食品中那非类物质的测定BJS05doc.docx

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食品中那非类物质的测定

（BJS201805）

1范围

本标准规定了食品（含保健食品）基质中90种那非类物质的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。

标准中方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的定性和定量测定。

标准中方法二超高效液相色谱-串联高分辨质谱法，适用于饮料、果冻、蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、酒类及咖啡等食品（含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊、软胶囊等剂型）中90种那非类物质的筛查和定性确证。

方法一超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法

2原理

试样经甲醇超声提取，过滤后，滤液供超高效液相色谱—三重四极杆串联质谱仪测定，外标法定量。

3试剂和材料

注：

水为GB/T6682规定的一级水。

3.1试剂

3.1.1甲醇（CH3OH）：

质谱级。

3.1.2甲酸（HCOOH）：

质谱级。

3.1.3乙酸乙酯（C4H8O2）：

分析纯。

3.1.4盐酸（HCl）：

分析纯。

3.2试剂配制

3.2.10.1%甲酸水溶液：

取甲酸1mL用水稀释至1000mL，用滤膜（4.3）过滤后备用。

3.2.2盐酸甲醇溶液（1+99）：

取盐酸1mL用甲醇稀释至100mL。

3.2.3甲醇水溶液（1+1）：

将甲醇与水等体积混合。

3.3标准品

西地那非等90种物质标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见附录A表A.1，纯度≥98%。

3.4标准溶液配制

3.4.1标准储备液（200μg/mL）：

分别精密称取Lodenafilcarbonate（46罗地那非碳酸酯）、Sildenafildimerimpurity（63西地那非二聚体杂质）、Vardenafildimer（69伐地那非二聚体）标准品（3.3）各10mg，用盐酸甲醇溶液（1+99）溶解并稀释至50mL，摇匀；分别精密称取其余87种标准品（3.3）各10mg，用甲醇溶解并稀释至50mL，摇匀，制成浓度为200μg/mL标准储备液。

-20℃避光贮存，有效期3个月。

3.4.2混合标准中间工作溶液（1μg/mL）：

分别准确吸取标准储备液（200μg/mL）（3.4.1）各0.1mL，用甲醇稀释至20mL，摇匀，制成1μg/mL的混合标准工作溶液。

临用新制。

根据化合物保留时间适当分组。

3.4.3混合标准工作溶液：

分别准确吸取混合标准中间工作液（1μg/mL）（3.4.2）适量，用甲醇水溶液（1+1）（3.2.3）稀释，摇匀，作为系列混合标准工作溶液，浓度依次为各化合物2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L，临用新制或依仪器响应情况配制适当浓度的混合标准工作溶液。

或根据需要采用空白基质提取液（5.1.4），配制适当浓度的基质混合标准工作溶液。

4仪器和设备

4.1高效液相色谱-串联质谱仪，配电喷雾（ESI）离子源。

4.2天平：

感量分别为0.01mg和0.1mg。

4.3微孔滤膜：

0.22µm，有机相型。

4.4离心机：

转速≥4000r/min。

4.5超声波清洗器。

5分析步骤

5.1试样制备

5.1.1固态或半固态试样

取固态试样（蛋白粉、牡蛎粉、饼干、糖果、咖啡及含与上述基质相同的保健食品及片剂、胶囊等剂型）适量混匀，研细，或取半固态试样（果冻）适量混匀，精密称取1g（精确至0.001g）置于50mL容量瓶中，加甲醇（3.1.1）适量，超声提取15min，放冷至室温，用甲醇（3.1.1）定容，转移至50mL离心管中，4000r/min离心5min，上清液经微孔滤膜过滤（4.3），取续滤液，根据实际浓度用甲醇水溶液（1+1）（3.2.3）适当稀释至线性范围内，备用。

5.1.2液态试样

取试样（饮料、酒）适量摇匀，准确吸取1mL置于50mL容量瓶中，加甲醇（3.1.1）适量，超声提取15min，放冷至室温，用甲醇（3.1.1）定容，经微孔滤膜（4.3）过滤，取续滤液，根据实际浓度用甲醇水溶液（1+1）（3.2.3）适当稀释至线性范围内，备用。

5.1.3油脂基质（软胶囊）试样

取试样（软胶囊）适量混匀，精密称取1g（精确至0.001g）置于50mL容量瓶中，加乙酸乙酯5mL，振摇，使其分散，加甲醇（3.1.1）适量，超声提取15min，放冷至室温，用甲醇（3.1.1）定容，转移至50mL离心管中，4000r/min离心5min，上清液经微孔滤膜过滤（4.3），取续滤液，根据实际浓度用甲醇水溶液（1+1）（3.2.3）适当稀释至线性范围内，备用。

5.1.4空白基质提取液

称取空白试样适量，与试样同法处理，制得空白基质提取液。

5.1.5空白溶液

不加试样，与试样同法处理，制得空白溶液。

5.2仪器参考条件

5.2.1色谱条件

a）色谱柱：

AgilentEclipsePlusC18（3.0×150mm，1.8µm），或性能相当者。

b）流动相：

A为0.1%甲酸水溶液（3.2.1），B为甲醇（3.1.1），梯度洗脱程序见表1。

c）流速：

400μL/min。

d）柱温：

35℃。

e）进样量：

5μL。

表1梯度洗脱程序表

梯度时间/min

流动相A/%

流动相B/%

0

90

10

1

50

50

16

35

65

19

2

98

22

2

98

22.1

90

10

25

90

10

5.2.2质谱条件

a）离子源：

电喷雾离子源（ESI源）。

b）检测方式：

多反应离子监测（MRM）。

c）碰撞气为高纯氮气，干燥气、雾化气、鞘气等均为氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，毛细管电压、干燥气温度、鞘气温度、鞘气流量、喷嘴电压、碰撞能量、碎裂电压等参数应优化至最佳灵敏度，监测离子对和定量离子对等信息详见附录B。

5.3定性测定

按照超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱条件测定试样和标准工作溶液，记录试样和标准溶液中各化合物的色谱保留时间，当试样中检出与某标准品色谱峰保留时间一致的色谱峰（变化范围在±2.5%之内），并且试样色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比（k）的偏差不超过表2规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。

表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度（%）

k＞50%

50%≥k＞20%

20%≥k＞10%

k≤10%

允许的最大偏差（%）

±20

±25

±30

±50

5.4定量测定

5.4.1标准曲线的制作

将混合标准工作溶液（3.4.3）分别按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到相应的标准溶液的色谱峰面积。

以混合标准工作溶液的浓度为横坐标，以定量离子的色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

5.4.2试样溶液的测定

将试样溶液（5.1.1-5.1.3）按仪器参考条件（5.2）进行测定，得到样品溶液中对应组分的色谱峰面积。

根据标准曲线得到待测液中组分的浓度，平行测定次数不少于两次。

对照品色谱图参见附录D。

5.4.3空白溶液的测定

空白溶液（5.1.5）同试样溶液测定步骤操作。

6结果计算

将液相色谱-质谱测得浓度代入下式计算含量：

…………………………………………

（1）

式中：

X—试样中各待测物的含量，单位为毫克每千克或毫克每升（mg/kg或mg/L）；

c—从标准曲线中读出的供试品溶液中各待测物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；

V—样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；

m—试样溶液所代表的质量，单位为克（g或L）；

f—稀释倍数。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

7精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

8其他

当称样量为1g（精确至0.001g）或1mL，定容体积为50mL时，本方法中90种那非类物质的检出限均为为0.05~1mg/kg或0.05~0.25mg/L，定量限为0.1~2.5mg/kg或0.1~0.5mg/L。

详见附录C表C.1。

空白试验应无干扰。

方法二超高效液相色谱-串联高分辨质谱法

2原理

试样经甲醇超声提取，过滤后，滤液供高效液相色谱-串联高分辨质谱测定，比较供试品与标准品的保留时间、一级质谱图和二级质谱图进行筛查和定性确证。

3试剂和材料

注：

水为GB/T6682规定的一级水。

3.1试剂

3.1.1乙腈（C2H3N）：

质谱级。

3.1.2甲酸（HCOOH）：

质谱级。

3.1.3甲醇（CH3OH）：

分析纯。

3.1.4乙酸乙酯（C4H8O2）：

分析纯。

3.1.5盐酸（HCl）：

分析纯。

3.2试剂配制

3.2.10.1%甲酸水溶液：

取甲酸1mL用水稀释至1000mL，用滤膜（4.3）过滤后备用。

3.3标准品

同方法一3.3标准品项下。

3.4标准溶液配制

3.4.1标准储备液（200μg/mL）：

同方法一3.4.1标准储备液项下。

3.4.2混合标准工作溶液（1μg/mL）：

同方法一3.4.2混合标准中间工作溶液项下。

或依仪器响应情况配制至适当浓度。

根据化合物保留时间和仪器扫描速度适当分组。

4仪器和设备

4.1高效液相色谱-串联高分辨质谱仪，配有电喷雾（ESI）离子源。

4.2天平：

感量分别为0.1mg和1mg。

4.3滤膜：

0.22µm，有机相型。

4.4超声波发生器。

5分析步骤

5.1试样制备

5.1.1试样处理

同方法一试样制备5.1.1～5.1.3项下，根据实际浓度适当稀释，备用。

5.1.2空白溶液制备

同方法一空白溶液制备5.1.5项下。

5.2仪器参考条件

5.2.1色谱条件

a）色谱柱：

AgilentPoroshell120SB-C18（3.0×75mm，2.7µm），或性能相当者。

b）流动相：

A为0.1%甲酸水溶液（3.2.1），B为乙腈（3.1.1），梯度洗脱程序见表3。

c）流速：

0.4mL/min。

d）柱温：

30℃。

e）进样量：

1μL。

表3梯度洗脱程序表

梯度时间/min

流动相A/%

流动相B/%

0

95

5

15

2

98

17

2

98

17.5

95

5

20

95

5

5.2.2质谱条件

a）离子源：

电喷雾离子源（ESI源）。

b）干燥气、雾化气、鞘气、碰撞气等均为高纯氮气或其他合适气体，使用前应调节相应参数使质谱灵敏度达到检测要求，毛细管电压、干燥气温度、鞘气温度、鞘气流量、喷嘴电压、碰撞能量、碎裂电压等参数应优化至最佳灵敏度，母离子及碎片离子等参考信息详见附录E表E.1。

6定性判定

按照超高效人液相色谱-串联高分辨质谱条件测定试样（5.1.1）和混合标准工作溶液（3.4.2），记录试样和混合标准工作溶液中各化合物的色谱峰保留时间及多级质谱图，当试样中检出与某标准品色谱峰（或由标准品建立的谱库）保留时间一致的色谱峰，并且与标准品母离子精确分子量误差不超过百万分之五，主要碎片离子精确分子量误差不超过百万分之十，即可以确定试样中检出相应化合物。

7检测方法的灵敏度和专属性

7.1灵敏度

当取样量为1g或1mL，定容体积为50mL时，本方法中90种化合物的检出限为0.1~70mg/kg或0.1~50mg/L，详见附录F表F.1。

7.2专属性

取空白溶液（5.1.2）进样测定，应无干扰。

取混合标准工作溶液（3.4.2）进样测定，各化合物之间应无互相干扰，同分异构体应可通过保留时间或二级质谱图进行区分。

附录A

西地那非等90种化合物相关信息

表A.190种化合物英文名称、中文名称、分子式、CAS号、相对分子质量

序号

英文名

中文名

分子式

CAS号

分子量

1

Sildenafil

西地那非

C22H30N6O4S

139755-83-2

474.6

2

Tadalafil

他达拉非

C22H19N3O4

171596-29-5

389.4

3

Imidazosagatriazinone

脱硫伐地那非

C17H20N4O2

139756-21-1

312.4

4

Gendenafil

庆地那非

C19H22N4O3

147676-66-2

354.4

5

Acetilacid

那非乙酰酸

C18H20N4O4

147676-78-6

356.4

6

Xanthoanthrafil

苯酰胺那非

C19H23N3O6

1020251-53-9

389.4

7

Aminotadalafil

氨基他达拉非

C21H18N4O4

385769-84-6

390.4

8

Chloropretadalafil

他达拉非甲基氯化物

C22H19ClN2O5

171489-59-1

426.8

9

Piperiacetildenafil

苯噻啶红地那非

C24H31N5O3

147676-50-4

437.5

10

Noracetildenafil

那红地那非

C24H32N6O3

949091-38-7

452.5

11

Carbodenafil

卡巴地那非

C24H32N6O3

944241-52-5

452.5

12

Pseudovardenafil

伪伐地那非

C22H29N5O4S

224788-34-5

459.6

13

Norneosildenafil

那莫西地那非

C22H29N5O4S

371959-09-0

459.6

14

N-Desethylvardenafil

N-去乙基伐地那非

C21H28N6O4S

448184-46-1

460.6

15

N-Desmethylsildenafil

N-去甲基西地那非

C21H28N6O4S

139755-82-1

460.6

16

Acetildenafil

红地那非

C25H34N6O3

831217-01-7

466.6

17

Hydroxyacetildenafil

羟基红地那非

C25H34N6O4

147676-56-0

482.6

18

Avanafil

阿伐那非

C23H26ClN7O3

330784-47-9

484.0

19

Aildenafil

艾地那非

C23H32N6O4S

496835-35-9

488.6

20

Homosildenafil

豪莫西地那非

C23H32N6O4S

642928-07-2

488.6

21

Vardenafil

伐地那非

C23H32N6O4S

224785-90-4

488.6

22

Thiosildenafil

硫代西地那非

C22H30N6O3S2

479073-79-5

490.6

23

Thiohomosildenafil

硫代豪莫西地那非

C23H32N6O3S2

479073-80-8

504.7

24

Hydroxyvardenafil

羟基伐地那非

C23H32N6O5S

224785-98-2

504.6

25

Hydroxyhomosildenafil

羟基豪莫西地那非

C23H32N6O5S

139755-85-4

504.6

26

Udenafil

乌地那非

C25H36N6O4S

268203-93-6

516.7

27

Hydroxythiohomosildenafil

羟基硫代豪莫西地那非

C23H32N6O4S2

479073-82-0

520.7

28

Norneovardenafil

那莫伐地那非

C18H20N4O4

358390-39-3

356.4

29

Nitrodenafil

硝地那非

C17H19N5O4

147676-99-1

357.4

30

Nortadalafil

去甲基他达拉非

C21H17N3O4

171596-36-4

375.4

31

Chlorodenafil

氯地那非

C19H21ClN4O3

1058653-74-9

388.8

32

Hydroxychlorodenafil

羟基氯地那非

C19H23ClN4O3

1391054-00-4

390.9

33

N-Butyltadalafil

N-丁基他达拉非

C25H25N3O4

171596-31-9

431.5

34

Desmethylcarbodenafil

去甲基卡巴地那非

C23H30N6O3

147676-79-7

438.5

35

Descarbonsildenafil

去碳西地那非

C21H30N6O4S

1393816-99-3

462.6

36

Dimethylacetildenafil

二甲基红地那非

C25H34N6O3

1290041-88-1

466.6

37

Dithio-desmethylcarbodenafil

二硫代去甲基卡巴地那非

C23H30N6OS2

1333233-46-7

470.7

38

Oxohongdenafil

酮红地那非

C25H32N6O4

1446144-70-2

480.6

39

N-Octylnortadalafil

N-辛基去甲他达拉非

C29H33N3O4

1173706-35-8

487.6

40

Dioxohongdenafil

双酮红地那非

C25H30N6O5

1609405-33-5

494.5

41

Hydroxythiovardenafil

羟基硫代伐地那非

C23H32N6O4S2

912576-30-8

520.7

42

Cyclopentynafil

环戊那非

C26H36N6O4S

1173706-34-7

528.7

43

Propoxyphenylthiohydroxyhomosildenafil

丙氧苯基硫代羟基豪莫西地那非

C24H34N6O4S2

479073-90-0

534.7

44

Benzylsildenafil

苄西地那非

C28H34N6O4S

1446089-82-2

550.7

45

Cinnamyldenafil

桂地那非

C32H38N6O3

1446089-83-3

554.7

46

Lodenafilcarbonate

罗地那非碳酸酯

C47H62N12O11S2

398507-55-6

1035.2

47

Propoxyphenylsildenafil

丙氧苯基西地那非

C23H32N6O4S

877777-10-1

488.6

48

Depiperazinothiosildenafil

脱哌嗪基硫代西地那非

C17H20N4O4S2

1353018-10-6

408.5

49

Acetaminotadalafil

乙酰胺基他达拉非

C23H20N4O5

1446144-71-3

432.4

50

2-Hydroxypropylnortadalafil

2-羟丙基去甲他达拉非

C24H23N3O5

1353020-85-5

433.5

51

Acetylvardenafil

乙酰伐地那非

C25H34N6O3

1261351-28-3

466.6

52

Propoxyphenylhydroxyhomosildenafil

丙氧苯基羟基豪莫西地那非

C24H34N6O5S

139755-87-6

518.6

53

Propoxyphenylthioaildenafil

丙氧苯基硫代艾地那非

C24H34N6O3S2

856190-49-3

518.7

54

Yohimbine

育亨宾

C21H26N2O3

146-48-5

354.4

55

Dapoxetine

达泊西汀

C21H23NO

119356-77-3

305.4

56

N-Desethylacetildenafil

N-去乙基红地那非

C23H30N6O3

147676-55-9

438.5

57

Desmethylthiosildenafil

去甲基硫代西地那非

C21H28N6O3S2

479073-86-4

476.6

58

N-Boc-N-desethylacetildenafil

N-叔丁氧羰基-N-去乙基红地那非

C28H38N6O5

1246820-46-1

538.6

59

N-Ethyltadalafil

N-乙基他达拉非

C23H21N3O4

1609405-34-6

403.4

60

O-Desethylsildenafil

O-去乙基西地那非

C20H26N6O4S

139755-91-2

446.5

61

PyrazoleN-desmethylsildenafil

吡唑N-去甲基西地那非

C21H28N6O4S

139755-95-6

460.6

62

Isobutylsildenafil

异丁基西地那非

C23H32N6O4S

1391053-95-4

488.6

63

Sildenafildimerimpurity

西地那非二聚体杂质

C38H46N10O8S2

1346602-67-2

835.0

64

Vardenafiloxopiperazine

伐地那非哌嗪酮

C21H26N6O5S

448184-58-5

474.5

65

SildenafilN-oxide

西地那非N-氧化物

C22H30N6O5S

1094598-75-0

490.6

66

VardenafilN-oxide

伐地那非N-氧化物

C23H32N6O5S

448184-48-3

504.6

67

2-Hydroxyethylnortadalafil

2-羟乙基去甲他达拉非

C23H21N3O5

385769-94-8

419.4

68

Vardenafilacetylanalogue

伐地那非乙酰基类似物

C24H31N5O3

/

437.5

69

Vardenafildimer

伐地那非二聚体

C38H46N10O8S2

1255919-03-9

835.0

70

Mirodenafil

米罗那非

C26H37N5O5S

862189-95-5

531.7

71

Mutaprodenafil

亚硝地那非

C27H35N9O5S2

1387577-30-1

629.8

72

Thioquinapiperfil

硫喹哌非

C24H28N6OS

220060-39-9

448.6

73

Aminosildenaf