蛋白质.ppt

蛋白质.ppt

《蛋白质.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质.ppt（44页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

第三章第三章蛋白质蛋白质Proteins生物化学一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质的分子大小与形状二、蛋白质的分子大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质分离纯的一般原则四、蛋白质分离纯的一般原则五、蛋白质混合物的分离方法五、蛋白质混合物的分离方法六、蛋白质含量的测定与纯度鉴定六、蛋白质含量的测定与纯度鉴定第六节蛋白质的分离纯化p290v蛋白质与氨基酸相似，也具有蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离两性电离的性质。

蛋白的性质。

蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。

它的氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。

它的两性电离比氨基酸复杂两性电离比氨基酸复杂。

v对某一蛋白质而言，在某一对某一蛋白质而言，在某一pHpH下，当它所带正负电荷下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的相等的时候，该溶液的pHpH就称为该就称为该蛋白质的等电点蛋白质的等电点。

v蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。

蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。

一、蛋白质的两性电离和等电点蛋白质溶液有许多高分子溶液的性质，蛋白质溶液有许多高分子溶液的性质，如：

如：

扩散慢、易沉降、扩散慢、易沉降、粘度大、不能透过半粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体，具透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体，具有丁达尔现象。

有丁达尔现象。

蛋白质胶体溶液的稳定因素：

蛋白质胶体溶液的稳定因素：

水化膜、水化膜、带电荷。

当破坏这两个因素时，蛋白质中带电荷。

当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。

从溶液中析出而产生沉淀。

二、蛋白质的高分子性质使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有：

使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有：

1.盐析：

盐析：

在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为从溶液中析出，称为蛋白质的盐析蛋白质的盐析。

而低浓度的盐。

而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为加，该现象称为盐溶盐溶。

盐析的机理：

盐析的机理：

破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。

电荷。

盐析法是最常用的盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法蛋白质沉淀方法，该方法不会使，该方法不会使蛋白质产生变性。

蛋白质产生变性。

三、蛋白质的沉淀作用2.2.有机溶剂沉淀法：

有机溶剂沉淀法：

在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。

有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。

有机溶剂沉淀法的有机溶剂沉淀法的机理机理：

破坏蛋白质的水化膜。

：

破坏蛋白质的水化膜。

有机溶液沉淀蛋白质通常在有机溶液沉淀蛋白质通常在低温低温条件下进行，否则有机条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。

溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。

3.3.重金属盐沉淀重金属盐沉淀（条件：

（条件：

pHpH稍大于稍大于pIpI为宜）：

在蛋白质溶为宜）：

在蛋白质溶液中加入重金属盐溶液，会使蛋白质沉淀。

液中加入重金属盐溶液，会使蛋白质沉淀。

重金属沉淀法的重金属沉淀法的机理机理：

重金属盐加入之后，与：

重金属盐加入之后，与带负电的带负电的羧基结合羧基结合。

重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。

吸收后造成对机体的损害。

三、蛋白质的沉淀作用4.4.生物碱试剂沉淀法生物碱试剂沉淀法（条件：

（条件：

pHpH稍小于稍小于pIpI）v生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。

能够沉淀生物碱的试剂称为性物质。

能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂生物碱试剂。

生物。

生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。

酸等。

v生物碱试剂沉淀蛋白质的生物碱试剂沉淀蛋白质的机理机理：

在酸性条件下，蛋白质：

在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。

结合而产生沉淀。

v“柿石症柿石症”的产生的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的为不能被消化的“柿石柿石”。

5.5.弱酸或弱碱沉淀法弱酸或弱碱沉淀法：

用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的：

用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pHpH处处于等电点处，使蛋白质沉淀。

于等电点处，使蛋白质沉淀。

弱酸或弱碱沉淀法弱酸或弱碱沉淀法机理机理：

破坏蛋白质表面净电荷。

：

破坏蛋白质表面净电荷。

1.1.蛋白质变性的概念：

蛋白质变性的概念：

天然蛋白质受物理或化学因素的天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。

性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。

2.2.使蛋白质变性的因素使蛋白质变性的因素11）物理因素：

高温、高压、射线等）物理因素：

高温、高压、射线等22）化学因素：

强酸、强碱、重金属盐、去污剂等）化学因素：

强酸、强碱、重金属盐、去污剂等3.3.变性的本质：

变性的本质：

分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。

状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。

四、蛋白质的变性作用、结絮和凝固4.4.蛋白质变性后的表现：

蛋白质变性后的表现：

11）生物学活性消失）生物学活性消失22）理化性质改变：

溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增）理化性质改变：

溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。

加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。

五、蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应主要与其定性、定量测定有关：

蛋白质的颜色反应主要与其定性、定量测定有关：

1.1.茚三酮反应：

茚三酮反应：

2.2.双缩脲反应：

双缩脲反应：

3.3.酚试剂反应：

酚试剂反应：

六、蛋白质的紫外吸收特征蛋白质溶液能在近紫外区（蛋白质溶液能在近紫外区（280280nmnm处）有光吸收：

处）有光吸收：

色（色（TrpTrp）酪（酪（TyrTyr）苯丙（苯丙（PhePhe）。

）。

蛋白质的变性作用、结絮和凝固电电泳泳前前处处理理粗粗分分离离细细分分离离生物组织生物组织无细胞提取液无细胞提取液破碎、溶破碎、溶解、差速离心解、差速离心选择性沉淀法亲和亲和层析层析离子离子交换交换层析层析精制后的蛋白质精制后的蛋白质凝胶凝胶过滤过滤疏水疏水层析层析吸附吸附层析层析纯化的实质：

增加制品的纯度或比活性五、蛋白质的分离纯化的一般原则1、粗分级（、粗分级（roughfractionation）一般用选择性沉淀法。

一般用选择性沉淀法。

（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）分级沉淀法（盐析）等电点选择性沉淀法等电点选择性沉淀法有机溶剂分级沉淀法有机溶剂分级沉淀法热处理选择性沉淀法热处理选择性沉淀法生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法五、蛋白质的分离纯化的一般原则2、细分级（、细分级（finefractionation）透析除盐透析除盐sephdexG-25凝胶过滤除盐凝胶过滤除盐v层析法层析法：

凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、：

凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相亲和层析、疏水层析（反相HPLC）v电泳法电泳法：

自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤：

自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳泳、等电聚焦、双向电泳v密度梯度离心密度梯度离心v根据分子大小根据分子大小v根据蛋白质的溶解度根据蛋白质的溶解度v根据电荷差异根据电荷差异v选择性吸附分离（物理吸附）选择性吸附分离（物理吸附）v根据配体特性异性分离（亲和层析）根据配体特性异性分离（亲和层析）六、分离纯化蛋白质的主要方法p301测分子量的方法：

测分子量的方法：

v化学组成法测定最低分子量化学组成法测定最低分子量vSDS-PAGE法法v凝胶过滤法凝胶过滤法v渗透压法渗透压法v扩散系数法扩散系数法v沉降系数法和沉降平衡法沉降系数法和沉降平衡法

（一）、蛋白质的大小与形状1.根据分子组成测定最小分子量根据分子组成测定最小分子量p291如肌红蛋白含如肌红蛋白含0.335%的铁的铁Fe分子量分子量55.8最小最小MFe（%）=0.335=16700（实为实为16900马心马心）牛血清白蛋白含牛血清白蛋白含Trp0.58%最低最低M=35200，实际为实际为69000，含，含2个个Trp*100测分子量的方法2、葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量p297-298测分子量的方法交交联联葡葡聚聚糖糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP，），）琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶（Sepharose，Bio-GelA）柱床体积柱床体积Vt=Vo+Vi洗脱体积洗脱体积Ve=Vo+kdVi当当kd=0时时，Ve=Vo，溶质全从溶质全从Vo出来，出来，无分配。

无分配。

当当kd=1时时，Ve=Vo+Vi，溶溶质质全全进进筛筛子子，各各物物质质尽尽管管有有分分配配，但各物质不能分开。

但各物质不能分开。

当当0kd1时时，Ve=Vo+kdVi,各溶质具不同分配，得以分离各溶质具不同分配，得以分离p298交联葡聚糖（交联葡聚糖（Sephadex）3.据据pr的渗透压的渗透压p292用用一一半半透透膜膜将将pr溶溶液液与与纯纯水水隔隔开开，当当渗渗透透达达平平衡衡时时，测测定其渗透压，计算分子量：

定其渗透压，计算分子量：

C：

浓度（克浓度（克/升）升）R：

气体常数（气体常数（0.082升升/大气压大气压/克分子克分子/K开氏温度）开氏温度）T：

绝对温度（开氏温度）绝对温度（开氏温度）：

以大气压表示的渗透压：

以大气压表示的渗透压测分子量的方法半透膜阻留半透膜阻留pr分子，而分子，而让小的溶质分子和水通让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低溶液中小分子（盐、低分子酸等）。

分子酸等）。

施以一定的压力使小施以一定的压力使小分子溶质通过一半透分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋孔大小截留相应的蛋白质分子白质分子4.SDSPAGEp298（十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳）测分子量的方法极性头部非极性尾巴SDS是一种表面活性剂sodiumdodecylsulfateStryer（1995）Biochemistry（4e）p.275沉降的速度与颗粒的重量、沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。

密度和形状有关。

离心后离心后按其沉降的速度不同，彼按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。

再进行此分开形成区带。

再进行光学定位，针刺或冰冻切光学定位，针刺或冰冻切片采样分析片采样分析蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度测分子量的方法5.沉降分析法沉降分析法蔗糖浓度0.25M1.00M2.00M0.50M加液层由于颜色的显著不同，可以非常容易地识别螺旋藻