补体实验报告.docx

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补体实验报告

补体实验报告

篇一：

补体结合试验

　　第二节补体结合试验

　　补体结合试验（complementfixationtest，cft）是用免疫溶血机制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。

早在1906年wasermann就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。

这一传统的试验经不断改进，除了用于传染病诊断和流行病学调查以外，在一些自身抗体、肿瘤相关以原以及hla的检测和分析中也有应用。

　　一、类型及原理

　　自身免疫性溶血，如果有补体参与时，补体通过一系列的激活，最后形成膜攻击复合物（membraneattackcomplex），它可以直接攻击红细胞膜，导致红细胞破裂，这就是所谓“血管内溶血”。

而没有补体参与的免疫性溶血，抗体与红细胞膜上抗原结合后，没有直接把红细胞破坏，而是把红细胞“致敏”，致敏RBC在通过脾脏等网状内皮系统时，被吞噬细胞“吃掉”，这就是所谓“血管外溶血”。

　　该试验中有5种成分参与反应，分属于3个系统：

①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）；②补体系统；③指示系统，即srbc与相应溶血素，试验时常将其预先结合在一起，形成致敏红细胞。

反应系统与指示系统争夺补体系统，先加入反应系统给其以优先结合补体的机会。

　　如果反应系统中存在待测的抗体（或抗原），则抗原抗体发生反应后可结合补体；再加入指示系统时，由于反应液中已没有游离的补体而不出现溶血，是为补体结合试验阳性。

如果反应系统中不存在的待检的抗体（或抗原），则在液体中仍有游离的补体存在，当加入指示系统时会出现溶血，是为补体结合试验阴性（图14-2）。

因此补体结合试验可用已知抗原来检测相应抗体，或用已知抗体来检测相应抗原。

　　图14-2补体结合试验示意图

　　二、试验方法

　　补体结合试验的改良方法较多，较常用的有全量法（3ml）、半量法（1.5ml）、小量法（0.6ml）和微量法（塑板法）等。

目前以后两种方法应用较为广泛，因为可以节省抗原，血清标本用量较少，特异性也

　　较好。

以下叙述以小量法为例，即抗原、抗体、溶血素、羊红细胞各加0.1ml，补体加0.2ml，总量为0.6ml。

（一）试剂

　　1．抗原试验中用于检测抗体的抗原应适当提纯，纯度愈高，特异性愈强。

如使用粗制抗原时，须经同样处理的正常组织作抗原对照，以识别待检血清中可能存在的、对正常组织成分的非特异性反应。

　　2．抗原和抗本的滴定补体结合试验中，抗原与抗体按一定比例结合，因而应通过试验选择适宜的浓度比例。

多采用方阵法进行滴定，选择抗原与抗体两者都呈强阳性反应（100％不溶血）的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（单价）。

滴定方法举例如表14-4。

在试管中加入不同稀释度的抗原，配加不同稀释度的抗血清，另作不加抗原的抗体对照管和不加抗血清的抗原对照管。

按照试验方法加补体和指示系统，温育后观察结果。

在表14-4中可见1:

64抗原和1:

32抗体各作为1个单位。

在正式试验中，抗原一般采用2～4个单位（1:

64～1:

32），抗体采用4个单位（1:

8）。

　　表14-4抗原和抗体的方阵滴定

　　抗原1:

41:

81:

161:

321:

641:

1281:

2561:

512抗体对照

　　抗血清稀释倍数1:

4444444300

　　1:

8444442100

　　1:

16444441000

　　1:

324444④0000

　　1:

64443320000

　　1:

1284321±0000

　　1:

256322±00000

　　1:

51221±000000

　　抗原对照00000000

　　注：

1、2、3、4分别表

示溶血反应强度＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋；0为不溶血。

　　3．补体滴定按表14-5逐步加入各试剂，温育后观察最少量补体能产生完全溶血者，确定为1个实用单位，正式试验中使用2个实用单位。

如形14-5中的结果为1:

60的补体0.12ml可产生完全溶血，

　　按比例公式0.12×2:

60＝0.2:

x计算，x＝50；即实际应用中的2个补体实用单位应为1:

50稀释的补体0.2ml。

　　表14-5补体的滴定

　　管号

　　1:

60补体（ml）缓冲液（ml）稀释抗原（ml）

　　致敏srbc（ml）

　　123456

　　0.040.060.080.100.120.14

　　0.260.240.220.200.180.16

　　0.10.10.10.10.10.1

　　浴30min37℃水置放

　　0.20.20.20.20.20.2

　　浴30min37℃水置放

　　不溶血不溶血微溶血微溶血全溶血全溶血

　　结果

（二）血清标本

　　采集血液标本后及时分离血清，及时检验或将血清保存于－20℃。

血清在试验前应先加热56℃30min（或60℃3min）以破坏补体和除去一些非特异因素。

血清标本遇有抗补本现象时可做下列处理之一：

①加热提高12；②－20℃冻融后离心去沉淀；③以3mmol/l盐酸处理；④加入少量补体后再加热灭活；⑤以白陶土处理；⑥通入co2；⑦以小白鼠肝粉处理；⑧用含10％新鲜鸡蛋清的生理盐水稀释补体。

　　（三）正式试验

　　以小量法测定抗体的补体结合试验为例。

按表14-6逐步加入各种试剂，温育后先观察各类对照管，应与预期的结果吻合。

阴性、阳性对照管中应分别为明确的溶血与不溶血；抗体或抗原对照管、待检血清对照管、阳性和阴性对照的对照管都应完全溶血。

绵羊红细胞对照管不应出现自发性溶血。

补体对照管应呈现2u为全溶，1u为全溶略带有少许红细胞，0.5u应不溶。

如0.5u补体对照出现全溶表明补体用量过多；如2u对照管不出现溶血，说明补体用量不够，对结果都有影响，应重复进行试验。

补体结合试验结果，受检血清不溶血为阳性，溶血为阴性。

　　表14-6测定抗体的补体结合试验操作程序

　　反应物（ml）待检血清管

　　测定

　　稀释血清抗原缓冲液2u补体1u补体0.5u补体致敏红细胞

　　混匀，置37℃30min后观察结果

　　0.10.1－0.2－－0.2

　　对照0.1－0.10.2－－0.2

　　阳性对照管测定0.10.1－0.2－－0.2

　　对照0.1－0.10.2－－0.2

　　阴性对照管测定0.10.1－0.2－－0.2

　　对照0.1－0.10.2－－0.2

　　抗原对补体对照管照管－0.10.10.2－－0.2

　　2u－0.10.10.2－－0.2

　　1u－0.10.1－0.2－0.2

　　0.5u－0.10.1－－0.20.2

　　－－0.4－－－0.2

　　红细胞对照管

　　混匀，置37℃1h或4℃16～18h

　　三、应用和评价

　　补体结合试验是一种传统的免疫学技术，能够沿用至今说明它本身有一定的优点：

①灵敏度高。

补体活化过程有放大作用，比沉淀反应和凝集反应的灵敏度高得多，能测定0.05μg/ml的抗体，可与间接凝集法的灵敏度相当。

②特异性强。

各种反应成分事先都经过滴定，选择了最佳比例，出现交叉反应的机率较小，尤其用小量法或微量法时。

③应用面广，可用于检测多种类型的抗原或抗体。

④易于普及，试验结果显而易见；试验条件要求低，不需要特殊仪器或只用光电比色计即可。

　　补体结合试验可应用在以下几方面：

①传染病诊断。

病原性抗原及相应抗体的检测。

②其他抗原的检测。

例如肿瘤相关抗原、血迹中的蛋白质鉴定、hla分型等。

③自身抗体检测。

　　但是补体结合试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作步骤繁锁并且要求十分严格，稍有疏忽便会得出不正确的结果，所以在多种测定中已被其他更易被接受的方法所取代。

但对于免疫学技术的基本训练仍是一个很好的试验。

篇二：

医学免疫学CDC实验报告

　　CDC实验

　　一.实验原理

　　细胞表面抗原与相应的抗体（IgG1~3或IgM）特异性结合形成的免疫复合物，可通过经典途径激活补体形成攻膜复合体而导致细胞膜穿孔。

因此，水溶性染料如台盼蓝可进入受损细胞，染成蓝色，为阳性反应；不带抗原的细胞，未损伤，不染色，为阴性反应。

二.实验步骤1.胸腺细胞悬液制备颈椎脱臼法处死小鼠↓

　　暴露胸腔，分离出胸腺↓

　　镊子夹住胸腺反复轻轻研磨↓单个细胞

　　PBS洗２次，1000rpm，10min↓

　　加入5%小牛血清PBS制备细胞悬液调节细胞浓度至3-4×107/ml

　　三.结果判断

　　①细胞膜穿孔的细胞呈蓝色，细胞膜完整的活细胞不着色。

②细胞毒性作用的判断标准如下：

阴性反应（－）死细胞占0-10%可疑阳性反应（±）死细胞占11-20%弱阳性反应（+）死细胞占21-50%阳性反应（++）死细胞占51-80%强阳性反应（+++）死细胞占81-100%

　　四.结果记录

　　1.表格记录

　　2.照片展示

　　五.讨论

　　①.第①组成阳性的原因：

实验中加入抗原、抗体、补体、LC。

抗原抗体能形成抗原抗体免疫复合物，通过经典途径激活补体，形成攻膜复合物，从而导致细胞膜穿孔，细胞受损，台盼蓝进入细胞，染成蓝色，呈阳性反应。

说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体共同参与。

　　②.第②组成阴性的原因：

实验中加入抗体、LC。

因为无抗原和补体，不能形成抗原抗体免疫复合物，也无补体，因此不能形成攻膜复合物，不能使细胞膜穿孔，细胞无损伤，台盼蓝无法进入细胞，不能被染成蓝色，呈阴性反应。

说明CDC实验必须要有补体的参与。

　　③.第③组呈阴性的原因：

试验中加入LC和补体，因为无抗原抗体，所以没有抗原抗体免疫复合物的形成，补体不能被激活，不能形成攻膜复合物，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反应。

说明CDC实验必须要有抗原、抗体的参与。

　　④.第④组呈阴性的原因：

实验中只加入LC，既无抗原抗体免疫复合物的形成，也无补体，细胞无受损，台盼蓝不能进入而不被染色，呈阴性反应。

说明CDC实验必须要有抗原、抗体、补体的共同参与。

篇三：

实验三补体溶血实验

　　实验三补体溶血实验

　　一、实验目的：

了解溶血反应的原理，掌握溶血反应的基本操作方法

　　二、实验原理：

将绵羊红细胞做抗原注射家兔体内，经一定潜伏期，家兔血清中即出现特异

　　性抗体，此种抗体称溶血素，它可以与绵羊红细胞结合，此时若加入补体，即可激活补体的

　　经典途径，则呈现溶血现象。

　　三、实验材料

　　1、溶血素（1：

1000）、补体（1：

30）、绵羊红细胞（1%）、生理盐水

　　2、试管、吸管、试管架等

　　四、实验方法

　　1、按下表将试管4支排成一排，

　　2、震荡混匀，37℃水浴30分钟。

　　五、实验结果

　　实验管因发生溶血而变红色透明，其余管为红细胞悬液。

　　六、注意事项

　　1、取样品的吸管不可混用；加样力求准确；

　　2、SRBC吹匀后再加；

　　3、补体稳定性差：

T、pH、连续吹打等都使活性下降，所以置于冰浴中，用时再取；加入补体后轻轻吹打。