剖析蛋白免疫印迹半定量在药理学研究中的影响.docx

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剖析蛋白免疫印迹半定量在药理学研究中的影响

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　　蛋白免疫印迹（Westernblot）是当前蛋白分析的一种常规技术，它结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，用于检测样品中特异蛋白存在与否、细胞中特异蛋白的半定量分析和蛋白质分子相互作用的研究。

在药理学研究中，使用蛋白免疫印迹分析通常都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，常采用灰度分析软件检测目的蛋白及内参条带的表达强度，以分析药物等处理因素对目的蛋白的影响。

但由于该检测方法步骤较繁琐，实验变量较多，结果不稳定等特性，使得应用该法测定组织中的目的蛋白浓度时常常会遇到困难，需花费大量的人力物力财力和时间去摸索实验条件。

虽然各种教科书和网络上都有讨论如何做好蛋白免疫印迹分析，并提出各种注意事项，但作为药理学工作者，仅有这些常识仍不能很好完成药理学评价，甚至做出相反的实验结果。

本实验从实验实践分析出发，讨论蛋白免疫印迹半定量分析在药理学研究中的影响因素及处理方法，为广大药理学工作者提供参考。

　　1实验材料

　　1.1细胞丙型肝炎

　　病毒（HCV）感染的人肝传代细胞系Huh7.5细胞，用0.05%-EDTA胰酶消化传代，用含10%灭活胎牛血清及每毫升100单位青霉素和100单位链霉素的DMEM培养基正常传代和富集培养。

　　1.2主要生化试剂

　　DMEM、胎牛血清（美国GiBco公司）;细胞总蛋白提取试剂CytobusterTMProteinExtractionReagent（美国Novagen公司）;蛋白酶抑制剂Completeproteaseinhibitorcocktailtables（德国RocheAppliedScience公司）;Penicillin-Streptomycin双抗、PBS、0.05%-EDTA胰酶均（中科迈晨科技有限公司）;5×LoadingBuffer（LaneMarkerSampleBuffers）、PageRulerTMPrestainedProteinladder、PierceTMBCAProteinAssayKit（ThermoScientific公司;30%丙烯酰胺溶液、1.5mol·L-1Tris-Cl（pH8.8）、1mol·L-1Tris-Cl（pH6.8）、10%SDS溶液、TEMED、过硫酸铵、三羟基氨基甲烷Tris碱、甘氨酸、十二烷基硫酸钠SDS（北京普利莱基因技术有限公司）;聚山梨酯20（西陇化工股份有限公司）。

无水乙醇、浓盐酸、NaCl、甲醇、异丙醇等均为分析纯;PVDF膜和化学发光液ImmobilonTMWesternChemiluminescentHRPSubstrate（美国Millipore公司）。

　　1.3抗体

　　抗HCVCore蛋白小鼠单抗（C7-50，ab2740）（英国Abcam公司）;小鼠抗Gapdh和小鼠抗Tubulin单抗（中杉金桥生物技术公司）;抗小鼠IgGHRP-linked（CellSignaling公司）。

　　1.4主要仪器

　　Mini-Ⅲ型电泳系统、Bio-Rad湿转系统和凝胶成像系统（PowerPac200、ChemiDocTMXRS+）均为美国BIO-RAD公司。

　　2实验方法

　　2.1实验步骤

　　2.1.1细胞总蛋白的制备将3瓶T75培养瓶内HCV感染的Huh7.5细胞用胰酶消化后，分别用6mlDMEM吹散后收集并以1000×g离心5min，弃上清，细胞用600μL蛋白裂解液裂解45min（冰浴）后在4℃条件下12000×g离心20min，上清吸出混匀后分装，每管100μL，取一管用于蛋白定量，其他分别加25μL5×LoadingBuffer煮沸10min，-20℃保存等测。

　　2.1.2蛋白免疫印迹分析操作步骤常规方法配置5%积层胶和10%分离胶，胶厚1.0mm。

上样后，恒压电泳（冰浴条件），积层胶55V40min，分离胶115V60min。

以240mA转膜60min（冰浴），在摇床上用5%脱脂牛奶封闭60min。

用3%脱脂牛奶将一抗稀释到相应浓度和体积，并根据实验要求孵育相应时间。

一抗孵育后将膜用1×TBST洗3遍，10min·次-1。

用1×TBST将二抗稀释到所需浓度和体积，摇床孵育60min。

将膜用1×TBST洗3遍，10min·次-1。

将发光液ImmobilonTMWesternHRPSubstrateLuminolRegent和ImmobilonTMWesternHRPSubstratePeroxideRegent以1∶1配制，根据实验所需，稀释发光液以及选择曝光时间，在凝胶成像系统上进行曝光显影成像。

　　2.2实验条件控制为利于结果比较，严格控制实验条件，确保前后实验条件一致，主要措施有:

采用比较准确的BCA法测定总蛋白浓度，相同条件电泳至少重复试验3次，且多次测量求平均值;溶液配制采用屈臣氏蒸馏水;所有使用到的溶液均为一次性使用，且现用现配，以避免溶液离子强度改变造成的影响;均在冰水中进行电泳和电转，以避免室温改变带来的影响等。

　　2.3数据处理蛋白浓度数据由灰度分析软件扫描产生，某一目的蛋白的浓度采用相对定量，以内参进行校正（即目的蛋白浓度/内参蛋白浓度）。

3次以上实验结果求平均值，数据用均数±标准差表示。

　　3实验结果

　　3.1蛋白浓度定量用BCA定量试剂盒对从感染HCV的Huh7.5细胞内提取的总蛋白准确多次测定，计算出细胞裂解液总蛋白质量浓度为（3.41±0.31）μg·μL-1。

　　3.2蛋白上样量对检测结果的影响。

　　3.2.1不同浓度但相同上样体积进行SDS-PAGE对检测结果的影响为比较不同浓度但相同上样体积对半定量检测结果的影响，首先对样品进行对倍稀释（用1×LoadingBuffer稀释1～128倍）后，上样相同体积（即均为20μL）进行SDS-PAGE。

结果显示，目的蛋白Core及2个内参蛋白Tubulin和Gapdh的浓度强度均与蛋白总上样量有剂量相关性，但只在一定上样量范围内有线性关系，超过范围（即上样量过高或过低）其蛋白强度变化幅度变小。

通过用内参校正（半定量方法，即Core/Tubulin或Core/Gapdh），目的蛋白Core也同样显示有一定的线性范围，超过上样量范围其蛋白强度变化幅度也变小（，甚至变得不敏感。

但用内参Tublin或Gapdh作内参对照校正后却有相似的曲线，说明选用何种内参作为对照不影响实验结果的分析。

　　3.2.2相同浓度不同上样体积进行SDS-PAGE对检测结果的影响为比较相同浓度但不同上样体积对半定量检测结果的影响，采用原液浓度加不同体积（0.5～20μL）上样进行SDS-PAGE。

结果显示，通过用内参（Gapdh）校正后的总蛋白浓度-相对强度曲线（图1C）与不同浓度相同上样体积的曲线相似，提示这两种上样方法不影响实验结果，实验结果主要影响因素为蛋白上样量。

　　3.3检测结果的平行性分析

　　在药学上，常分析药物处理后对某目的蛋白在含量上的影响，但由于蛋白免疫印迹分析是半定量实验技术，有一定的误差，那么在多大误差范围内可以接受呢?

为分析这个问题，根据上述实验结果，我们选取线性较好实验结果较为敏感的浓度进行实验。

采用相同浓度（原液用1×LoadingBuffer4倍稀释，即0.85μg·μL-1）相同上样体积（20μL），即相同蛋白量，每次8孔，实验重复3次，分析其平行性（n=24）。

结果发现，以内参校正后，Core/Tubulin为（0.556±0.065），误差为11.76%;Core/Gapdh为（0.943±0.133），误差为14.12%;Gapdh/Tubulin为（0.595±0.070），误差为11.83%。

因此本实验初步认为，蛋白免疫印迹分析对允许误差范围应控制在15%以内，超过这个误差，得出的实验结果在下结论时（即处理因素上调或降低某目的蛋白的结论）应谨慎。

　　3.4一抗浓度和孵育时间对检测结果的影响

　　为分析一抗浓度和孵育时间是否对半定量实验结果造成影响，本实验在SDS-PAGE完成并转膜后采用不同一抗浓度（Core抗体的稀释倍数分别为500、2500和12500;Gapdh抗体的稀释倍数分别为500、5000和50000;Tubulin的稀释倍数与Gapdh的相同）分别孵育不同时间（0.5、2.5和14h）。

实验结果显示，用Tubulin校正后，Core蛋白相对强度与一抗浓度和孵育时间不相关，其相对强度约在（0.93±0.03），用Gapdh作内参也有相似的结果，其相对强度约在（1.11±0.08），用内参作相互比较，也有相似的结果（0.84±0.07），即校正后的比值不受一抗浓度和孵育时间的影响。

结果提示，只要能得到清晰的实验条带，可以适当增加一抗稀释度以节约成本，或缩短实验时间以提高工作效率。

　　3.5发光液浓度对检测结果的影响

　　为分析发光液浓度是否对半定量实验结果造成影响，本实验在显色成像时用TBST对发光液进行稀释（原液、2倍、10倍和50倍稀释），由于50倍稀释的发光液曝光条带不清晰，其他浓度的发光液均能有质量好的条带，在条带质量较好的条件下，半定量结果没有差别，但成像时间差别较大，发光液在原浓度时很快形成高质量的条带（1～10s），而在浓度较低时，形成高质量的条带所需时间相对较长（30～40s），而在更大稀释度（如50倍）时，蛋白浓度低时甚至不能形成高质量的条带。

　　4讨论

　　蛋白免疫印迹分析常应用在药物药理学上的研究，因其结果比较直观而颇受欢迎，成为经典实验方法，以内参作对照，分析药物等处理因素对目的蛋白的影响。

由于蛋白免疫印迹分析的实验步骤较多，影响因素相对难于控制，因此做好相对定量需要摸索实验条件，以便得出正确可靠的结论，这与定性的要求不完全一样，定性的结果只要有清晰的实验条带就行，而半定量的要求更高。

本实验以HCV感染的细胞为例，以病毒编码的Core蛋白为目的蛋白，以内参Tubulin和Gapdh作对照，分析蛋白免疫印迹分析在半定量分析中的影响因素及注意事项。

　　首先是关于上样量的问题。

本实验说明半定量的结果主要影响因素是目的蛋白上样量，因此上样量需要根据目的蛋白的丰度作适当的调整，不能只依据总蛋白含量确定，如果目的蛋白的丰度较高，则应适当降低上样量，反之，则应增加上样量，以免导致假阴性（即药物处理后目的蛋白含量未发生明显变化），因为超过检测线性范围，导致检测敏感性降低（即变化幅度变小）。

因此，在正式实验之前，最好先做不同上样量的分析，找到合适的线性范围，以得到公正、客观的半定量实验结果。

　　关于上样量的调整方法问题。

在实验中，通常要做可比性，如用药理处理后，细胞培养上清的病毒含量本身有一定的变化，但如要分析相同病毒量的条件下某目的蛋白的变化，就要适当调整上样量。

本实验用稀释法或减少上样体积的实验结果说明上样方法对半定量实验结果的影响不明显。

因此，如果蛋白浓度较大时，直接减少上样体积是行之有效的方法，反之则可直接适当增加上样体积，可有效完成对比实验。

　　关于内参的选择。

目前可选内参较多，有细胞骨架蛋白β-actin或β-tubulin，细胞总蛋白Gapdh（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase），核蛋白Histone、Rb、Lamin系列、TATAbindingprotein（TBP）、Pax-5、PCNA等。

本实验以Gapdh和Tublin为例说明，选用何种内参对半定量实验结果的影响不明显。

因此根据实验需要和目的蛋白所在组织中的位置，选择适当的内参即可。

　　关于一抗浓度和孵育时间的确定。

理论上，为了做好蛋白免疫印迹分析，这方面的要求比较明显，而在半定量分析上，这与蛋白免疫印迹分析定性的要求基本一致，只要能得到清晰的实验结果，可以适当增加一抗稀释度以节约成本，或缩短实验时间以提高工作效率。

　　我们同时还分析了发光液浓度是否对半定量实验结果造成影响。

实验结果显示，在条带质量较好的条件下，不影响半定量的结果，但成像时间差别较大，可以利于这点来改变条带质量，当蛋白浓度较高或抗体的效价较高时，适当稀释发光液以免过曝，从而形成质量较好的条带。

关于药物处理后有效性问题。

很多论文都做药理学评价，如果药物作用后，某种目的蛋白上调或下降一定程度而且还有统计意义则通常认为药物对靶蛋白有效，但由于蛋白免疫印迹分析只为半定量，有一定的缺陷性，导致一定的误差。

本实验通过多次实验分析提示，如果处理因素作用后，目的蛋白尽管上调或降低，多次实验也有统计意义，但如果只发生了较低幅度的变化（如与处理因素相比，其变化在15%或以内），这种药理作用则难于令人信服，下这种结论需要慎重。

　　总之，药理学上常用蛋白免疫印迹分析进行半定量，其主要影响因素为目的蛋白的上样量;为改变其上样浓度，应用稀释法或改变上样体积调整蛋白上样量均可得到相似的结果;在得到清晰的条带的基础上，可以适当增加一抗稀释度以节约成本，或缩短实验时间以提高工作效率;同时还可适当稀释发光液以免过曝，形成质量较好的条带。

由于半定量有一定的缺陷，在分析处理因素有效或无效的时候，目的蛋白的变化要有一定的幅度，否则即使有一定的统计学意义，其结论仍需甄别。

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