第15章 细小病毒科Parvoviridae.docx

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第15章细小病毒科Parvoviridae

第十五章细小病毒科（Parvoviridae）

一、概述

二、细小病毒科基因组的结构与功能

三、细小病毒科的基因转录

四、病毒蛋白

五、病毒复制的内在环境

六、基因表达调节

（一）细小病毒基因表达本身的调节

（二）依赖性细小病毒与辅助病毒在基因表达调节水平上的相互关系

七、细小病毒的繁殖

八、细小病毒感染的分子病理

主要参考文献

一、概述

　　由于本科病毒体积很小，多数成员的致病性不明或不引起严重疾病，不太引起人们的注意，所以发现较晚。

只有在病毒分离培养技术显著提高和电子显微镜广泛应用之后，一些病毒学家才偶然地从一些生物材料如继代细胞系培养物和动物的肿瘤组织中发现了这类病毒，从而找到了为病毒学家早已预言的最小单链DNA病毒。

研究表明，本科病毒在自然界的分布极为广泛，并与多种疾病有关，从而才开始引起病毒学者的重视。

1．分类现状

在国际病毒分类委员会第六次报告中，根据病毒的宿主不同，该科分成两个亚科，即细小病毒亚科（Parvovirinae）和浓病毒亚科（Densovirinae），前者的宿主是脊椎动物，后者的是节肢动物。

细小病毒亚科分为细小病毒属（Parvovirus）、红病毒属（Erythrovirus）和依赖病毒属（Dependovirus，相当于原来的腺病毒伴随病毒属）。

浓病毒亚科下设三个病毒属：

浓病毒属（Densovirus）、艾特拉病毒属（Iteravirrus）和康特拉病毒属（Contravirus）。

该亚科的成员均分离自节肢动物，有6个正式成员和13个暂定成员。

细小病毒科病毒的分类现状见表15-1。

表15-1.细小病毒科病毒的分类现状

科牙科属代表株成员

细小病毒科（Parvoviridae）

细小病毒亚科（Parvovirinae）

细小病毒属（Parvovirus）

细小病毒r—1（大白鼠病毒，Kilham）。

美国阿留申群岛水貂病病毒（Aleutianminkdiseasevirus）

牛细小病毒（Bovineparvovirus）

猫细小病毒（Felineparvovirus）

猫全白细胞减少症病毒（Felingpanleukopeniavirus,FPLV）

水貂肠炎病毒（Minkenteritisvirus,MEV）

狗细小病毒（Canineparvovirus,CPV）

鹅细小病毒（Gooseparvovurus）

鼠H1病毒

兔细小病毒（Lapineparvovirus）

LuⅢ病毒

小鼠细小病毒（Minuteofmice,MVM）

猪细小病毒（Porcineparvovirus）

RT病毒

TVX病毒

依赖性病毒属（Dependovirus）

腺病毒相关病毒1型（Adeno—associatedvirustypeI,AAV1）

AAV2型，AAV3型，AAV4型

禽AAV，牛AAV，狗AAV，马AAV，羊AAV。

红病毒属（Erythrovirus）

浓病毒亚科（Densovirinae）

浓病毒属（Densovirus）

大腊螟浓核症病毒（DensovirusofGalleriamellonella—Lepidoptera）。

Junonia,Acheta,Aedes,Bombyx,Diatraea,Nymphalidae和Sibine的浓核症病毒。

艾特拉病毒属（Iteravirrus）

康特拉病毒属（Contravirus）

细小病毒属又称“细小DNA病毒属”，是本病毒科中最主要的病毒属，我们将对其重要代表分别予以叙述。

而对其余的病毒属，则只扼要介绍如下。

　　依赖病毒属以腺联病毒（AAV）1型为代表种，另包括腺联病毒2型、3型、4型和5型以及鸡腺联病毒、牛腺联病毒、犬腺联病毒、马腺联病毒和绵羊腺联病毒。

腺联病毒是一类缺损病毒，它们的基因组不完备，必须在有辅助病毒——腺病毒与之同时存在的条件下，才能复制出有感染性的后代。

本属病毒的一个显著特点是其DNA呈互补性，也就是说，在同一种病毒中有的病毒粒子中含有正极性的DNA，有的病毒粒子中含有负极性的DNA，即含有不同极性DNA的病毒粒子同时存在。

在DNA提取过程中，不同极性的核酸分子，很容易发生退火，形成互补的双股DNA。

上述特性引起了病毒学者的注意。

AAV1、AAV2与人类有关，有的研究者发现30%的儿童含有抗AAV抗体，并常同时发现抗腺病毒的抗体。

马AAV是Dutto1975年从患呼吸道病驹分离获得的。

在比利时，很多牛含有抗牛AAV抗体。

犬AAV是从犬肝炎病毒培养物中分离出来的，很多日本犬的血清中含有抗体。

禽AAV是从鹌鹑支气管炎病毒培养物中分离来的。

腺联病毒的致病性，目前尚不清楚。

红病毒属仅有一个成员，即B19病毒（B19V）。

B19V是自主复制病毒，与AAV一样，正、负极性的DNA分子均可以作为病毒的基因组。

B19V是人的一种病源，主要引起人的皮疹、慢性溶血性贫血和孕妇流产、死胎。

其靶器官是骨髓，主要引起骨髓中的成红细胞和外周血液中的网织红细胞的消失。

浓病毒亚科病毒均能自我复制，不依靠辅助病毒。

其DNA也是互补的，在人工提取过程中能自动形成双股DNA。

细小病毒的基因组长约5000nt,在线性单链DNA（ssDNA）分子的3和5端均有发夹结构。

3端的发夹结构长115～116nt，5端的长200～242nt。

多数成员的基因组既可是负极性DNA分子，也可是正极性DNA分子，而少部分成员的基因组只是负极性的DNA分子。

基因组有2个主要的ORF：

NSORF和SORF，前者的产物为基因复制和转录所必需，后者编码衣壳蛋白。

某些病毒还有一些较小的ORF。

鼠细小病毒（MMV）的NSORF编码2种非结构蛋白NS1和NS2，而其SORF则编码3种结构蛋白VP1～3。

VP1和VP2的序列大部分相同，只是VP1的氨基端多了一部分氨基酸序列，而VP3则是由VP2在蛋白酶作用下裂解而来。

其它大部分细小病毒的结构蛋白的合成亦与此相似。

本科病毒无论从大小和形态上，都与小RNA病毒相似，它们之间的相似形态和不同的核酸类型，恰好互相对应。

本科病毒的拉丁语名称Parvoviridae中的“Parvo”系细小之意。

其共同的形态结构特征是：

无囊膜，直径约18～26nm，二十面体对称，衣壳约由32个长3～4nm的壳粒构成。

病毒粒子在氯化铯溶液中的浮密度较大，为1.39～1.42g/cm3。

立体对称的衣壳包围着一个分子的单股线状DNA。

核酸的分子量为1.5×106～2.0×106。

碱基中G＋C的含量占核酸总量的41%～53%。

本科病毒的一个突出特点是对外界因素具有强大的抵抗力，能耐受脂溶剂和较高温度的处理，而不丧失其感染性。

病毒在细胞核内增殖。

某些细小病毒需要有辅助病毒的协助才能增殖，另一些细小病毒虽能自行复制，但需依赖细胞有丝分裂过程中的某些功能。

　人们提出了许多细小病毒基因组的复制模型。

有的模型比较简单，有的则较为复杂。

但不同模型的基本点一致，即先以3端发夹结构的3—OH为引物合成基因组的互补链，形成复制型中间体（RF），再通过RF产生子代病毒的基因组。

现以AAV为例说明细小病毒的复制过程（图15-1）。

细小病毒科（Parvoviridae）是目前在细胞病毒中属于最小最简单的一类单链线状DNA病毒（Siegletal1985），无包膜，毒粒直径20~26nm，呈二十面体，大部分有3个衣壳蛋白（60~80K），后者氨基酸有重叠，较大分子量的一种在NH2端有附加氨基酸。

毒粒内含有单分子的单链DNA，分子量为1.5MD（约5Kb）。

具有感染性的毒粒为110S，而缺少DNA的毒粒为65S，在CsCl中的浮密度为1.39~1.42g/ml。

可分为三个属：

（一）细小病毒属（Parvovirus）

本属病毒毒粒内的线状单链DNA分子的5’端和3’端有发夹结构。

本属大多数成员的成熟毒粒内含有负链DNA，但其它成员，则掺有1%~50%的正链DNA。

大多数成员有血凝素，对不同红细胞有不同活性。

病毒在核内繁殖，可以独立复制，病毒的繁殖依赖于宿主细胞的某些功能，在细胞的S期繁殖良好，形成核内包含体。

该病毒的自然宿主为猫，牛，狗，鹅，水貂，浣熊，小鼠，猪，家兔，大白鼠等。

在实验感染的条件下，其宿主范围更大些。

鼠类病毒和LuⅢ在金黄地鼠中也能繁殖。

某些病毒种还可以通过胎盘传播，有报道鹅的细小病毒可经卵传代。

（二）依赖性病毒属（Dependovirus）即腺病毒伴随病毒属（Adeno—associatedvirus,AAV）

在成熟毒粒内或含有正链DNA，或含有负链DNA，来自不同毒粒的正、负单链DNA在试管内可以形成双链DNA结构。

所有的AAV均具有共同的抗原性。

它不能独立繁殖，它的繁殖依赖于辅助病毒，后者包括腺病毒和疱疹病毒。

（三）浓核症病毒属（Densonucleosisvirus,DNV）或浓病毒属（Densovirus）

细小病毒属和依赖性病毒属均为脊椎动物病毒，而浓病毒属则为非脊椎动物病毒，主要是从蝴蝶和蛾类分离到的。

早于1968年在日本Ina城郊的家蚕（Bombyxmosi）流行了一种病毒病，其病原定名为家蚕核浓缩病毒（Bombyxmoridensonucleosisvirus,BombyxDNV）。

这类病毒毒粒约22nm，含有正链或负链DNA，后者在试管内可以形成双链。

它可在幼虫、蛹、成虫的大多数组织中独立地繁殖。

受染细胞核增大。

由于毒粒的积贮形成浓的粗大的核内物质。

主要宿主是鳞翅目（Lepidoptera），可能包括双翅目（Diptera）和直翅目（Orthoptera）。

二、细小病毒科基因组的结构

AAV毒粒中，一半含有正链DNA，一半含有负链DNA；而在能独立繁殖的病毒毒粒中，所包装的正、负链DNA的比例则有较大差别：

MVM和H1的毒粒中99%为负链（反义），牛细小病毒毒粒中，75%~80%为负链，而人的B19病毒毒粒中，正负链的比例相等（Bateetal1984,Cotmoreetal1984,Siegletal1985），LuⅢ病毒仅包装负链或根据宿主细胞，正负链机率相等（Batesetal1984）。

细小病毒属和依赖性病毒属基因组最大的不同在于其末端序列的组成。

AAVDNA有一末端倒置重复序列，145bp（Lusbyetal1980），末端125bp是回文结构，但是总体的回文结构又被2个短的回文序列所中断，后者对称性地位于较大的回文结构中心的任一边。

因而末端125bp可折成T形结构（或Y形结构），后者可能作为DNA复制的引物（Bernsetal1983）。

这一结构对AAVDNA的复制是十分重要的。

至于可以独立繁殖的细小病毒，它的两个末端也呈回文结构，但是，彼此序列不同（Rhodeetal1982），在基负链（或毒粒链）的3’端的回文序列约120bp长，也大约在中央被2个小的回文结构所中断。

因此，在折叠时也形成T形（或Y形）结构，就象AAVDNA的情况一样。

而DNA链的5’端，其回文序列较长，约160~200bp，其序列与3’端的不同（图11-1，2）。

人B19病毒的末端序列是重复的（Shadeetal1986）。

图11-1.细小病毒属和依赖性病毒属DNA结构示意图（引自Fraenkel—Conratetal1988）

相应的大写和小写字母表示序列互补

图11-2.（a）大白鼠K病毒3’端的DNA序列;（b）AAV3’端的DNA序列

（引自Fraenkel—Conratetal1988）

AAV2以及一些细小病毒属的基因组的全序列已经测定（Lusbyetal1982;Srivastavaetal1983;Rhodeetal1983;Astelletal1984;Shadeetal1986）。

家蚕浓核症病毒的基因组大部分序列也已测定（Bandoetal1987）。

它们的基本结构是相似的，MVM和AAV2有两个大的ORF，每一个ORF大约占基因组的一半，左侧ORF涉及调节功能，右侧ORF编码结构蛋白（图11—3）。

序列分析表明，在人B19病毒，MVM和AAV的左侧调节区，甚至右侧结构蛋白编码区均有明显的同源序列（Shadeetal1986）。

人B19与AAV基因组之间的同源性比人B19与MVM之间的同源性稍大些。

图11—3（a）MVM基因组结构示意图;（b）AAV2基因组结构示意图

mRNA大小以Kb表示之（引自Bernsetal1987）

家蚕DNA至少有3个ORF，其中ORF2编码病毒的结构蛋白，它相当于AAV2和MVM的右侧ORF（ORF—R）；而家蚕DNA的ORF1相当于AAV—2和MVM的左侧ORF（ORF—L），后者编码两个非结构蛋白NS1和NS2。

同样家蚕DNA的ORF1也编码病毒的非结构蛋白。

家蚕DNA与MVM和AAV2不同的是它还有一个ORF3，由基因组的另一条链编码，它编码167个氨基酸，可能是非结构蛋白，这一ORF是昆虫细小病毒和哺乳动物细小病毒的差异所在。

比较细小病毒属（H1，MVM），依赖性病毒属（AAV2）和浓病毒属（DNV）的DNA序列，发现家蚕DNV有300个核苷酸与其它二属病毒有很高的同源性。

这一同源区位于家蚕DNV的ORF2和相应的哺乳动物细小病毒的ORF—L中（Bandoetal1987），即

DNV：

1721—2023

H1：

1407—1701

MVM：

1404—1699

AAV：

1271—1562

这类病毒的单链DNA，与其它大多数单链DNA噬菌体一样，富有胸腺嘧啶（大约30%）。

可以独立繁殖的细小病毒的DNA无感染性，只有双链的AAVDNA在辅助病毒存在的条件下才有感染性。

三、细小病毒科的基因转录

如图11—2所示，MVM有两个启动子，分别位于4和38基因图单位（mu）（Pinteletal1983;Carteretal1983）。

有三个主要转录物，有两个转录物在P4启动子下游，两者在46和48mu处都有一个小的内含子，其中一个有第二个较大的拼接区（10~40mu）。

第三个转录物始于38mu，在46和48mu处有一小的内含子。

所有三个转录物均终止于95mu处，在5’端有帽子结构，在3’端有聚A。

AAV的转录物较小，它有3个启动子，分别位于5mu，19mu和40mu（Lusbyetal1982;Carteretal1983）。

在41和46mu处有一内含子，有不同程度的拼接。

所有三种转录物均终止于96mu，5’端有帽子结构，3’端有聚A尾。

B19病毒更相似于AAV，在感染后期从胞浆提取的主要RNA，均起始于38~40mu，后者翻译成结构蛋白（Jayetal1981）。

四、病毒蛋白

AAV2毒粒有三种结构蛋白，VP1，92K；VP2，72K和VP3，65K。

其中VP3占全部结构蛋白的80%。

体外翻译试验的结果表明，所有三种蛋白均由拼接的p40转录物所翻译（Jayetal1981）。

能独立繁殖的细小病毒衣壳的三种结构蛋白在大小上与AAV相似。

但是，根据宿主细胞种类和感染的时间，其VP2和VP3的相对量有所差异（Johnson1983）。

家蚕DNV的右侧转录物ORF2编码所有4种结构蛋白。

在独立繁殖的细小病毒属，左侧ORF编码两种非结构蛋白NS1和NS2，各为83K和24K（Cotmoreetal1983）。

AAV的非结构蛋白为70K和44K。

家蚕DNV的ORF1相当于MVM的ORF—L，编码病毒的非结构蛋白。

另外，在能独立复制的细小病毒还存在一种蛋白，大约60K，共价结合于复制型DNA的5’端，这一蛋白可能来源于细胞。

五、病毒复制的内在环境

虽然所有病毒都是绝对的细胞内宿主的，但是细小病毒科病毒的复制更依赖于细胞的内环境。

这也不难理解，因为其基因组很小。

能独立繁殖的细小病毒绝对依赖于细胞的繁殖周期。

复制型的双链DNA转变成成熟的单链毒粒基因组，要依靠细胞S期的某些功能。

至于AAV，必需在辅助病毒存在的条件下才能繁殖。

事实上，所有AAV大分子的合成均受辅助病毒的影响。

腺病毒（Ad）EIA区对Ad其它早期区的转录是需要的，它对AAV的转录也是需要的（Tratschinetal1984;Laughlinetal1982）。

EIB也被证明对AAVDNA复制以及把AAV基因组从整合状态拯救出来是需要的（Laughlinetal1982）。

AdE4对AAVDNA复制也是需要的（Richardsonetal1981）。

在溶细胞性感染过程中E4编码的几种多肽之一与EIB编码的55KT抗原形成一种复合物（Sarnowetal1984）。

Ad的VARNAs对AAV结构蛋白的合成是需要的（Janiketal1982）。

现已证明AdE2A（编码一种72K的单链DNA结合蛋白）涉及AAV的一种或所有功能：

DNA复制、mRNA从核内转移到胞浆和蛋白的合成（McPhersonetal1982）。

除Ad外，HSV也可以作为AAV的辅助病毒。

细小病毒利用细胞的DNA聚合酶α和细胞RNA多聚酶Ⅱ。

六、基因表达调节

（一）细小病毒基因表达本身的调节

由左侧ORF编码的早期蛋白对病毒DNA的复制以及调节基因的表达是需要的。

细小病毒H1的早期NS1蛋白对P38启动子控制的病毒衣壳蛋白基因的表达起正调节作用。

这一反式激活作用的Cis区段（tar）在—137和—116之间。

tar区段的作用无方向性，有启动子的功能（Rhode1985;Rhodeetal1987）。

H1的tar序列和狗细小病毒（CPV）的tar序列与位于小鼠肉瘤病毒（MSV）LTR中的CCAAT结合蛋白（CBP）的DNA结合位点是同源的（Handaetal1977）（图11—4）。

图11—4H1P38和CPV的tar序列与MSVLTR中的

CCAAT结合蛋白的DNA结合位点的同源性（引自Rhodeetal1987）

星号表示同源性

上述的CBP结合位点也出现在HSVtk基因启动子区、α2（Ⅰ）和α1（Ⅱ）胶原蛋白基因启动子区（Kellyetal1978）、卵白蛋白基因（Siegletal1985）和Ad2主要晚期启动子区（Sangeretal1980）。

在大多数启动子中，CCAAT序列位于—80处，而细小病毒的tar则位于—120。

细小病毒早期NS1的功能在DNA复制的过程中是复杂的，计有四种：

⑴对病毒DNA的复制是需要的；⑵抑制细胞DNA复制；⑶对衣壳蛋白基因的启动子起正调节作用；⑷对P4启动子（NS1和NS2基因）和异种启动子起负调节作用。

AAV左侧ORF的一个或几个产物对其所有3个启动子均起反式激活作用。

（二）依赖性细小病毒与辅助病毒在基因表达调节水平上的相互关系

AAV与Ad的混合感染可以明显地抑制Ad的复制。

首先，AdEIA可以增强AAVrep基因的表达，而后者又转而对EIA和EIB的表达起抑制作用，同时，当Ad基因的表达只是限于EIA和EIB时，rep基因表达也抑制AAV的P40启动子的晚期基因的表达。

其次当Ad的其它基因表达后，则可以改变AAVrep基因产物对P40控制的晚期基因表达，从开始是抑制转而起增强作用，另一方面却不明显改变对AdEIA和EIB表达的抑制作用。

此外，AAVrep基因产物可以抑制永久性的细胞转化作用（Bernsetal1987）。

七、细小病毒的繁殖

细小病毒DNA的复制在细胞核内进行，完全依赖宿主细胞DNA的复制机制，它仅发生在细胞DNA合成的S和L2期。

事实上，在不复制它们自己DNA的细胞中，病毒DNA是不能产生的，因为，在动物细胞中DNA合成酶只在S期才有活性。

可独立繁殖的和缺失性的细小病毒，其DNA复制的机制原则上相似，它不需环化，也不需要RNA引物。

这是由于如图11—1、11—2所示。

在其分子3’端自我互补序列可折叠的缘故。

这样即可产生对DNA多聚酶作用需要的引物—OH。

在分子的一部分有G/C丰富区，继而有A/T丰富区，这是DNA复制起始点的特征，其复制过程如图11—5所示。

在复制起始点处对侧链需要一个特异性的缺口。

图11-5.AAVDNA复制型双链中间体的形成示意图（引自Fraenkel—Conratetal1988）

末端重复序列以ABCDbaEF表示，其中AB指核苷酸1~41，它与ab

（核苷酸125—85）互补，C和D是二个较短的自我互补的发夹序列

（核苷酸各为42—62和64—84）；E，F代表DNA序列的连续。

八、细小病毒感染的分子病理

在缺少辅助病毒的条件下，AAV毒粒可以进入细胞核内，然后DNA脱衣壳，整合入细胞基因组，整合的频率很高，如果再经辅助病毒重复感染，这种基因整合又可被拯救出来，拯救频率也很高。

独立性细小病毒和依赖性细小病毒常可引起隐性感染。

在明显的未发生感染的细胞培养中，常可分离出独立性细小病毒；大约有20%的原代非洲绿猴肾细胞是有依赖性细小病毒的感染（Siegletal1983）。

独立性细小病毒可以引起多种疾病，这包括宫内感染，引起胎儿和新生动物死亡、先天性畸形，溶骨性综合症，新生动物的急性致死性疾病，肠炎，肝炎，心肌炎，小脑性共济失调，出血性脑炎，全白细胞减少症，阿留申水貂病等，后者与免疫病理有关（Berns1984）。

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