因此此，Watson和和Crick提出提出DNA的半保留复制模型。

的半保留复制模型。

n双双螺螺旋旋揭揭开开，每每条条链链作作为为模模板板，以以四四种种脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸（dNTP）为为底底物物，在在依依赖赖于于DNA的的DNA聚聚合合酶酶催催化化下下，按按照照A-T、G-C配配对对方方式式，合合成成与与两两条条模模板板链链脱脱氧氧核核苷苷酸酸对对应应的的两两条条新新链链，然然后后以以一一新新一一旧旧脱脱氧氧多多核核苷苷酸酸组组成成的的双双链链分分别别进进入入子子细胞。

细胞。

2、模型的试验证明、模型的试验证明1958年年Meselson和和Stahl用用密密度度梯梯度度离离心心法法结结合合同同位位素素标标记记法进行证明试验：

法进行证明试验：

n1）将将大大肠肠杆杆菌菌在在含含标标记记的的15NH4Cl的的培培养养基基内内，繁繁殖殖12代，保证代，保证DNA上的上的N都是都是15N；n2）将将上上述述培培养养好好的的细细菌菌转转入入到到含含14NH4Cl的的培培养养基基中中继继续续培培养养，并并在在细细菌菌刚刚转转入入14NH4Cl中中（0代代）以以及及在在此此培培养基中分裂养基中分裂1、2、3、4代时分别取样分析；代时分别取样分析；n3）DNA用用密密度度梯梯度度平平衡衡离离心心法法进进行行高高速速长长时时间间离离心心，由由于于15N-DNA的的比比重重大大于于14N-DNA，在在氯氯化化铯铯溶溶液液中中离离心心时分别处在不同密度的层次中（重在下，轻在上）。

时分别处在不同密度的层次中（重在下，轻在上）。

DNA半保留复制的半保留复制的实验证据实验证据n0代代：

两两条条单单链链全全为为重重的的（处处于于下层）；下层）；n1代代：

全全部部为为一一轻轻一一重重的的杂杂合合分分子（处于上层和下层之间）；子（处于上层和下层之间）；n2代代：

一一种种是是15N-14N，与与第第1代代的的一一样样；另另一一种种是是全全部部轻轻的的14N-14N。

两者比为两者比为11；n3代代：

仍仍有有两两种种分分子子，但但14N-14N增多，两者比为增多，两者比为13；n4代：

两者比为代：

两者比为17。

3、半保留复制意义、半保留复制意义nDNA在代谢上的稳定保证了遗传信息的稳定性。

在代谢上的稳定保证了遗传信息的稳定性。

第二节DNA复制的酶学n底物：

底物：

dNTP（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）n聚聚合合酶酶：

DNA依依赖赖的的DNA聚聚合合酶酶（DNA-polymerase）n模板：

模板：

单链的单链的DNA母链母链n引物：

引物：

寡核苷酸引物（寡核苷酸引物（RNA）n其其他他酶酶和和蛋蛋白白质质因因子子：

拓拓扑扑异异构构酶酶、解解螺螺旋旋酶酶、单链结合蛋白、单链结合蛋白、DNA连接酶连接酶DNA聚合酶的活性聚合酶的活性n5至至3的聚合活性的聚合活性n53方向方向n核酸外切酶活性核酸外切酶活性n53外切酶活性外切酶活性n35外切酶活性外切酶活性一、复制的化学反应一、复制的化学反应n5至至3的聚合活性（的聚合活性（53）n核酸外切酶活性核酸外切酶活性n35外切酶活性外切酶活性n53外切酶活性外切酶活性聚合反应聚合反应在在DNA聚聚合合酶酶催催化化下下，四四种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷三三磷磷酸酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）被被加加到到DNA链链的的3末端，同时释放出无机焦磷酸。

末端，同时释放出无机焦磷酸。

n1、DNA链链的的游游离离3-羟羟基基对对进进入入的的dNTP磷磷原原子子发发生生亲亲核攻击，形成核攻击，形成3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。

，并脱下焦磷酸。

n2、形形成成磷磷酸酸二二酯酯键键的的能能量量来来自自-与与-磷磷酸酸基基之之间间高高能能键的裂解。

键的裂解。

n3、聚聚合合反反应应可可逆逆，但但随随焦焦磷磷酸酸的的水水解解可可推推动动反反应应的的完完成。

成。

n4、DNA链由链由5向向3方向延长。

方向延长。

n5、需要有游离的、需要有游离的3-羟基，即需要羟基，即需要引物链引物链。

DNA聚合反应特点聚合反应特点DNA聚合酶聚合酶模板链模板链合成的新链合成的新链模板链模板链二、二、DNA聚合酶聚合酶1、原核生物：

、原核生物：

DNA聚合酶聚合酶I（polI）：

）：

与校对、修复有关与校对、修复有关nA、DNA聚聚合合酶酶活活力力：

通通过过核核苷苷酸酸聚聚合合反反应应使使DNA链链沿沿53方向延长；方向延长；nB、35核核酸酸外外切切酶酶活活力力：

由由3端端水水解解DNA链链。

在在正正常常情情况况下下该该活活力力受受抑抑制制，一一旦旦出出现现错错配配碱碱基基时时，聚聚合合反应停止，该活力会切去错配碱基，起校对作用；反应停止，该活力会切去错配碱基，起校对作用；nC、53核核酸酸外外切切酶酶活活力力：

由由5端端水水解解DNA链链。

切切除除嘧啶二聚体和嘧啶二聚体和RNA引物。

引物。

polI切切除除冈冈崎崎片片段段5端端RNA引物引物n53核酸外切酶活力核酸外切酶活力nDNA聚合酶活力聚合酶活力polI的结构的结构单单链链多多肽肽，用用枯枯草草杆杆菌菌蛋蛋白白酶酶进进行行有有限限水水解解，可可得得两两个个大小不同的片段。

大小不同的片段。

n小片段：

小片段：

53核酸外切酶活性；核酸外切酶活性；n大大片片段段（Klenow片片段段）：

聚聚合合活活性性、35外外切切活性活性（常用工具酶）（常用工具酶）DNA聚合酶聚合酶II（polII）：

）：

可能在可能在DNA修复中起作用修复中起作用n以以带带有有缺缺口口的的双双链链DNA为为模模板板和和引引物物，从从53方方向合成向合成DNA，同时具有，同时具有35外切酶活力外切酶活力。

n多亚基聚合酶多亚基聚合酶n含有含有DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35核酸外切酶活性核酸外切酶活性n不具有不具有53核酸外切酶活性核酸外切酶活性n反应需要反应需要NH4+激活激活n是一种主要起修复作用的酶。

是一种主要起修复作用的酶。

DNA聚合酶聚合酶III（polIII）：

）：

真正起复制作用的酶真正起复制作用的酶n由由10种亚基组成的不对称二聚体，种亚基组成的不对称二聚体，、组成核心酶。

组成核心酶。

n活性：

聚合活性、活性：

聚合活性、35外切活性。

外切活性。

n+polIII（核心酶）（核心酶）npolIII+polIIInpolIII+polIII*（全酶）（全酶）n具具有有聚聚合合酶酶活活力力，具具有有校校对对功功能能，是是组组建建核核心心酶酶因因子子，是是二二聚聚化化因因子子，和和是是延延长长因因子子，识识别别引引物物并并引导聚合酶结合，复制起始时被释放。

引导聚合酶结合，复制起始时被释放。

npolIII只只作作用用于于有有缺缺口口的的双双链链DNA，polIII可可作作用用于于有引物的长单链有引物的长单链DNA，polIII*是天然的聚合酶。

是天然的聚合酶。

polIII的的结构结构催化催化亚基亚基35核酸核酸外切酶活外切酶活性性polIII-DNA结合示意图结合示意图大肠杆菌三种大肠杆菌三种DNA聚合酶的比较聚合酶的比较DNA聚合酶聚合酶IDNA聚合酶聚合酶IIDNA聚合酶聚合酶III结构基因结构基因polApolBpolC,holE,dnaN,dnaX,dnaZ,dnaQ,holA亚基数目亚基数目1710分子量分子量103,00088,000830,00053聚合作用聚合作用+35外切酶外切酶+53外切酶外切酶+-聚合速度（核苷聚合速度（核苷酸酸/min）1,0002,40015,000持续合成能力持续合成能力32001,500500,000功能功能切除引物，修复切除引物，修复修复修复复制复制2、真核生物、真核生物nDNA聚聚合合酶酶：

与与随随从从链链的的合合成成有有关关。

需需要要以以缺缺口口双双链链或或带带引引物物的的单单链链DNA为为模模板板，引引物物是是DNA或或RNA短短链，链，RNA引物由引物合成酶合成引物由引物合成酶合成nDNA聚合酶聚合酶：

核酸外切酶活性，核酸外切酶活性，与修复有关与修复有关nDNA聚聚合合酶酶：

存存在在于于线线粒粒体体。

以以RNA为为模模板板，以以DNA短链为引物短链为引物nDNA聚聚合合酶酶：

与与领领头头链链的的合合成成有有关关。

具具有有35外外切切酶活力酶活力nDNA聚合酶聚合酶：

与校读、修复和填补缺口有关与校读、修复和填补缺口有关3、复制的保真性、复制的保真性n核酸外切酶活性和即时校读核酸外切酶活性和即时校读npolI，polII，polIII的的亚基的亚基的35外切酶活性外切酶活性n复制的保真性和碱基选择复制的保真性和碱基选择n先形成氢键，再生成磷酸二酯键先形成氢键，再生成磷酸二酯键n依赖三种机理依赖三种机理n遵守严格的碱基互补配对规律遵守严格的碱基互补配对规律n聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能n复制中出错时有即时校读功能复制中出错时有即时校读功能三、三、DNA拓扑学变化中的酶拓扑学变化中的酶1、DNA拓扑异构酶拓扑异构酶n类类型型I拓拓扑扑异异构构酶酶：

催催化化DNA双双链链中中的的一一条条链链的的断断裂裂和和再连接，反应无需能量；再连接，反应无需能量；n类类型型II拓拓扑扑异异构构酶酶：

催催化化DNA双双链链的的断断裂裂和和再再连连接接，反反应需消耗应需消耗ATP；n原原核核生生物物中中拓拓扑扑异异构构酶酶只只能能消消除除负负超超螺螺旋旋，真真核核生生物物中中能消除正、负超螺旋。

能消除正、负超螺旋。

2、解螺旋酶、解螺旋酶n领头链：

领头链：

rep蛋白蛋白沿模板链的沿模板链的35移动移动n随从链随从链：

解解螺旋螺旋酶酶、DnaB沿模板链的沿模板链的53移动移动3、单链、单链DNA结合蛋白（结合蛋白（SSB）n维持模板处于单链状态维持模板处于单链状态n保护单链的完整保护单链的完整四、引物酶和引发体四、引物酶和引发体n引物酶：

引物酶：

RNA聚合酶聚合酶（DnaG）n引引发发体体：

DnaA辨辨认认复复制制启启始始点点，再再结结合合DnaB、DnaC及其他复制因子形成复合体及其他复制因子形成复合体、rep蛋白五、五、DNA连接酶（连接酶（ligase）n催化两段催化两段DNA