超声波提取羊耳菊叶总黄酮优化工艺研究.docx
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超声波提取羊耳菊叶总黄酮优化工艺研究
摘要
本文探讨了影响超声波法羊耳菊叶中黄酮提取率的主要因素，通过L9（33）正交试验，探讨羊耳菊叶中黄酮类化合物提取的最佳工艺。
结果表明，各试验因素对羊耳菊叶中黄酮类物质提取量的影响依次为乙醇浓度,提取时间,液料比。
超声波提取羊耳菊叶中的黄酮类化合物的最佳工艺为使用70%浓度的乙醇，在温度为60℃，液料比为25:
1条件下，超声提取3h，提取1次。
关键词：
超声波;羊耳菊;黄酮;提取
Abstract
Study on Extraction Process of Flavonoids from InulacappaDC. Leaves with Supersonic Extraction
TheextractiontechnologyofflavonoidsintheInulacappaDC.Leaveswasstudiedaccordingtotheorthogonaldesigninthispaper.ItwasfoundthatTheprocessingconditionsaffected theyield,andthattheeffectofeachconditiondecreasedinthefollowingorder:
extractingethanolconcentration,extractingtime,in proportion of extracting solvents.and25:
1of70%ethanoltotheInulacappaDC. Leavesweighratiowasusedwithultrasonictreatmentlastfor3honceatthetemperatureof60℃.
Keywords:
Supersonic;InulacappaDC.;Flavonoids;extraction
目录
前言·················································1
1材料与方法·······································4
1.1材料·········································4
1.2试剂和仪器···································4
1.3方法·········································4
1.3.1工作曲线回归方程的建立··················4
1.3.2样品液的制备····························4
1.3.3样品黄酮含量的测定······················5
1.3.4超声波提取法较优条件的选择··············5
1.3.4.1单因素实验·······················5
1.3.4.2提取工艺的正交试验···············6
2结果与分析······································6
2.1芦丁标准曲线的绘制···························6
2.2超声波热浸提工艺参数对羊耳菊叶中黄酮提取的影响
·········································6
2.2.1乙醇浓度对羊耳菊叶黄酮提取的影响········6
2.2.2固液比对羊耳菊叶黄酮提取的影响··········7
2.2.3超声波提取时间对羊耳菊叶总黄酮提取的影响
······································8
2.2.4超声波提取次数对羊耳菊叶总黄酮提取的影响
······································9
2.3超声波热浸提羊耳菊叶中黄酮提取得率的正交实验
······································10
3讨论···········································11
参考文献···········································13
致谢···············································15
·
超声波提取羊耳菊叶总黄酮优化工艺研究
姓名：
张祺玲学号：
0312402032专业：
生物工程
前言
羊耳菊（InulacappaDC.），系菊科旋覆花属植物，亚灌木,根状茎粗壮[1]。
在我国分布较为广泛,在四川、云别名白牛胆（云南、广东、广西、湖南、浙江），山白芷（广东、四川、浙江、云南），见肿消（云南），为南方民间草药，全草或根均为传统药物。
其味苦微辛，性平无毒:
驱风利湿，行气化滞。
可用于治疗风湿关节疼痛、胸隔痞闷、疟疾痢疾、泄泻、产后感冒、肝炎、痔疮和疥癣。
临床多用作补药、健胃药、发汗药和驱风药。
傣药名方“雅叫哈顿散”临床上用于治疗感冒发烧、喉炎、咳嗽咳血、虚痨、心悸、月经不调及产后流血等症，疗效肯定，具有很高的研究开发价值[2]。
菊科（Compositae）旋覆花属（Inula）植物，具有抗菌、抗真菌、抗炎及细胞毒活性，有多种植物为传统药物[3]。
从现有文献来看，倍半萜内酯和黄酮类是其主要成分。
旋覆花属植物所含的黄酮类化合物有黄酮，黄酮醇，二氢黄酮醇，主要是一些经典的结构类型，3,5,6,7,3',4',5'常有含氧取代基，常为羟基、甲氧基、酞基，糖类多连在3,7位。
已从该属植物分离得56个黄酮类化合物[4]。
黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物,是色原烷的衍生物,其特点是具有C6—C3—C6的基本骨架,并可根据中间吡喃环的不同氧化水平和两侧A、B环上连接的各种取代基,而分为不同的黄酮类型[5]。
黄酮类化合物是植物光合作用产生的一大类化合物，包括以黄酮为母核的一类黄色色素和黄酮的同分异构体及其还原产物。
黄酮母核上有羟基、甲氧基、烃氧基等取代基，分别形成各种黄酮类化合物，由于这些助色团的存在，使该类化合物多显黄色。
由于分子γ-吡酮环上的氧原子能与强酸形成弱碱性盐，因此曾称之为黄碱素类化合物。
植物界中存在各种各样的黄酮类化合物，目前发现的已达五千余种。
已从多种植物提取出了黄酮类化合物，并且已从中分离出了部分单一成分[6]。
一般黄酮类化合物根据C环的结构分类,主要是以六元的C环的氧化状况和B环所连接的位置不同为依据分为:
黄酮及黄酮醇类,如芹菜素、槲皮素;双黄酮类,如银杏素;二氢黄酮及二氢黄酮醇类,如橙皮甙;查耳酮类,如红花甙;黄烷醇类,如儿茶素;花色素类,如飞燕草素;异黄酮类,如葛根素;其他黄酮类,如异芒果素[7]。
黄酮类化合物广泛分布于各种植物,迄今已从天然产物中发现了大量的黄酮类化合物,其中大多数具有显著的生理、药理活性。
比如黄酮类化合物能抗炎、抗菌、抗病毒、抗过敏；调节毛细血管的脆性与渗透性,保护心血管系统[8];抗氧化、消除自由基、降低血糖、延缓衰老;增强免疫和抗肿瘤作用[9,10];此外,黄酮化合物也是重要的功能食品添加剂、天然抗氧化剂、天然色素、天然甜味剂等。
黄酮类化合物还具有保鲜和护肤美容等作用[11]。
随着化学药品抗药性的不断出现和人们对其毒副作用认识的深入,黄酮类化合物具有毒性低和药理活性较强的特点,日益成为国内外医药界开发的重点。
在我国传统中药复方制剂中,有很多以黄酮作为主要成分,因此深入研究植物中的黄酮成分,不仅具有理论上的意义,而且更有其巨大的实用价值。
黄酮类化合物因其结构和来源的不同,溶解性差异也很大,因此应根据其极性和溶解性来选择合适的提取溶剂。
提取的方法主要有:
有机溶剂萃取法,即利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同,选用不同的溶剂萃取可达到精制纯化目的,常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等;碱性水提法,因黄酮苷类有一定极性,溶于水,易溶于碱性水,难溶于酸性水,故可用碱性水进行提取,再将碱性提取液调成酸性,黄酮苷类即可沉淀析出;超声提取法,因为超声波的空化作用对细胞膜的破坏有助于黄酮类化合物的释放与溶出,超声波使提取液不断震荡,有助于溶质扩散;微波法,是利用磁控管所产生的每秒24.5亿次超高频率的快速震动,使内分子间相互碰撞、挤压利于有效成分的浸出,具有反应高效性和强选择性等特点;大孔树脂吸附法,吸附树脂是一类有机高分子聚合物吸附剂,具有物理化学稳定性高、吸附选择性独特、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和,使用周期长、节省费用等优点;超临界萃取法,超临界CO2萃取技术以液态CO2为溶剂进行提取,提取率与提取温度、提取压力、CO2消耗量等因素有关[6,11,12]。
本文以芦丁为对照品，考察了超声波提取法下对羊耳菊叶的黄酮的最佳提取条件的研究，根据黄酮类化合物母核中含有碱性氧原子与游离的铝离子生成黄色络合物，加入亚硝酸钠和氢氧化钠使在碱性环境中呈红色，主要采用硝酸铝—亚硝酸钠为显色剂，用紫外分光光度法来测定含量[13,14,15]。
1材料与方法
1.1材料
羊耳菊:
采自湖南通道
1.2试剂和仪器
芦丁上海试剂二厂；乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为分析纯。
UV-752紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；AL104电子天平（Mettler-Toledo仪器公司）；KQ-500DE型医用超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；RE52-99旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-3循环水多用真空泵（上海沪西分析仪器厂）
1.3方法
1.3.1工作曲线回归方程的建立
精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁标准品21.6mg置100ml容量瓶中，加60%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
吸取上述溶液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0ml分别置于25ml定量管中，各加入5%的NaNO2溶液1ml，摇匀，放置6min，加10%Al（NO3）3溶液1ml，摇匀，放置6min，加4%NaOH溶液10ml，然后用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min。
以0号作空白，用分光光度法分别在500nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
1.3.2样品液的制备
准确称取羊耳菊干叶粉末4g，加60%乙醇100ml，在温度为60℃，超声波功率为600W下萃取2.5h，抽滤。
减压浓缩回收乙醇至滤液仅剩4ml为止，放置100ml容量瓶中,用60%乙醇定容至100ml,备用。
1.3.3样品黄酮含量的测定
精密量取0.5ml样品液至25ml定量管中,加入5%的NaNO2溶液1ml，摇匀，放置6min，加10%Al（NO3）3溶液1ml，摇匀，放置6min，加4%NaOH溶液10ml，然后用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min。
用分光光度法在λ=500nm处测定吸光度，根据回归方程计算样品中总黄酮含量。
1.3.4超声波提取法较优条件的选择
1.3.4.1单因素实验
（1）乙醇浓度对超声波法提取效果的影响
分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液100ml600W超声波萃取，按含量测定方法测定吸光度值，求得黄酮含量。
（2）料液比对黄酮浸出率的影响
用60%的乙醇，料液比分别1:
10、1:
15、1:
20、1:
25、1:
30、1:
35,600W超声波萃取2.5h，按含量测定方法测定吸光度值，求得黄酮含量。
（3）超声波萃取时间对黄酮类物质的影响
在100ml，60%乙醇条件下选择时间分别为1、1.5、2.0、2.5、3、3.5h进行超声波萃取，按含量测定方法测定吸光度值，求得黄酮含量。
（4）超声波萃取次数对黄酮物质提取的影响
用100ml，60%乙醇超声波萃取2.5h，抽滤,滤渣再萃取2.5h。
分别萃取1、2、3次,按含量测定方法测定吸光度值，求得黄酮含量。
1.3.4.2提取工艺的正交试验
选L9（33）作正交试验，统计试验结果。
2结果与分析
2.1芦丁标准曲线的绘制
用紫外分光光度计，在500nm的波长处测定吸光度。
用最小二乘法作线性回归，得其线性回归方程得芦丁浓度（C）与吸光度（A）的回归方程C=58.232A+0.5416,R2=0.9998。
以芦丁浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线见图1。
图1芦丁标准曲线
2.2超声波热浸提工艺参数对羊耳菊叶中黄酮提取的影响
2.2.1乙醇浓度对羊耳菊叶黄酮提取的影响
根据1.3.4.1
（1）的方法,测定乙醇浓度对总黄酮提取的影响,结果见图2。
图2乙醇浓度对总黄酮提取的影响
Fig.2Theextractrusltsofflavonoidswiththedifferentethanolconcentration
图2表明：
随着乙醇浓度的增加，黄酮的提取率也逐渐增加，但是当乙醇浓度超过60%的时候，黄酮的提取率反而降低，是因为随着乙醇浓度的增大，会使提取粗品中杂质含量增加，有效成分含量反而降低,影响提取物有效含量。
2.2.2液料比对羊耳菊叶黄酮提取的影响
根据1.3.4.1
（2）的方法,测定液料比对总黄酮提取的影响,结果见图3。
图3液料比对总黄酮提取的影响
Fig.3Theextractrusltsofflavonoidswiththedifferentsolidtoliquidratio
图3可见，浸提固液比在l:
10至1:
35的范围内，浸提固液比在l:
25时提取率最高，但随后增加溶剂的量对提取率的变化不大，在实际操作中，当浸提固液比过小时，提取液偏少，不利于过滤分离;当浸提固液比过大时，旋转蒸发转移溶剂时耗时长耗能多，因此选择浸提固液比在1:
25也较为合适。
2.2.3超声波提取时间对羊耳菊叶总黄酮提取的影响
根据1.3.4.1（3）的方法,测定超声波提取时间对总黄酮提取的影响,结果见图4。
图4超声波提取时间对总黄酮提取的影响
Fgi.4Theextractrusltsofflavonodiswiththesupersonicextractiondifferenttime
图4可见，随超声波提取时间从1-2h，提取得率平均增加了7.898mg/g，而提取时间从2-3.5h时，提取得率才增加了0.364mg/g，增幅减少了，由此可以看出，再增加超声波提取时间，提取得率增速
出现逐渐减缓趋势。
造成提取物在超声作用达到一定时间后，提取得率增加缓慢或呈下降趋势的原因可能是在长时间超声作用下，提取率逐渐向极限值靠近，致使提取得率增幅降低。
同时超声作用时间太长，会使提取粗品中杂质含量增加，有效成分含量反而降低，影响提取物有效含量。
2.2.4超声波提取次数对羊耳菊叶总黄酮提取的影响
根据1.3.4.1（4）的方法,测定超声波提取次数对总黄酮提取的影响,结果见图5。
图5超声波提取次数对总黄酮提取的影响
Fgi.5Theextractrusltsofflavonodiswiththesupersonicextractiondifferenttimes
图5可见,总黄酮提取量随着提取次数的增多而增多,但增幅很小。
说明黄酮提取率已经靠近极限值,且随着次数增加使提取粗品中杂质含量增加，有效成分含量降低，影响提取物有效含量。
2.3超声波热浸提羊耳菊叶中黄酮提取得率的正交实验
在上述单因素试验的基础上，因提取次数对总黄酮提取影响不大，且耗时过长，因此提取次数选定1次,故选定3因素3水平作正交试验，因素水平见表1，试验结果见表2。
表1提取工艺参数设计表
Table1Factorsandlevelsofextractiontechniques
水平
因素
A乙醇浓度（%）
B液料比
C提取时间（h）
1
50
20:
1
2
2
60
25:
1
2.5
3
70
30:
1
3
通过正交试验和数据处理（表2）考虑A、B、C三因素在三个水平上的变化，得出最佳提取条件，影响羊耳菊叶中黄酮类化合物提取率的因数主次顺序为A>C>B，从平均提取得率看，A3B2C3提取条件最好，所以选择A3B2C3，所以选择此条件即乙醇浓度为70%，超声时间为3h，液料比为25:
1。
表2L9（33）提取工艺条件正交试验结果表
Table2L9（33）Resultsoforthogonaltestofextractiontechniques
A
B
C
黄酮含量（mg/g）
1
A1
B1
C1
65.023
2
A1
B2
C2
70.119
3
A1
B3
C3
70.191
4
A2
B1
C2
82.129
5
A2
B2
C3
82.930
6
A2
B3
C1
77.689
7
A3
B1
C3
82.784
8
A3
B2
C1
82.275
9
A3
B3
C2
82.639
M1
68.444
76.645
74.996
M2
80.916
78.441
78.296
M3
82.566
76.840
78.635
K1
205.333
229.936
224.987
K2
242.748
235.324
234.887
K3
247.698
230.519
235.905
R’
14.122
1.796
3.639
3讨论
超声波强化萃取的最主要原因是由于超声波产生的空化效应。
液体中的微小泡核在超声波作用下被激活,表现为泡核的振荡、生长、收缩乃至崩溃等一系列动力学过程。
泡核在瞬态空化崩溃时可形成高达5000K以上的局部热点,压力可达数十乃至上百个兆帕,随着高压的释放,将在液体中形成强大的冲击波。
在提取过程中,这种强大的冲击流能够有效地减小、消除溶剂与水相之间的阻滞层,从而加大了传质效率。
同时冲击流对动植物细胞组织产生一种物理剪切力,使之变形、破裂,并释放出内含物,大大加速了提取过程。
与传统方法比较,溶剂提取法需要加热、费时,而超声法提取法操作简单、省时,最主要的是提取效率高。
作为中药提取的新工艺,具有良好的应用前景。
我们在超声提取实验中发现，提取不同的植物有效成分，选择不同的参数会出现不同的结果;即使是提取同一植物有效成分也会因参数的不同而得到不同的实验果。
因此在超声提取植物有效成分时，找到适宜的参数是提高提出率的关键，只有选择合理的参数，使液体达到最大的空化状态，才能获得良好的提取效果。
超声提取植物有效成分时，溶剂种类及其浓度也是影响提出率的关键因素。
在选择提取用的溶剂时，最好能结合植物有效成分的理化性质进行筛选，如本试验提取黄酮，结合黄酮的性质，我们采用了不同浓度的乙醇溶液。
当然，本研究的实验条件主要适用于实验室,大生产的实验条件和仪器等有待于进一步研究。
参考文献：
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致谢
本文的试验、写作的完成，得到了刘胜贵老师的精心指导和帮助，在此我表示由衷的感谢!
同时感谢李胜华老师在本文试验过程中对我的帮忙指点!
感谢生物工程系的领导和老师大学四年对我的照顾和培养！
另外，还要感谢李娟、简硕俨、彭斯文等同学在实验上给予的帮助，让我能更顺利的完成我的实验。
张祺玲
2007年5月10日
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