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细胞分裂素检测方法的研究进展

细胞分裂素检测方法的研究进展

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【摘要】细胞分裂素是一类重要的植物生长调节激素，对这类激素进行超微定量检测对于揭示其在植物体内的信号转导机理、发挥其对作物生长的调控作用具有重要意义。

本文综述了近年来细胞分裂素各种分析方法的研究进展，包括免疫分析法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和电化学方法等，介绍了实际样品常用的前处理方法，并讨论了未来的研究发展方向。

【关键词】细胞分裂素，免疫分析法，色谱法，毛细管电泳法，样品预处理，评述

　　1引言

　　细胞分裂素（cytokinins，CTKs）是一类重要的植物生长调节激素，在植物体内广泛参与各种生物过程。

CTKs可以促进植物根部的形成，以及根部损伤的修复[1]。

CTKs还影响叶绿体的制造和微结构[2]，影响植物的光合作用和病原抵抗[3]等。

目前,已被确认的CTKs有40余种[4],所有的天然CTKs都是腺嘌呤衍生物。

表1列出了典型CTKs的结构、名称和简称。

根据其6位N原子（N6）上取代基（R1）的不同，常见的CTKs可分为3类:

异戊二烯型、异戊二烯衍生型和芳香型[4]。

同时，根据其R2的不同又可以将其分为自由碱基型、核苷型、葡萄糖苷型和核苷酸型等。

另外还存在3位N原子或7位N原子上葡萄糖基取代的CTKs[5]。

　　CTKs在植物体内主要产生于RNA代谢过程[6]，生物学家已经能够通过调节相关基因的表达来控制内源CTKs的含量[7]，但是进一步确定CTKs对植物生长的作用还需要准确的内源性CTKs定量分析方法。

另外，植物体内的异戊烯基腺嘌呤（iP）等CTKs的浓度还可以作为反映植物生长环境状况和疾病情况的标志物[8]。

　　生物测试法（bioassays）是最早采用的CTKs测定方法[9]，但是这种方法的专一性和重复性都较差，分析过程复杂、工作量大，适合作为CTKs的定性分析方法，为理化分析方法提供生物活性方面的依据。

　　由于CTKs在植物体内含量非常低（约为pmol/g），因此，需要高灵敏度的定量分析方法和高选择性的纯化富集样品前处理方法对其进行分析。

本文将从这两方面进行论述。

　　2分析方法

　　2.1免疫分析方法

　　免疫分析方法具有高效液相色谱法（HPLC）等仪器分析方法所不及的优势及特点：

（1）由于免疫反应的特异性，可用粗提产品直接检测，从而显著提高了测试速度;

（2）免疫分析对特殊仪器的需求较少，分析成本较低;（3）免疫分析方法的灵敏度高。

由于这些优点，免疫分析方法一直在CTKs检测中广泛应用[10～21]。

异戊烯基腺苷（iPR）和反式玉米素核苷（tZR）作为免疫分析研究中的半抗原，所制得的抗体对N6上的取代基有较好的识别，即对于与半抗原R1不同的分子交叉反应较小。

　　最早用于CTKs测定的免疫分析方法是放射性标记的免疫分析法（RIA）[10～13]，分别实现了对iPR类[10]和ZR类[11]CTKs的定量检测。

其中Weiler等[11]制备的tZR抗血清对tZ和tZR有高特异性，对表1典型细胞分裂素的结构、名称和简称[5,40]很小，对tZR的检出限达到15pg，线性范围在0.02～10ng。

该方法被用于西红柿果实粗提物中玉米素含量的测定。

Trione等[12]制备了抗tZR的单克隆抗体，并将其用于tZR的RIA检测，灵敏度达到fmol量级。

　　由于RIA需要专业的放射性物质操作技术以及特殊的实验室设备，后来逐渐被更易普及和自动化的酶免疫分析（EIA）所取代[14～21]。

Hansen等[14]利用抗tZR多抗以及碱性磷酸酯酶标记抗原建立了对tZR和tZ的检测方法，检测线性范围为0.3～30pmol，同时利用这种方法测定了在玉米茎中tZR和tZ的梯度分布。

Maldiney等[15]将生物素亲和素体系引入ZR的酶联免疫吸附分析（ELISA）方法，使得检出限可以达到3～5pg，线性范围在1～1000pg，利用这种技术可以检测100mg西红柿样品中的ZR含量。

Zhao等[16]提出了一种简化的间接竞争ELISA法，将抗体、竞争分子和酶标二抗在同一步中加入，可以缩短检测时间，同时在一定程度上提高了灵敏度（对ZR为1.3倍），但该方法的试剂消耗量更大。

　　由于CTKs都是小分子，因此在制备抗体时需先将CTKs与载体蛋白（如牛血清白蛋白（BSA），鸡卵白蛋白（OVA）等）偶联制得全抗原。

文献[10～20]中所采用的偶联方法都是Erlanger等[22]建立的核苷类分子与蛋白分子上的自由氨基共价偶联的方法（如图1所示）。

Papet等[21]研究了iPR与蛋白的另一种偶联方法。

ELISA和RIA的检测结果表明，这种偶联方法制得的多克隆抗体对iPR和iP具有专一性，与Z和ZR没有交叉反应。

进一步使用这种抗体制得免疫亲和吸附胶，对iPR的吸附容量达到1mg/L。

　　图1嘌呤核苷与蛋白的偶联方法[22]

　　Fig.1Conjunctionofadenosinetoprotein[22]2.2气相色谱法（GC）

　　由于CTKs分子挥发性较弱，无法直接用气相色谱（GC）方法来分离检测，所以对CTKs进行GC分离检测都需要先经过衍生化[23～29]。

Most等[23]首次报道了三甲基硅烷（TMS）衍生物用于CTKs的GC分离检测。

分别制备了iP、玉米素、二氢玉米素、激动素及其相应核苷的衍生物。

制备方法为：

将iP等化合物与双（三甲基硅烷）乙酰胺（BTMSA）在60℃的乙腈溶液中反应5min。

衍生前样品需要经过严格的干燥。

虽然这种衍生方法比较简便，但由于在实际操作中难以控制N6上的取代反应，影响了测定结果的重现性。

　　全甲基化衍生技术由Morris[24]和Young[25]在1977年建立，首先用强碱对CTKs分子进行处理，处理后的产物再与碘甲烷反应。

虽然这种衍生方法在操作上比TMS法要复杂，但它具有以下优点：

（1）全甲基化衍生物更稳定，从而可以进一步用HPLC或其它方法纯化;

（2）形成的衍生物单一;（3）甲基化后分子量只增加14，而TMS法增加72，分子量的大增使当时的质谱检测方法受到限制。

Morris等[24]通过对全甲基化衍生物的质谱图进行分析，从长春花的组织中首次检出了天然的ZOG和ZROG。

Young[25]对比了一系列强碱的衍生化效果发现，二甲亚砜碳负离子有很好的效果（二甲亚砜碳负离子由特丁基锂加入二甲亚砜中制得）。

　　Ludewig等[26]报道了CTKs三氟乙酸衍生物的制备，这类衍生物由于具有很强的电子捕获能力，可以被电子捕获检测器（ECD）高灵敏地检测而被应用。

这种方法虽然灵敏度较好，但是衍生化时选择性较差。

　　Bjorkman等[27]比较了使用乙酸酐在不同溶剂、温度、反应时间等条件下对CTKs类分子的乙基化结果，找到了一种简单、回收率高、副产物少的衍生化反应条件，使用GCMS对衍生化CTKs的定量检测可以达到pmol级的检出限。

这种方法的缺点是：

R3为葡萄糖基的CTKs衍生化产物，在GCMS系统中不稳定;玉米素类和二氢玉米素类CTKs的衍生物在EIMS谱图中的分子离子峰很弱。

因此，该方法不适于这两类CTKs中新型分子的鉴定。

　　Birkemeyer等[28]使用N甲基N（特丁基二甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MTBSTFA）对tZ、mT以及吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）等植物激素同时进行衍生反应，从而实现用GCMS对多种植物激素的分离检测，其中对tZ的检出限达到0.9pmol。

作者采用这种方法对300mg植物根部样品以及秧苗样品中的植物激素进行了系统分析。

　　2.3高效液相色谱法（HPLC）

　　对CTKs进行定量分析的前提是各种CTKs的基线分离，液相色谱由于其强大的分离能力而在CTKs的检测中被广泛应用。

HPLC方法的引入使CTKs的检测水平有了巨大的突破，由于不同的CTKs显示出不同的极性，同时还具有稳定的紫外吸收，利用HPLCUV法对CTKs进行定量分析是最先报道的方法。

使用最多的液相色谱质谱联用法（LCMS）兼有LC的分离能力和MS的高灵敏度（尤其是MS/MS系统）和高特异性[30～33],同时MS信号还提供了被分析物的结构信息，为寻找新型CTKs提供了有力的手段。

　　最初尝试对CTKs进行分离的HPLC方法受到了柱填料的限制，后来非极性固相微粒材料的应用使得HPLC成为了最有效的CTKs分离方法。

1975年，Carnes等[34]成功对iP，Z及其核苷衍生物进行了分离，分离速度达到了传统LC的30倍。

Stahly等[35]利用HPLC对桃、梨和苹果样品中的玉米素及其核苷进行了分离检测。

　　如上所述，多种植物激素都具有紫外吸收，故可使用HPLCUV法进行同时的分离和测定。

Ma等[36]以C18反相柱为固定相，使用甲酸三乙胺缓冲溶液和甲醇溶液梯度洗脱，对经过固相萃取（SPE）纯化富集的椰汁样品中的玉米素和6苄基腺嘌呤（BAP）两种CTKs和IAA、ABA、赤霉酸（GA）4类植物激素及其它2种化合物进行分离，用光电二极管阵列检测器（DAD）进行检测。

流出峰的归属通过HPLCESIMS/MS进行确认。

在10μL的进样条件下对玉米素和BAP的定量限（LOQ）分别达到3.47和3.82μmol/L。

　　目前，电喷雾离子化（ESI）在CTKs的MS检测中使用最为广泛[37～43]，Prinsen等[37]首次利用LCESIMS/MS的方法检测了CTKs，建立了对16种不同CTKs的检测方法，检出限为1pmol。

他们还使用柱上浓缩的方法，在大体积进样的MicroLC和CapillaryLC与MS/MS联用上取得了更低的检出限（在MicroLC上为5fmol，在CapillaryLC上为0.1fmol）[38]。

　　Novk等[40]报道了用ESI单四极杆质谱定量检测植物样品中所有异戊二烯型CTKs的高灵敏度方法。

方法中实现了20种非衍生的天然CTKs的基线分离。

通过柱后分流，将反相色谱柱的流出液同时引入DAD检测器和MS检测器。

通过对最终流量，去溶剂化温度、去溶剂化气体和电压等离子化参数的优化，确定了ESI的最佳条件。

所测CTKs都主要以分子离子峰[M+H]+的形式被检测，检测线性范围为0.025（0.075）～100pmol，可以满足常规检测需要。

在实际样品的测定中，样品提取液通过两次不同的离子交换色谱纯化，然后再通过一种基于CTKs单克隆抗体的亲和免疫纯化。

LCMS对样品中CTKs含量的测定结果还通过LC分离后的ELISA方法进行了确证。

研究结果表明，该方法可以满足在生物样品中异戊二烯型和异戊二烯衍生型CTKs的检测要求，但由于缺乏同位素标记内标，对于实际样品中芳香型CTKs的检测还需要进一步发展。

　　快原子轰击（FAB）离子源在CTKs检测方面的应用也有报道。

Astot等[44]使用capLC/fritFABMS检测了经过柱前丙酰化衍生的CTKs，建立了选择离子监测模式（SIM）的定量方法。

Tarkowska等[39]和Doleal等[45]采用这种方法分别发现了两种新型的CTKs。

　　柱前衍生法在LC分离CTKs中也有使用。

不同类型的CTKs（如碱基型、核苷型、核苷酸型、葡萄糖苷型）的极性分布范围非常广，极性太大会影响待测物在柱上的分离以及流出峰的形状。

Nordstrolm等[46]研究了丙酰化和苯甲酰化对分离的影响。

经过衍生后的待测物极性降低，延长了柱上的保留时间和ESI的信号强度。

对于丙酰化的ZR及iPR检出限达到约0.2fmol，灵敏度有了较大提高。

　　Sonoki等[47]使用靛红酸酐对iPR和ZR进行衍生，衍生后的iPR和ZR得到了比衍生前更好的分离效果。

通过荧光检测器对流出物进行定量分析，对iPR和ZR的检出限分别达到1.1和1.2pmol。

　　2.4毛细管电泳法（CE）

　　毛细管电泳是一种快速、高效、低进样量、易于自动化的分离方法。

通常，CE比HPLC的分析成本低、分析速度快。

Pacakova等[48]将CZE和MEKC应用于自由碱基型和核苷衍生型的CTKs的分离以及实际样品的检测。

在150mmol/L磷酸溶液体系中，pH1.8条件下电渗流（EOF）可以忽略，各粒子间由于荷质比的不同而分离，自由碱基型CTKs分子的淌度大于相应的核苷衍生型。

　　Bartk等[49]研究了各种环糊精（CD）添加剂对CE分离CTKs的影响。

由于各种环糊精的内部疏水腔以及CTKs分子各部分尺寸的不同，使得环糊精能够将不同CTKs分子的淌度以不同程度减小。

比如异戊二烯型和类异戊二烯型分子与αCD作用较强，芳香型分子与βCD作用较强。

　　Liu等[50]采用了一种大体积进样的在线富集方法来提高CE检测7种植物激素的灵敏度（包括激动素（KT）和BAP）。

通过这种方法可以对分析物实现10～600倍的富集，使用UV检测，对KT的检出限达2.4μg/L。

此方法的局限性是一次只能富集同一种电荷的分析物。

　　Ge等采用了在线富集以及CEMS/MS联用的方法，分别对6种核苷酸型CTKs[51]和12种不同类型的CTKs[52]进行了分离检测，检出限均0.2μmol/L，其中最低的DHZR检出限为0.05μmol/L。

Ge等[53,54]还建立了MEKCUV对各种CTKs的分离分析方法，可以对不同取代位置的Topolin异构体及其核苷进行分离。

这几种方法都用于经固相萃取法（SPE）纯化后的椰汁实际样品的检测。

由于在MEKC方法中使用的表面活性剂能抑制离子化，可能污染离子源，给MEKC与MS的联用带来了困难。

Ge等[55]进一步发展了部分填充MEKC方法，表面活性剂的胶束溶液只在进样前后使用，有效地降低了表面活性剂对MS检测的影响。

　　2.5其它分析方法

　　CTKs中的CH具有电活性，在电极上会发生还原反应[56]，因此可以利用电化学方法进行检测。

Hernandez等[56]利用悬挂汞滴富集tZ，分别用方波溶出极谱法和微分脉冲溶出极谱法检测tZ，检出限达到15.5μg/L。

他们还利用碳纤维超微电极检测tZ，检出限达到0.2μg/L[57]。

这种超微电极有可能用于植物体内CTKs的快速原位检测。

　　Li等[58]制作了一种基于安培测量的免疫传感器。

将辣根过氧化物酶（HRP），K4Fe（CN）6和抗iPRIgG掺杂或吸附在玻碳电极表面的聚合物上，使用时利用已知浓度的葡萄糖氧化酶标记的iPR与未知浓度的iPR竞争反应，测量时葡萄糖氧化酶催化葡萄糖的反应产生H2O2，继而在HRP催化下氧化K4Fe（CN）6，检测K3Fe（CN）6还原时产生的电流即可间接反映出未知iPR的浓度。

测量线性范围为5～300mg/L，对实际样品的测量结果与HPLC结果吻合。

3样品预处理方法

　　由于生物样品中CTKs的含量极低，而且生物样品的组成复杂，所以对实际样品中的CTKs进行检测时必须先将CTKs从样品中提取出来，然后经过进一步分离和纯化才能进行检测。

目前，CTKs的检测样品一般为根、茎、叶和芽等部分的植物组织。

这些组织样品提取前需要先用液氮冷冻，然后研磨成粉末。

　　3.1提取剂

　　甲醇、乙醇、高氯酸以及混合溶剂都可以用来提取CTKs。

1964年，Bieleski[59]指出，植物体内的磷酸酯酶会在很大温度范围内的甲醇溶液中对核苷酸产生水解作用，因此在提取过程中应当注意防止核苷酸型CTKs的水解。

他们发现，加入了有机酸的溶剂在低温下使用可使磷酸酯酶失活，从而抑制水解。

Hoyerova等[60]的实验表明，加入甲酸确实对磷酸酯酶活性有很大抑制作用，同时，不含氯仿的Bieleski溶剂有利于提取后产物的进一步处理以及后续分析。

　　3.2纯化方法

　　提取液的进一步处理通常使用SPE或免疫亲和纯化法。

用于CTKs纯化的SPE法主要有离子交换柱[44,45]、C18柱[41,42,44～46]和混合模式的OasisMCX柱[41,46,60，61]，在实际应用中通常将几种方法结合使用。

阳离子交换柱可用来纯化碱性的细胞分裂素，而阴离子交换柱适合纯化酸性的细胞分裂素如核苷酸型细胞分裂素。

Vreman等[62]提出了通过阳离子交换纯化CTK的方法。

其具体步骤为：

将水相提取液的pH调到3，使其流过已预先平衡至pH3的铵型纤维素柱。

用pH3的水冲洗柱子后,用2mol/L氨水将吸附的阳离子冲洗下来。

阳离子交换的强酸性条件可能造成葡萄糖衍生型的CTKs的水解。

Dobrev等[61]使用阳离子交换和C18反相混合模式的OasisMCX柱对阳离子型细胞分裂素和阴离子型的生长素和脱落酸进行分离。

Hoyerova等[60]还比较了C18柱和OasisMCX柱的提取纯化效率，结果显示两者对CTKs提取效率近似，但后者的内标回收率优于前者，而且OasisMCX柱去除紫外吸收干扰物质的能力强于C18柱。

Ge等[53]将OasisMCX柱与C18柱结合建立的前处理方法用于椰汁的纯化。

　　基于抗原抗体相互作用的免疫亲和纯化方法具有对目标物的特异性亲和作用，可以对样品进行选择性富集，可极大地提高痕量分析的检测灵敏度，这种方法作为色谱或CE检测的前处理方法得到广泛地应用[30～33,38～40,63～65]。

Davis等[63]测试了不同的亲和凝胶载体和偶联方法，所制成的多种亲和凝胶都能够提供足够的纯化能力，其中AffiGel10具有含10个原子的连接臂，可以使固定化的抗体具有一定的空间自由度。

Vankova等[64]比较了随机偶联和定向偶联制成的两种免疫亲和吸附剂的性能。

可能由于连接臂提供了足够CTKs分子接近的空间自由度，两种吸附剂没有表现出明显的性能差别。

　　CTKs都是具有多种活性官能团的分子，非常适于作为模板分子制备相应的分子印迹聚合物（MIP）。

MIP可以提供类似于抗原抗体的特异性识别作用，而在成本、技术需求和稳定性等方面更优于抗体。

基于MIP的固相萃取方法已广泛用于农药[66]、药物[67]等小分子的萃取，并发展为CE的在线纯化技术[68]，但用于CTKs方面的研究鲜有报道。

4结束语

　　CTKs作为一类重要的植物激素，在植物生长发育的各个阶段发挥着重要的调节作用。

开发建立实用可靠的CTKs超微定量分析方法是对该类物质生理作用机理进行深入研究的前提。

目前普遍采用的方法大多在选择性和灵敏度上可以满足常规检测的需求，但都需要进行步骤繁琐的前处理过程，大大影响了这些方法的应用。

对于生物样品中细胞分裂素等超微含量物质的分析检测来说，建立简化、快速且有利于高灵敏度分析的检测方法是今后的发展趋势。

　　此外，迄今发展的方法主要都是通过植物组织提取、体外分析的方法来检测CTKs，而在植物活体中直接检测CTKs的分布和分泌状况方面的研究还十分有限。

Muller等[69]通过合成的信号系统可以给出荧光信号来反映活体中CTKs的分泌情况以及与其它物质的相互作用，是这方面一项开拓性的工作。

将其它具有生物相容性的信号体如荧光蛋白和量子点等纳米材料，与具有特异性识别作用的生物载体如抗体和适配体等结合，对建立植物细胞原位实时信号检测系统具有较好的发展潜力。

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