实验九、DNA的重组与鉴定.ppt

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实验九实验九DNADNA的重组与鉴定的重组与鉴定一一.实验目的实验目的通过本实验学会重组DNA的原理与方法。

基因重组基因重组：

不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。

重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段二、实验原理二、实验原理外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5磷酸和相邻的3羟基之间形成的新的共价键，如质粒载体的两条链都带有5磷酸，可生成4个新的磷酸二酯键，但如果质粒DNA已经去磷酸化，则只能行成2个新的磷酸二脂键，在这种情况下产生的杂交体分子带有2个单链切口，当杂交体分子导入感受态细胞后可被修复。

实验原理实验原理相邻的5磷酸和3羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。

重组重组DNADNA技术基本原理：

切、接、转、筛技术基本原理：

切、接、转、筛多种酶切口多种酶切口多克隆位点多克隆位点限制性内切酶限制性内切酶单一酶切口单一酶切口限制性内切酶酶切切酶切磷酸二酯键的形成DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶DNADNA连接酶连接酶目的基因与载体的连接接T4-DNA连接酶：

T4-噬菌体连接温度：

不高于粘性末端熔点温度（Tm）15：

15/6h；12/8h；8/12h；连接方式：

相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接粘端连接CCGGCCGGCCGGCCGGGGCCGGCCGGCCGGCCCGGCCGGCCGGCCGGCCGGCCGGCCGGCCGGCCCGGCCGGGGCCGGCCHapHapT4-DNAT4-DNA连接酶连接酶平端连接AGCTAGCTTCGATCGAAluAluDNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶AGCTAGCTAGCTAGCTTCGATCGATCGATCGA重组体的转化重组体的转化受体细胞转JM109感受态含氨含氨苄平板苄平板AmAm重组质粒感受态原核细胞的转化（细菌转化）1）受体细胞的选择限制缺陷型:

避免修饰和降解重组缺陷型：

避免重组整合转化亲和型：

较高的可转化性遗传互补型：

利于筛选感染缺陷型：

防止感染2）转化方法CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2处理受体细菌受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态感受态细菌细菌重组体重组体转转入细菌入细菌含氨含氨苄平板苄平板连接连接目的基因目的基因基因载体基因载体连接酶连接酶转化转化重组体克隆的筛选与鉴定筛宿主细胞宿主细胞转化后的克隆群体：

1.遗传检测法1）抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段插入片段插入片段插入片段AmpAmp平板平板平板平板TetTet平板平板平板平板22）标志补救（）标志补救（-半乳糖苷酶法）半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段片段COOHCOOH片段片段X-galLacZ蓝色化合物蓝色化合物X-gal（LacZLacZ基因基因NN端序列）端序列）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因NN端序列端序列LacZLacZ酶酶2电泳检测法凝胶电泳检测加样孔DNAMarkerDNAMarker空质粒空质粒重组质重组质粒粒重重组质粒酶切组质粒酶切重组质粒的重组质粒的PCRPCR扩增片段扩增片段原位杂交原位杂交3菌落杂交筛选法三、实验仪器三、实验仪器超净工作台超净工作台台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机恒温空气摇床恒温空气摇床恒温培养箱培养皿恒温水浴锅四、材料及试剂四、材料及试剂E.coliDH5pUC19orT载体DNA四、材料及试剂四、材料及试剂1.T4DNA连接酶210T4DNA连接酶缓冲液:

400mmol/LTris-ClpH7.5100mmol/LMgCl2100mmol/LDTT,500g/mlBSA5-10mmol/LATP试剂试剂灭菌去离子水Kac（3mol/L，pH5.2）Xgal（20mg/ml）IPTG（200mg/ml）五、实验步骤五、实验步骤1.混合以下溶液于一个无菌离心管中xlpUC19质粒（0.1-4g）2l10酶切缓冲液15U限制性内切酶（EcoRI）yl去离子水终体积为20l2.在推荐温度下育温1小时（一般为37）加入5l电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。

酶切实验步骤实验步骤1混合以下试剂PCRDNA6lpUC19酶切回收DNA1.0l5T4DNA连接酶缓冲液2.0lT4DNA连接酶（10u/l）1l10l混合液于16培养12小时连接转化及筛选转化及筛选连接子的转化及筛选同实验一。

实验结果实验结果实验报告实验报告1.简述实验目的和实验原理及材料与试剂;2.详述实验步骤；3.画出实验结果示意图并分析。