γδT细胞在变应原雾化吸入减敏防治过敏性支气管哮喘中的作用.docx

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γδT细胞在变应原雾化吸入减敏防治过敏性支气管哮喘中的作用

γδT细胞在变应原雾化吸入减敏防治过敏性支气管哮喘中的作用

姜晓红,李超乾*,何英,邓家珍,覃惠清,梁国容

【摘要】　　目的:

探讨γδT细胞在过敏性支气管哮喘发病机制中的作用。

方式:

来自门诊的40例粉尘螨和屋尘螨点刺阳性、部份操纵过敏性支气管哮喘患者随机分为常规医治组（A组）和吸入减敏组（B组）,每组各20例。

所有患者同意相同的基础医治,常规医治组雾化吸入生理盐水5mL、吸入减敏组雾化吸入特异性变应原,每周2次,持续6个月。

医治前后用流式细胞术（FCM）检测外周血及诱导痰中γδT细胞占淋巴细胞百分比;IL4+、IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比。

结果:

医治后B组外周血、诱导痰中γδT细胞占淋巴细胞百分比低于医治前;B组外周血和诱导痰中IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比增高。

结论:

特异性变应原雾化吸入减敏疗法有效防治哮喘可能与γδT细胞有关;γδT细胞可能参与哮喘发病机制。

【关键词】减敏哮喘γδT细胞IL4IFNγ

　　[Abstract]AIM:

ToexploretheroleofγδTcellsinthepathogenesisofallergicbronchialasthma.METHODS:

FortypatientswithandDerfallergyandpartlycontrolledasthmawereinvolvedinarandomstudy.Besidesthefactthatallpatientsweretreatedwithsamebasictreatment.PatientsingroupAwerenebulizedwith5mLnormalsalinewhilegroupBwithspecificallergentwiceaweekforsixmonths.ThepercentageofγδTcellsinperipheralbloodandinducedsputumandthepercentageofIL4+andIFNγ+γδTcellsweredetectedbyflowcytometry（FCM）beforeandaftertreatment.RESULTS:

ThepercentageofγδTcellsingroupBdecreasedaftertreatment,andthepercentageofIFNγ+γδTcellsinbothperipheralbloodandinducedsputumincreasedsignificantlyingroupBthanthatingroupA.CONCLUSION:

γδTcells,whichmayparticipateinthepathogenesisofbronchialasthma,maycontributetothepreventionandtreatmentofbronchialasthmabydesensitizationofallergennebulization.

　　［Keywords］hyposensitization;asthma;gamma/deltaTcells;interleukin4;interferonγ

　　支气管哮喘是呼吸道常见病,其病因和发病机制相当复杂,给临床防治带来必然的困难。

特异性变应原免疫疗法是惟一针对哮喘病因的医治方式,自20世纪80年代以来,由于抗原进一步提纯标化,注射方式标准化,免疫减敏疗法进一步被确信[1]。

变应原雾化吸入减敏疗法是改变减敏途径的新的免疫疗法,李超乾等[2]在大鼠哮喘模型中成功进行了特异性变应原雾化吸入减敏,并发觉其与皮下减敏有着相类似的细胞、分子机制,提示该方式应用于临床的良好基础、前提和可行性。

γδT细胞是哮喘发病机制中的重要细胞。

咱们要紧探讨特异性变应原雾化吸入减敏疗法对过敏性支气管哮喘的防治作用及与γδT细胞的关系。

　　1材料和方式

　　材料PEantihumanIL4、PEantihumanIFNγ、FITCantihumanTCRgammadelta及同型对照均购自美国Ebioscience公司。

Intraprep透膜剂、PECY5antihumanCD45购自美国Backmancoulter公司。

Ionnmycin、Monensin、PMA、BFA为美国Sigma公司产品。

阿罗格点刺液及阿罗格变应原购自德国默克·阿罗格制药。

KCW1S型超声雾化器购自南通杰西电器有限责任公司。

MasterScope肺功能检测仪购自德国耶格公司。

流式细胞仪为美国Backmancoulter公司产品。

　　方式

　　实验分组依照GINA哮喘诊断标准,确诊为部份操纵,皮肤过敏原测试粉尘螨、屋尘螨阳性的门诊哮喘患者40例,其中男23例,女17例,年龄16～47±岁,无心、肝或肾疾患,近期无感染史,医治前3个月未利用过激素和免疫调剂剂。

随机分为A（常规医治组）、B（吸入减敏组）2组,每组各20例。

　　变应原的配制在无菌条件下,使劲将浓度3级液摇匀,吸取mL,加入到装有mL溶媒的瓶子中,摇匀,稀释后当即写上“浓度2级”、患者的姓名、及稀释时刻。

以此类推,别离配制“浓度1级”、“浓度0级”、“浓度1级”、“浓度2级”、“浓度3级”液,于4℃保留备用。

　　基础医治评判患者临床综合指标,填写《支气管哮喘病情调查表》及《知情同意书》。

所有患者同意相同的基础医治,吸入替卡松/沙美特罗50/100μg（商品名:

舒利迭,含氟替卡松和沙美特罗2种成份,葛兰素史克公司）,2次/d。

按需吸入短效β2受体兴奋剂（商品名:

喘乐宁,每揿100μg,葛兰素威康公司）两喷。

　　分组医治A组雾化吸入生理盐水5mL每周2次,持续6个月。

B组雾化吸入特异性变应原,起始浓度以皮试强度而决定:

皮试强度+,起始浓度1级;皮试强度++,起始浓度2级;皮试强度>+++,起始浓度-3级。

以起始浓度的第一个最小剂量mL+5mL生理盐水雾化吸入,雾化终止后观看30min。

剂量依次递增为、、、、和mL吸入6次后再提高一个浓度级进行雾化吸入。

注意事项,常规预备肾上腺素、地塞米松、平稳液等急救药品和物品。

嘱患者做深慢呼吸,吸气后屏气,以助于雾化颗粒沉积于下气道和肺泡。

严格遵循雾化吸入距离时刻,若是吸入时发动气紧、咳嗽、咽痒等病症,当即停止本次医治,下次脱敏变应原浓度降低。

患者在医治当天要幸免体力活动（幸免饮酒、热水浴等）。

　　诱导痰及痰标本的制作用高渗盐水诱导痰,其具体操作步骤采纳Pin改良法[3],搜集足量痰液于刻度离心管,用吸管去粘液、唾液、分泌物后,加入4倍体积1g/L的DTT（二硫苏糖醇）,用吸管轻轻吹打均匀,37℃水浴15min、每隔5min轻微搅拌1次形成细胞悬液,用200目铜网过滤痰液以除去杂物,以1200r/min离心7min,离心弃上清后加入PBS液500μL,余与下同。

　　淋巴细胞的活化取枸椽酸钠抗凝的外周血2mL,室温放置。

取500μL抗凝血（痰标本）,加入500μL含PMA（25μL）、Ionomycin（20μL）、BFA（20μL）、MonensinμL）、含胎牛血清的RPMI1640培育液,混匀。

37℃、50mL/LCO2培育箱培育4h。

　　诱导痰及外周血中γδT细胞占淋巴细胞百分比及IL4+、IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比测定将经淋巴细胞活化的外周血和诱导痰标本分A、B、C3管,每管100μL,均加入PECY5antihumanCD4510μL,A管加FITCIgG120μL,B、C管加入FITCantihumanγδTCR20μL、室温暗处孵育20min,3管均加入Intraprep#1100μL、室温暗处孵育15min后,加入PBS液4mL,1500r/min,离心5min,弃上清,加入Intraprep#2100μL,室温暗处孵育5min,A管加入PEIgG110μL、B、C管别离加入PEantihumanIL4、PEantihumanIFNγ各5μL,室温暗处孵育20min,均加入PBS液4mL,1500r/min,离心5min,弃上清,溶血机溶血（痰标本中加入PBS液500μL）。

　　FCM检测打开细胞仪及氩离子激光光源（488nm）,预热20min,仪器自动初始化,用标准荧光微球进行光路与流路校准,所有荧光信号的变异系数（CV）均<2%,在侧向散射光（SS）为纵坐标,CD45PCY5为横坐标的二维散点图中设门选定CD45阳性淋巴细胞,别离用γδT和IL4及γδT和IFNγ成立单参数直方图对CD45设门选定的淋巴细胞进行分析,得出CD45+γδT细胞百分比,IL4+γδT细胞、IFNγ+γδT细胞的百分比。

全数数据经流式细胞仪的SYSTEMⅡ软件获取和分析。

　　统计学处置应用统计软件包进行分析。

医治前、后比较采纳配对t查验,两组γδT细胞优势表达比较采纳χ2查验,P<为有统计学意义。

　　2结果

　　诱导痰及外周血中γδT细胞占淋巴细胞百分比测定结果医治后B组外周血和诱导痰中γδT细胞占淋巴细胞百分比低于医治前（表1）。

　　表1医治前后两组γδT细胞占淋巴细胞百分比（略）

　　Tab1PercentageofγδTcellsinlymphocytesaftertherapyandbefore

　　aP<,bP<vsbeforetherapy.

　　诱导痰及外周血中IL4+、IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比测定结果IL4+γδT细胞代表Th2优势,IFNγ+γδT细胞代表Th1优势,医治后B组外周血及诱导痰中γδT细胞表现为Th1优势表达,两组比较有统计学意义（表2）。

　　表2医治后两组γδT细胞优势表达比较（略）

　　Tab2ThedominanceofγδTcellsaftertherapy

　　aP<,bP<vsgroupA.

　　3讨论

　　支气管哮喘目前尚不能根治,但通过系统、标准的医治,可达到良好的操纵[4]。

关于过敏性支气管哮喘而言,最重要的一点确实是尽可能幸免接触变应原,实在不能幸免者,变应原特异性免疫疗法是针对病因的一种医治方式,可减轻哮喘病症和降低气道反映性。

最近的研究发觉[5]经皮下注射特异性变应原1～5年后,老年哮喘患者病症操纵>50%。

Olsen等[6]对哮喘患者经特异性变应原皮下脱敏医治1年后发觉过敏性哮喘患者病症改善,肺功能明显增加。

　　一直以来大伙儿以为支气管哮喘患者表现为Th1功能不足,Th2功能亢进,Th1/Th2比值低于正常[7]。

本研究结果显示,经特异性变应原雾化吸入减敏后外周血和诱导痰中γδT细胞占淋巴细胞百分比恢复了正常水平,外周血和诱导痰中IFNγ+γδT细胞占淋巴细胞百分比增高。

特异性变应原雾化吸入后患者哮喘病症改善,其缘故有可能是变应原长期刺激引发的免疫耐受。

从实验结果看,随着病症的改善,外周血和诱导痰中γδT细胞数量明显减少,且分泌较高水平的IFNγ,抑制了IL4的产生,进而抑制变应原特异性IgE的产生,从而减缓哮喘病症,提示γδT细胞可能参与了支气管哮喘的发病机制。

同时,特异性变应原反复雾化吸入长期刺激有可能从全然上医治过敏性支气管哮喘的发生,从理论上讲有望达到对过敏性支气管哮喘的根治。

　　特异性变应原雾化吸入防治过敏性支气管哮喘的方式方才应用于临床,成效明显,未见不良反映发生,平安可行,但必需要在严格的医护条件下进行。

目前存在的问题是标准患者雾化吸入的方式,积存样本,使该方式可在家中平安进行,从而对过敏性支气管哮喘的防治起到必然的作用。

【参考文献】

　　[1]钟南山.以后十年哮喘防治展望［J］.有效医学杂志,2001,17（6）:

471-472.

　　[2]李超乾,徐永健,杨丹蕾,等.大鼠支气管哮喘模型特异性致敏原吸入减敏疗法的研究［J］.中华内科杂志,2003,42（4）:

284-285.

　　[3]PinI,GibsonPG,KolendowiczR,etal.Inducedsputumcellcounts:

anoninvasivemethodtoinvestigateairwayinflammationinasthma［J］.Thorax,1992,47

（1）:

25-29.

　　[4]孔灵菲.最新全世界哮喘防治指南解读[J].中国有效内科杂志,2007,27（4）:

255-257.

　　[5]AseroR.Efficacyofinjectionimmunotherapywithragweedandbirchpolleninelderlypatients［J］.IntArchAllergyImmunol,2004,135（4）:

332-335.

　　[6]OlsenOT,LarsenKR,JacobsanL,etal.A1year,placebocontrolled,doubleblindhousedustmiteimmunotherapystudyinasthmaticadults［J］.Allergy,1997,52（8）:

853-859.

　　[7]MagnanAO,MeyLG,CaamilaCA,etal.AssessmentoftheTh/Th2paradigminwholebloodinatopyandIFNγproducingCD8Tcellsinasthma［J］.AmJRespirCritCareMed,2000,161（6）:

1790-1796.