利用苹果渣制备酒精的工艺研究2.docx

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利用苹果渣制备酒精的工艺研究2

利用苹果渣制备酒精的

工艺研究

太原理工大学

2008年7月

利用苹果渣制备酒精的工艺研究

本文阐述了鲜苹果渣的营养成分，以及开发果渣发酵生产酒精的可能性和重要意义，并就苹果渣的综合利用途径作了综述。

以鲜苹果渣为原料，利用单因素试验选择苹果渣的最佳糖化工艺条件和最佳发酵的工艺条件。

糖化过程以及热处理时间、酶作用时间、酶用量作为讨论因素，运用正交实验，优化最佳条件；发酵过程中以发酵液的起始pH值、酒用干酵母的添加量、发酵温度以及发酵时间作为讨论因素，运用正交实验，优化最佳条件。

结果表明，糖化过程中最佳的蒸煮时间为30分钟，纤维素酶的最适用量是0.3334µmol·s-1/50g苹果渣，最适宜的酶作用时间是6小时，在此酶解条件下，与空白相比，原料还原糖的净增率为97.45%；发酵过程中最适的pH值为4，酒用干酵母的最适添加量为0.4‰，最适的发酵温度是25℃。

在此条件下，苹果渣的乙醇产率达178.40ml/kg干物质。

实验部分

1．实验仪器：

实验中所用的主要仪器设备如表1所示

表1实验仪器规格一览表

Table1Theexperimentwithinstrumentandtype

名称

规格

产地

旋转蒸发器

RE-52B

上海亚荣生化仪器厂

循环水式真空泵

SHZ-D3

巩义市子华仪器有限公司

手提式压力蒸汽消毒器

GMSX-280

北京市永光明医疗仪器厂

电热鼓风干燥箱

101-1A

天津市泰斯特仪器有限公司

PHS-3C精密PH计

E-201-C

上海精密科学仪器有限公司

台式冷冻恒温振荡器

THZ-C-1

太仓市实验设备厂

双人双面净化工作台

SW-CJ-2F

苏州净化设备有限公司

架盘药物天平

HC-TP11-1

上海精密科学仪器有限公司

电子万用炉

DL-1

北京市永光明医疗仪器厂

2．实验原料及试剂：

实验中所用的主要原料及试剂如表2所示

表2实验原料及试剂一览表

Table2Theexperimentwithmaterialandreagent

名称

规格

产地

苹果渣

自制

柠檬酸

试剂纯

天津市科密欧化学试剂有限公司

NaHCO3

试剂纯

天津市化学试剂三厂

糖化酶

10万u/g

河北胜利酶制剂有限公司

纤维素酶

酶活力＞15u/mg

上海源聚生物科技有限公司

果胶酶

40u/mg

山西瑞世化工有限公司

葡萄糖

试剂纯

天津市大茂化学试剂厂

CuSO4

试剂纯

天津市大茂化学试剂厂

NaOH

试剂纯

天津市北方天医化学试剂厂

酒用干酵母

工业级

烟台马利酵母有限公司

3．实验方案的确定

（1）糖化部分

糖化部分分为四个步骤分别为热处理、酶解、糖化及还原糖的测定。

还原糖的含量为糖化效果的检测指标，而影响糖化效果的主要因素有热处理的方式、酶解时间及酶用量。

试验的具体步骤如下。

热处理是利用水蒸汽的热能使鲜苹果渣中植物组织和细胞彻底破裂，原料内含的淀粉质吸水膨胀破裂，使淀粉由颗粒变成溶解状态的糊液，易于受后续添加的酶作用，增加还原糖的转化率，同时对原料灭菌，以利于发酵，热处理的时间将直接影响到还原糖的含量，所以本实验中将热处理的时间作为一项主要的影响因素来加以讨论。

在本实验中添加的酶有：

纤维素酶、果胶酶和糖化酶。

这三种酶中纤维素酶对还原糖含量的影响最大，因为纤维素是植物细胞壁的主要成分，是鲜苹果渣中储藏量较高的植物多糖物质之一。

以干物质计，苹果渣粗纤维含量16.8g/kg。

用纤维素酶能将苹果渣中的纤维素有效转化为可发酵性糖（糖化），有利于提高苹果渣发酵乙醇的产率。

而纤维素酶作用的时间与添加量不同，将会直接影响到生产成本和糖化效果。

所以纤维素酶的作用时间及添加量为两个重要的影响因素来加以讨论。

最佳糖化工艺条件的选择具体步骤如下。

①热处理

称取50g鲜苹果渣9份，调pH值至4.5左右，分别进行以下3种处理：

Ⅰ常压蒸煮处理20min；Ⅱ常压蒸煮处理30min；Ⅲ常压蒸煮处理40min。

分别冷却至50℃后加入占苹果渣质量分数0.1%的果胶酶，在50℃培养箱中作用6h，测定还原糖含量。

②不同酶解时间的试验

称取50g鲜苹果渣9份，加入0.3334µmol/s的纤维素酶，用柠檬酸或碳酸氢钾调酸度至适于酶作用的pH值4.5，在50℃下分别酶解0、5、7、9h，测定还原糖含量。

③不同酶用量的试验

称取50g鲜苹果渣9份，常压蒸煮30min后，调pH至5.0左右，分别添0.1667，0.2501，0.3334，0.5001，0.6668µmol/s纤维素酶，密封后于50℃下酶解6h，测定还原糖含量。

④还原糖百分含量的测定

还原糖含量的测定使用斐林滴定法，其检测原理为：

水解后的葡萄糖，与斐林甲、乙液混合后，硫酸铜与氢氧化钠作用生成氢氧化铜，氢氧化铜与葡萄糖在碱性条件下，可反应生成砖红色的氧化亚铜沉淀。

实验过程中将甲乙液各5ml,加10ml水，并预先加入20ml、0.1%的标准葡萄糖溶液混合后加热，使溶液在2min内沸腾，以每分钟20滴至蓝色刚好消失，即滴定已达终点，记录滴定的葡萄糖体积。

其计算公式为：

还原糖%=

式中：

V1—空白滴定消耗0.25%葡萄糖标准溶液的体积ml；

V2—测定样品消耗0.25%葡萄糖标准溶液的体积ml；

C—葡萄糖标准溶液的浓度%；G—样品的质量g；500—定容至500ml

（2）发酵部分

发酵前先将糖化液在压力为0.05MPa条件下，高压灭菌30min。

发酵部分分为四个步骤，分别为菌种的活化、发酵、蒸馏及酒精度的测定。

酒精度为发酵效果的检测指标。

影响发酵效果的主要因素有：

发酵的pH值、酒用干酵母的添加量以及发酵的温度。

发酵液的pH值，对微生物生长具有非常明显的影响，也是影响发酵过程中各种酶活的重要因素。

pH值对微生物的繁殖和产物合成的影响有以下几个方面：

A影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；

B影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的排泄；

C影响培养基中某些组分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；

DpH值不同，往往引起对菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。

在本实验中，苹果渣采用NaHCO3和柠檬酸调节pH值。

调节pH值的同时又可更好地起到抑制有害微生物生成挥发酸，以免影响到酒精的风味。

众所周知,酒精生产的重要环节是发酵,而发酵的重点是酵母,所以酵母的添加量也将直接影响到酒精发酵的效果。

过大或过小的接种量都会不适合酒精的发酵。

在发酵过程中，需要维持适当的温度，才能使菌体生长和代谢产物的合成顺利地进行。

温度对发酵有很大的影响，它会影响各种酶反应的速率，改变菌体代谢产物的合成方向，影响微生物的代谢调控机制，影响发酵液的理化性质，如发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解的吸收速率等，都受温度变化的影响，进而影响发酵的动力学特性和产物的生物合成。

显然发酵液的pH值、酵母的添加量以及发酵的温度均对发酵有很大的影响。

所以本实验中将这三项加以讨论，从而确定最佳的发酵工艺条件。

最佳发酵工艺条件的选择具体步骤如下。

①菌种的活化

称取适量的酒用干酵母，加入10倍的30℃的蒸馏水，轻轻摇匀，保温15-20分钟，每10分钟震荡一次，至有大量的气泡产生时即活化完毕。

将干酵母添加到糖化液中。

在适当的条件下发酵。

用于本实验发酵的酵母为烟台市马利酵母有限公司生产的酒用干酵母。

②不同pH值的发酵试验

称取50g经过糖化处理的苹果渣即糖化液9份，将其灭菌冷却后，用柠檬酸或碳酸氢钾调节酸度，使其pH值分别为3、4、5，最后分别将活化好的酿酒酵母接入，将发酵环境温度调至25℃,发酵至5天时终止。

③不同酵母添加量的试验

称取50g经过糖化处理的苹果渣即糖化液9份，将其灭菌冷却后，用柠檬酸或碳酸氢钾调节酸度，使其pH为合适的值，再接入培养好的酿酒酵母菌种，接种量分别为0.1‰、0.5‰、0.9‰置于25℃的培养箱内，发酵至5d时终止。

④不同发酵温度的试验

称取50g经过糖化处理的苹果渣即糖化液9份，将其灭菌冷却后，调至合适的酸度，接入合适量的活化后酿酒酵母，置于温度分别为20℃、25℃、30℃的培养箱内，发酵至5d时终止。

⑤不同发酵时间的试验

称取50g经过糖化处理的苹果渣即糖化液12份，将其灭菌冷却后，调至合适的酸度，接入合适量的活化后酿酒酵母，置于25℃的培养箱内，分别发酵2d、3d、4d、5d终止。

⑥酒精产率的测定

将发酵好的苹果渣使用蒸馏装置（旋转蒸发器和循环水式真空泵）进行减压蒸馏。

取出溜出液，添加蒸馏水至400ml，测定其酒精度，将其换算为每kg干苹果渣生成的乙醇量（ml/kg）。

4．实验结果

（1）最佳糖化工艺条件的确定

实验结果如下图所示：

图1蒸煮时间对还原糖含量的影响图2纤维素酶量对还原糖含量的影响

图3酶解时间对还原糖含量的影响

由1、2、3三图可知，热处理时间即蒸煮时间为30分钟时，糖化效果最佳；酶量为0.3334µmol·s-1/50g苹果渣时，还原糖的净增率最大；糖化时间为7小时时，还原糖含量最高。

表3糖化因素水平表

Table3-1ThelevelandfactorofSaccharifies

因素

A

预处理时间/min

B

酶用量/（µmol·s-1/50g苹果渣）

C

酶作用时间/h

1

25

0.2501

6

2

30

0.3334

7

3

35

0.5001

8

表4糖化正交实验表

实验号

A

预处理时间/min

B

酶用量/（µmol·s-1/50g苹果渣）

C

酶作用时间/h

还原糖含量

g/kg

1

1

1

1

135.24

2

1

2

2

150.53

3

1

3

3

142.87

4

2

1

3

143.76

5

2

2

1

158.7

6

2

3

2

154.65

7

3

1

2

138.54

8

3

2

3

147.33

9

3

3

1

145.8

M1

428.64

417.54

439.59

M2

457.11

456.56

443.72

M3

431.67

443.32

433.96

T=1317.42

m1

142.88

139.18

146.53

y=T/9=146.38

m2

152.37

152.19

147.91

m3

143.89

147.78

144.66

R

9.49

13.01

3.25

由图1、2、3可知在单因素实验中，最佳的热处理时间为30min，纤维素酶的最适用量为0.3334µmol·s-150g苹果渣，最佳的糖化时间为7h。

以单因素实验结果为依据，拟定因素、水平，设计正交实验。

糖化效果以糖化液还原糖百分含量为指标。

对实验数据进行极差分析,从而优化最佳的糖化工艺条件。

糖化因素水平表见表3，糖化正交实验表见表34。

由交互实验的结果可知，最佳的糖化工艺条件是预处理时间为30min，纤维素酶的用量是0.3334µmol·s-1/50g苹果渣，糖化时间为6h。

（2）最佳发酵工艺条件的确定

实验结果如下图所示：

图4发酵PH对酒精产率的影响

图5接种量对酒精产率的影响

由图4、5可知，在同种条件下pH值为4时，乙醇产率最高，发酵效果最好；接种量为0.5‰时，乙醇的产率最高，发酵效果最好。

图6发酵温度对酒精产率的影响

由实验结果知，在pH值为4，接种量为0.5‰条件下，发酵温度为25℃时，乙醇产率最高。

图7发酵时间对酒精产率的影响

由实验结果知，在pH值为4，接种量为0.5‰，发酵温度为25℃的条件下，发酵时间为5天时，乙醇的产率最高。

由上述四图可知在单因素实验中可知，发酵液的最佳初始pH值为4，最适的酵母接种量为0.4‰，发酵的最适温度为25℃，最佳的发酵时间为5天。

以单因素实验结果为依据，拟定因素、水平，设计正交实验。

发酵的最终结果以乙醇的产率为指标。

对实验数据进行极差分析,从而优化最佳的发酵工艺条件。

发酵因素水平表见表5，发酵正交实验表见表6。

表5发酵因素水平表

因素

A

发酵温度/℃

B

发酵液pH值

C

酒用干酵母的添加量/‰

1

23

3.5

0.4

2

25

4

0.5

3

27

4.5

0.6

表6发酵正交实验表

实验号

A

发酵温度/℃

B

发酵液pH值

C

酒用干酵母的添加量/‰

酒精产率

mL/kg

1

1

1

1

132.21

2

1

2

2

132.72

3

1

3

3

101.41

4

2

1

3

150.23

5

2

2

1

178.40

6

2

3

2

142.72

7

3

1

2

131.46

8

3

2

3

108.17

9

3

3

1

131.46

M1

366.34

413.9

442.07

M2

457.11

419.29

359.81

M3

371.09

375.59

406.9

T=1194.54

m1

122.11

137.97

147.36

y=T/9=132.73

m2

157.12

139.76

119.93

m3

123.7

125.20

135.64

R

35.01

14.56

27.43

5．总结与建议

（1）总结

本文研究了利用苹果渣生产酒精的糖化工艺和发酵工艺。

主要结论如下：

①采用正交实验，确定了糖化的最佳工艺条件为：

热处理时间30min，纤维素酶用量0.3334µmol·s-1/50g苹果渣，纤维素酶的作用时间是6h。

发酵的最佳工艺为：

发酵液的初始pH值为4，酵母的接种量为0.4‰，发酵温度为25℃。

②在糖化过程中采取最佳糖化工艺条件，进行糖化实验，还原糖含量为158.7g/kg苹果渣；在发酵过程中，采用最佳的糖化工艺和最佳的发酵工艺，进行三组平行实验，乙醇的产率可达到178.40ml/kg干苹果渣。

③对正交实验结果进行极差分析可知对糖化效果即糖化液的还原糖含量影响最大的因素为纤维素酶用量，热处理时间次之，糖化时间的影响最小。

④由正交实验结果进行极差分析可知，对发酵效果即乙醇的产率影响最大的因素为发酵液的初始pH值为4，酵母的接种量次之，发酵温度的影响最小。

（2）建议

①由实验结果可知，发酵的环境温度对发酵效果有影响，但显著性不大；在不影响酵母生长的前提下可适当的降低发酵温度。

②本实验由于受到实验条件的限制，仅对部分影响因素进行了实验，而并未对如糖化温度、糖化pH值、发酵菌种等进行实验。

但这些因素对实验的效果也有着非常重要的影响，因此建议在条件及时间允许的情况下对其它因素进行单因素实验，使实验结果更加完善。

③本实验中，发酵工艺部分只对酒用干酵母进行了试验，实验结果只适用于该酵母，是否适合其它酿酒酵母并不确定。

建议在实验条件允许的情况下对其它酿酒酵母进行实验，确定实验所确定的工艺条件是否切实可行。

④本实验所得的苹果渣发酵液，既有较高的酒精产率，又具有较好的苹果香味，因此可以考虑将该产品实现商业化，开发一条利用苹果渣制备果酒的新途径。