海藻学实验指导.docx

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海藻学实验指导

海藻学实验指导

温州医学院生命科学学院海洋系

2009年5月

实验一藻类细胞的观察和计数

一、实验目的

1．了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能；

2．观察常见藻类细胞形态结构。

二、实验原理

  测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。

  显微计数法适用于各种含单细胞藻的纯培养悬浮液。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。

计数区的刻度有两种：

一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。

但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。

盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。

使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中藻细胞的数量，再换算成每毫升藻液中细胞的数量。

1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，K=4×106。

每ml菌液中含有细胞数=每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d）

三、方法与步骤

1、取洁净的血球计数板，在计数室上面盖上盖玻片。

2、取稀释到一定程度藻液，从盖片边缘滴一小滴，使藻液自行渗入，计数室内不能有气泡。

先在低倍镜下找到小方格网后，再转换高倍镜观察并计数。

3、如用16X25计数板，只计四个角上中方格的菌数。

若是25X16的计数板，除计数四个角上的中格菌数外，还要计算中央中格的菌数。

每个样品重复计数2~3次。

计数时应不时调节焦距，才能观察到不同深度的菌体。

4、位于格线上的藻细胞一般只计此格的上方线及左方线上的菌体。

5、计数方法：

样品中菌数/ml=每小格平均菌数x4000,000x稀释倍数，本实验采用25x16规格，要求数这些方格中的全部小格即80个小格。

设：

每个中方格的菌数为A，则

每小格平均菌数=（A1+A2+A3+A4+A5）/80

样品中的菌数/ml=（A1+A2+A3+A4+A5）/80X4000,000X稀释倍数

结果记录

微生物名称               总细胞数                          个/ml

第一个

中格

第二个

中格

第三个

中格

第四个

中格

第五个

中格

第一次测定

第二次测定

平均

四、测定注意事项:

1、测定时，藻液要要摇匀，防止细胞沉淀。

2、位于格线上的酵母菌一般只计此格的上方线及左方线上的藻细胞。

五、思考题

1，采用血球计数板的计数是，如何减少误差？

附：

鲁格氏碘液：

碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。

先将碘化钾溶于3~5ml蒸馏水中，然后加碘，摇匀，使碘完全溶解后，再加蒸馏水至足量。

装入棕色试剂瓶。

实验二藻细胞大小的测定

一、实验目的

   了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。

二、基本原理

　　微生物细胞大小，是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。

由于菌体很小，只能在显微镜下测量。

用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

　　镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片。

一般将1mm等分为100格（或2mm等分为200格），每格长度等于0．01mm（即106μm）。

是专用于校正目镜测微尺每格长度的。

　　目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，有等分50小格或100小格两种，每5小格间有一长线相隔。

由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同，因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。

三  材料

3.1  器械

显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺，载玻片、盖玻片、血球计算板、擦镜纸、吸水纸、玻片架、洗瓶、滴管。

3.2  藻种

培养至对数生长期的藻细胞。

四流程

4.1 置目测微计→置台测微计→标定目测微计→测细胞大小→记录结果→用毕擦拭干净

4.2 检查计数板→稀释样品→加样→计数→计算→清洗

五  步骤

1  目镜测微尺的校正：

更换目镜测微尺镜头（标记为PF）；或者取下目镜上部或下部的透镜，在光圈的位置上安上目镜测微尺，刻度朝下，再装上透镜，制成一个目镜测微尺的镜头。

2  某一倍率下标定目镜刻度：

将镜台测微尺置于载物台上，使刻度面朝上，先用低倍镜对准焦距、看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器使两尺重叠，并使二尺的左边的某一刻度相重合，向右寻找另外二尺相重合的刻度。

记录两重叠刻度间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。

3  计算该倍率下目镜刻度 ：

目镜测微尺每格长度=镜台测微尺格数/目镜测微尺格数xl0um

4  标定并计算其他放大倍率下的目镜刻度：

以同样方法分别在不同倍率的物镜下测定目镜测微尺每格代表的实际长度。

如此测定后的测微尺的长度，仅适用于测定时使用的显微镜以及该目镜与物镜的放大倍率。

5  藻细胞大小的测定

5.1  大小换算

将标本先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测定每个菌体长度和宽度所占的刻度，即可换算成菌体的长和宽。

5.2  求平均值

一般测量微生物细胞的大小，用同一放大倍数在同一标本上任意测定l0一20个菌体后，求出其平均值即可代表该菌的大小。

5.3  清洗 

计数板用毕后先用95%的形酒精轻轻擦洗，再用蒸馏水淋洗，然后吸干，最后用擦镜纸揩干净。

若计数的样品是病原微生物，则须先浸泡在5%石炭酸溶被中进行消毒，然后再行清洗。

清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。

六 结果

1计算出目镜测微尺在低、高倍镜下的刻度值。

2 记录藻细胞大小的测定结果。

七  思考

1  为什么随着显微镜放大倍数的改变，目镜测微计每格相对的长度也会改变？

能找出这种变化的规律吗？

2  根据测量结果，为什么同种酵母菌的菌体大小不完全相同？

八附录

目镜测数尺有两种：

一是特制的目镜镜头，镜片上刻有50等分或100等分的刻度，使用时直接安装在显微镜上，取代没有刻度的目镜镜头；另一种是一块直径大约17.5 mm的圆玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度，使用时将该玻璃片安装在原来的目镜镜头上即可。

由于不同的显微镜放大倍数不同，既使同一显微镜在不同的目镜、物镜组合下其放大倍数也不同，故目镜测微尺每格实际表示的长度随显微镜放大倍数不同而异。

也就是说，目镜测微尺上的刻度只代表相对的长度。

因此在使用前须用镜台测微尺校正，以确定在一定放大倍数下目镜测微尺的每格长度。

实验三藻类的分离和培养

一、目的要求

1．藻类植物的分布很广，种类也很多，学生通过对淡水生藻类植物进行调查、采集和培养，可以增加学生藻类植物工作的经验，培养学生参加科研工作的积极性，提高学生科研工作的能力。

2．学生在课前必须大量阅读与藻类植物相关的知识。

二、基本原理

藻类植物是自然界中非常重要的一大类生物类群，它们不仅是用于科学研究的良好材料，在医药、食品、精细化工、环境保护、水产养殖等方面都有着广泛的应用。

研究观察藻类不但有一定的理论意义，也具有重要的应用价值。

淡水藻类以其生长环境不同可分成两类：

一类是水生藻类；一类是气生藻类。

三、仪器、材料与试剂

显微镜、显微图像采集系统、采集瓶、培养瓶、吸管、镊子、刀、标签、记录本、浮游生物网、台纸等，相关工具书；4％的甲醛溶液、碘液

四、方法与步骤

1．淡水藻类标本的采集方法

（1）水生藻类标本的采集

水生藻类依其形体大小可分为丝状种类和微小浮游种类。

丝状种类可用镊子采集。

对固着于石块等物体上的藻可用刮刀将藻从基部刮下或连同附着物一起采集。

将采集到的标本放入标本瓶中并加入一些水，但水不要加得太满，应留有一定的空间，标本瓶盖应注意密封，防止样品流失。

标本瓶上要贴上标签，标签上须用铅笔注明该标本采集的地点、日期和采集者。

浮游种类要用专用的浮游生物网采集，如无专用工具，也可用市售的300目尼龙筛绢对水体进行过滤，滤出的藻体可用少量水冲洗入标本瓶中。

标本采集时还应用记录本记下各标本的采集环境、气温、水温、pH值、藻的附着基质、水体透明状况、藻体的手感是否滑腻等，这些都是鉴定藻类的参考条件。

因此应注意详细记录。

新鲜的藻标本不宜久存，应尽快对标本进行观察鉴定，好的标本可用4％的甲醛溶液（福尔马林溶液）固定保存。

（2）气生藻标本的采集

气生藻类多生长在阴湿的地面、墙壁以及树干的背荫面。

这类藻可用小铲刀采集，用牛皮纸包好，风干后保存。

对气生藻进行观察时，可用镊子镊取少许藻体，放在载玻片上，滴一小滴水浸润后在显微镜下观察形态。

2．几种常见藻类的采集、观察和保存

（1）水绵在春秋季较清洁的水体中较常见，用手指捻摸有滑腻感，在显微镜下观察藻丝无分枝，叶绿体呈典型的螺旋带状，如在样品上加一点碘液（或碘酒）可见排列于叶绿体上的淀粉颗粒染成深褐色。

鞘藻和刚毛藻也是很常见的丝状绿藻，与水绵不同的是这两种藻多生长于污染水体中。

鞘藻不分枝但手摸无滑腻感，较老的细胞两端不等宽，进行有性生殖时形成大球形合子，易与水绵区分；刚毛藻手摸有粗糙感，藻丝分枝。

（2）硅藻在雨后浅积水、小水沟等水质清澈的水体底部，呈棕色的表层中均有大量的硅藻生长，硅藻一般个体较小，显微镜下可见多为舟形，会缓慢滑动。

（3）颤藻各种水体中均可见，以污水中较多，呈粘滑膜片状，深绿至黑褐色。

显微镜下观察藻丝不分枝，细胞中仅见均匀小颗粒。

（4）衣藻多出现于春秋季富含有机物的临时小水体中，可大量繁殖使水体呈绿色。

在显微镜下观察，藻体游动，呈卵圆形，高倍镜下仔细观察顶端有两条等长鞭毛。

衣藻标本固定一般用I2-KI溶液以防止鞭毛脱落。

固定后的标本一般可保存数周至几个月。

裸藻也是一种单细胞游动藻类，细胞为梭形，顶部一根鞭毛。

（5）绿球藻生长于树皮上，呈绿色粉末状。

显微镜观察为绿色圆球状。

3．对采集来的藻类植物进行分离、培养、鉴定和制作标本。

【注意事项】

学生一般分为6人一小组，一起完成实验；计划在4周内完成，6个学时数。

思考与练习

1．完成一套本地区淡水藻类植物标本/小组。