版《中国药典》三部微生态活菌制品总论征求意见稿.docx

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版《中国药典》三部微生态活菌制品总论征求意见稿

微生态活菌制品总论（征求意见稿）

微生态活菌制品系由人体内正常菌群成员或具有促进正常菌群生长和活性作用的无害外籍细菌，经培养、收集菌体、干燥成菌粉后，加入适宜辅料混合制成。

用于预防和治疗因菌群失调引起的相关症状和疾病。

微生态活菌制品必须由非致病的、活的细菌组成，无论在生产过程、制品贮存和使用期间均应保持稳定的活菌状态。

它可由一株细菌制成单价制剂；也可由多株或几种细菌联合制成多价制剂。

根据其不同的使用途径和方法可制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂等多种剂型。

目前，国内已经批准生产的微生态活菌制品有22种（见附录1），其中大多用于防治肠道菌群失调。

制造

微生态活菌制品的制备方法、工艺应能保证成品含有足够的活菌数量，保持其稳定性，同时应防止外源因子的污染。

一、基本要求

生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

二、生产用菌种

生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。

1、菌种名称及来源

选用的生产菌种应来自人体内正常菌群，或对人体无毒无害、具有促进正常菌群生长和活性作用的外籍细菌；细菌分离过程和传代背景应清晰；应具备稳定的生物学和遗传学特性，并能保持稳定的活菌状态。

应经实验室和临床试验证明安全、有效。

2，种子批的建立

生产用菌种应按照“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定建立种子批系统。

三级种子批应分别冻干，置适宜温度保存；种子批传代应限定传代次数，原始种子批和主种子批启开后传代次数不得超过10代，工作种子批启开后至发酵培养传代次数不得超过5代。

3、种子批检定

菌种的属、种型分类鉴定，应依据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册（Bergey’sManualofSystematicBacteriology）和伯杰氏细菌命名手册（Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology）的有关规定，包括形态、生长代谢特性检查，原始种子或主种子还应作遗传特性和抗生素敏感性等检查。

三级种子批常规检查包括以下三项：

（1）培养特性及染色镜检

将菌种接种于适宜培养基，置有氧或厌氧环境中培养，观察其生长情况，确定菌种为需氧性细菌或厌氧性细菌；以划线法观察在琼脂平板上生长的单个菌落的形状、大小、表面、边缘、透明度、色泽等特征；也可比较菌种在不同温度、pH、或氯化钠浓度等条件下的生长特性等。

取菌种的新鲜培养物涂片作革兰染色，在显微镜下观察菌体的染色反应、形态、大小和排列等，有芽孢的细菌应同时观察芽孢的形状、大小和位置（也可增做芽孢染色）。

检查结果均应符合原始菌种的特性。

（2）生化反应

按附录

“细菌生化反应培养基”选择相应的培养基或其它适宜的方法进行，结果应符合原始菌种的特性。

（3）毒性试验

毒性试验是通过动物试验检查菌种是否存在不安全因素，以保证人体使用安全。

用体重18～22g小鼠5只，每只腹腔注射0.3ml新鲜菌液（不少于1.0×109CFU/0.3ml），连续观察3天，小鼠均应健康存活、体重增加；或每只小鼠经口灌胃0.5ml新鲜菌液（不少于1.0×109CFU/0.5ml），每天1次，连续3天,从第1天灌胃起连续观察至第7天,小鼠均应健康存活，体重增加。

除另有规定外，原始种子或主种子批还需进行以下检查：

①细菌代谢产物-脂肪酸测定

用气相色谱法（附录ⅢC）或其他适宜的方法进行，应符合该菌种的特性。

②遗传特性分析

可采用细菌DNA的G+Cmol%的含量测定或其他适宜方法进行，应符合该菌种的遗传特性。

③抗生素敏感性试验

采用琼脂扩散纸片法或其他适宜方法进行菌株的抗生素敏感性检查，应符合该菌种的特性。

④稳定性试验

菌种在适宜培养基中，连续传代30代次后，将第30代培养物作种子批检定，全部检查结果应与原始菌种的特性一致。

三、菌粉制造

应包括种子液制备、大罐培养、收获菌体（或芽孢）和菌体干燥制成菌粉。

如生产多价制品时，应每种菌分别培养，制备单价菌粉。

1、生产用种子

启开工作种子批菌种，接种于适宜培养基进行多级种子扩增，应涂片作革兰染色，在显微镜下观察5～10个视野，细菌的染色反应、形态应一致并符合生产用菌种的特征。

制备过程应防止污染，菌种传代次数应符合规定。

2、生产用培养基

采用经批准的培养基用于生产。

3、培养

采用液体培养。

将种子液置适宜条件下培养（包括厌氧或需氧、温度、时间等），培养过程中取样涂片作革兰染色镜检、PH值检测等，芽孢菌需进行芽孢形成率的检测，均应符合规定。

培养结束后取样做纯菌检查，如发现污染应予废弃。

生产多价制品的单价菌粉时，应分别培养。

4、收获菌体和制成菌粉

培养结束后离心收获湿菌体，与适宜的分散剂、稳定剂混合。

采用冷冻真空干燥法干燥菌体，芽孢菌可采用加热干燥方法，再经粉碎、过筛制成粉末状菌粉。

5、菌粉的保存与有效期

应通过活菌稳定性试验确定保存温度和有效期。

6、菌粉检定

按“菌粉检定”项进行，符合规定后方能进行半成品配制。

四、半成品

1、配制

根据菌粉的活菌数量，以适宜比例与辅料混合均匀后制成半成品。

配制多价制品时，应将各单价菌粉、辅料按配方比例和配制程序混合均匀，配制过程应防止污染。

2、半成品检定

按“半成品检定”项进行，并符合规定。

五、成品

1、剂型制备

根据制品的用途、使用对象和用药途径等因素确定剂型。

制备过程应符合附录Ⅰ“制剂通则”项下相关剂型的规定。

2、分批

应符合“生物制品分批规程”规定。

3、分装、规格和包装

制品的分装应符合附录Ⅰ“制剂通则”的有关规定。

包装应符合“生物制品包装规程”的有关规定。

规格应符合批准的规格要求。

检定

微生态活菌制品质量检定应包括菌粉检定、半成品检定和成品检定。

一、菌粉检定

1、外观

应为白色、灰白色或灰黄色粉末。

2、目的菌检查

取少量菌粉加入适量灭菌生理氯化钠溶液或适宜稀释液后，涂布在适宜琼脂平板上，在适宜条件下培养，其培养物的生长特性和染色镜检的特征应符合生产用菌种特征。

3、杂菌检查：

杂菌检查：

方法和结果判断见本总论附录3。

如不符合规定应废弃。

4、干燥失重

菌粉中残余水分的含量会直接影响活菌的生存，须进行菌粉干燥失重的检查。

应按附录ⅦL或仪器方法测定。

5、活菌数测定

测定每克菌粉中含有的活菌数量。

方法见本总论附录2。

二、半成品检定

半成品须作杂菌检查，根据用药途径确定杂菌检查的质控指标。

方法和结果判断见本总论附录3。

三、成品检定

1、鉴别试验

检查成品中所含的目的细菌是否符合生产用菌种的特性。

即按上述“种子批检定”方法进行生长特性、染色镜检和生化反应检查，应符合规定。

对于多价制品，则须逐一检查单价菌。

2、理化检查

（1）外观性状

根据剂型，观察制品的外观、色泽。

片剂外观应完整光洁，呈白色或类白色，间有菌粉色斑；颗粒剂、散剂和胶囊剂内粉末的粒子大小应一致，色泽均匀，间有菌粉色斑。

（2）干燥失重

按附录ⅦL或仪器方法测定，减失重量应不得超过5.0%，芽孢菌制品应不得超过7.0%。

（3）粒度

散剂和颗粒剂应进行粒度检查。

按附录

G第二法，采用单筛分法或双筛分法检查，应符合规定。

（4）装量（重量）差异

各剂型按附录Ⅰ“制剂通则”的相应规定进行，应符合规定。

（5）崩解时限

胶囊剂、片剂按附录ⅤC进行，应符合规定。

3、活菌数测定

按本总论附录2方法测定每克制品活菌数，应符合规定。

多价制品应分别测定各单价活菌数。

4、杂菌检查

目的是检查成品中外源性微生物的污染情况和是否存在意外的不安全因素，以保证人体使用安全。

方法和结果判断与半成品的“杂菌检查”项相同。

5、安全试验：

安全试验是通过动物试验进行的非特异性毒性检查，应根据制品的使用途径和人用剂量确定试验方法。

肠道微生态制品照下述方法检查：

取2g制品加入8ml生理盐水中，混合均匀，用5只体重18～22g小鼠，每只小鼠经口灌胃0.5ml，每天1次，连续3天。

自第1日灌胃起，连续观察7天，小鼠应健康存活、体重增加，判为合格。

如不符合规定，可用10只小鼠复试1次，判定标准同前。

阴道微生态制品照下述方法检查，用24～26g雌性小鼠5只，每只小鼠阴道内置入10mg制品，每天1次，连续3天。

从给药第1天，连续观察7天，小鼠应健康存活，阴道局部无红肿分泌物等症状，体重增加，判为合格。

保存、运输及有效期

按批准的温度保存和运输，自半成品配制之日起，按批准的有效期执行。

使用说明

应符合“生物制品包装规程”规定和批准的内容。

附录1已批准的微生态活菌制品

制品名称细菌种类

一、双歧杆菌活菌胶囊青春型双歧杆菌

二、双歧杆菌活菌散青春型双歧杆菌

三、双歧杆菌三联活菌胶囊1.长型双歧杆菌

2.嗜酸乳杆菌

3.粪肠球菌

四、双歧杆菌三联活菌散1.长型双歧杆菌

2.嗜酸乳杆菌

3.粪肠球菌

五、双歧杆菌乳杆菌三联活菌片1.长型双歧杆菌

2.保加利亚乳杆菌

3.嗜热链球菌

六、地衣芽孢杆菌活菌胶囊地衣芽孢杆菌

七、地衣芽孢杆菌活菌颗粒地衣芽孢杆菌

八、地衣芽孢杆菌活菌片地衣芽孢杆菌

九、蜡样芽孢杆菌活菌胶囊蜡样芽孢杆菌

十、蜡样芽孢杆菌活菌片蜡样芽孢杆菌

十一、双歧杆菌四联活菌片1.婴儿双歧杆菌

2.嗜酸乳杆菌

3.粪肠球菌

4.蜡样芽孢杆菌

十二、酪酸梭菌活菌胶囊酪酸梭状芽孢杆菌

十三、酪酸梭菌活菌散酪酸梭状芽孢杆菌

十四、酪酸梭菌活菌片酪酸梭状芽孢杆菌

十五、凝结芽孢杆菌活菌片凝结芽孢杆菌

十六、酪酸梭菌二联活菌胶囊1.酪酸梭状芽孢杆菌

2.婴儿型双歧杆菌

十七、酪酸梭菌二联活菌散1.酪酸梭状芽孢杆菌

2.婴儿型双歧杆菌

十八、枯草杆菌活菌胶囊枯草芽孢杆菌

十九、枯草杆菌肠球菌二联活菌多维颗粒1.枯草芽孢杆菌

2.屎肠球菌

二十、枯草杆菌肠球菌二联活菌胶囊1.枯草芽孢杆菌

2.屎肠球菌

二十一、凝结芽孢杆菌活菌片凝结芽孢杆菌

二十二、阴道用乳杆菌活菌胶囊德氏乳杆菌

附录2活菌数测定

无菌称取3.0g制品（或菌粉），加入27.0ml稀释液中，充分摇匀，作10倍系列稀释（最终稀释度根据不同的指标要求而定），取最终稀释度100μl，滴入选择性琼脂培养基平皿上，共做3个平皿，并以玻棒涂布均匀，置适宜条件下培养，到期观察每个平皿菌落生长情况，并计数。

但必须注意当平皿菌落数小于10或大于300时，应调整最终稀释度，重新测定。

根据3个平皿菌落总数按下列公式计算活菌数。

3个平皿菌落数之和

3

活菌数（CFU/g）=×10×最终稀释度

附注：

（1）活菌数用“CFU”表示，即为细菌集落单位。

（2）稀释液通常使用生理氯化钠溶液。

（3）选择性琼脂培养基，是指最适宜制剂（或菌粉）中活菌生长的培养基。

须经批准后才能使用。

附录3杂菌检查法

微生态活菌制品杂菌检查法系检查微生态活菌制品及半成品、菌粉受外源微生物污染程度的方法。

检查项目包括控制菌、非致病性杂菌总数、真菌数检查。

杂菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。

除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～37℃；真菌培养温度为20～28℃。

检验结果以1g为单位报告。

供试品的准备

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，一般应随机抽取不少于3倍的检验用量。

一次试验所用的供试品量即为检验量（g）。

除另有规定外，直接称取1.0g菌粉、半成品、成品（片剂、胶囊剂先研碎）备用。

控制菌检查

控制菌检查用培养基的适用性检查

控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。

检查项目包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。

菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

破伤风梭状芽孢杆菌检查以生孢梭菌作为指示菌。

大肠埃希菌（Escherichiacoli）〔CMCC（B）44102〕

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）〔CMCC（B）26003〕

乙型付伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）〔CMCC（B）50094〕

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）〔CMCC（B）10104〕

生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）〔CMCC（B）64941〕

白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕

痢疾志贺菌（Shigelladysenteriae）〔CMCC（B）51252〕

菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu或100～1000cfu的菌悬液。

菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。

适用性检查控制菌检查用培养基的适用性检查所用的菌株及检测项目见表1。

表1控制菌检查用培养基的促生长、抑制和指示能力检查

控制菌

培养基

特性

试验菌株

大肠埃希菌

胆盐乳糖培养基

促生长能力

大肠埃希菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

曙红亚甲蓝琼脂

促生长能力+指示能力

大肠埃希菌

沙门菌、

志贺菌

胆盐乳糖培养基

促生长能力

乙型付伤寒沙门菌

痢疾志贺菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

沙门、志贺属琼脂

促生长能力+指示

能力

乙型付伤寒沙门菌、

痢疾志贺菌

铜绿假单胞菌

NAC液体

促生长能力

铜绿假单胞菌

抑制能力

金黄色葡萄球菌

NAC琼脂

促生长能力

铜绿假单胞菌

抑制能力

大肠埃希菌

绿脓菌素测定用培养基

促生长能力+指示

能力

铜绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

7.5%氯化钠肉汤

促生长能力

金黄色葡萄球菌

抑制能力

大肠埃希菌

甘露醇盐琼脂

促生长能力+指示

能力

金黄色葡萄球菌

抑制能力

大肠埃希菌

梭菌

梭菌增菌培养基

促生长能力

生孢梭菌

哥伦比亚琼脂

促生长能力

生孢梭菌

白色念珠菌

沙氏葡萄糖肉汤

促生长能力

白色念珠菌

沙氏葡萄糖琼脂

促生长能力+指示

能力

白色念珠菌

念珠菌显色培养基

促生长能力+指示能力

白色念珠菌

抑制能力

大肠埃希菌

吐温80玉米琼脂培养物

促生长能力+指示

能力

白色念珠菌

增菌培养基促生长能力检查：

分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。

与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。

固体培养基促生长能力检查：

取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平皿中，每种培养基平行制备2个平皿，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养，计数。

被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比应不小于70%，且生长的菌落形态应一致。

培养基抑制能力检查：

接种试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。

培养基指示能力检查：

分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基平皿上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。

被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。

供试品检查

供试品的控制菌检查应按下述方法进行。

阳性对照试验供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。

取阳性对照菌于相应选择性培养基平皿上划线接种，按供试品的控制菌检查方法培养，观察菌落生长情况。

阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验取增菌液0.1ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。

阴性对照应无菌生长。

1大肠埃希菌检查

1.1增菌培养

称取供试品1g，加到9ml灭菌胆盐乳糖增菌液中,培养18～24小时。

1.2特异培养

将上述增菌液摇匀，取0.1ml滴加到曙红亚甲蓝琼脂平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养18～24小时，观察菌落生长情况。

1.3结果判定

阳性对照平皿应长出紫黑色、圆形、稍凸起、边缘整齐、表面光滑、带有金属光泽的菌落。

供试品平皿上若未见菌落生长、或生长的菌落与阳性对照的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌；若生长的菌落与阳性对照的菌落形态特征相符或疑似，应作革兰氏染色镜检等适宜的鉴定试验，鉴别是否为制品中的目的菌或大肠埃希菌。

2志贺、沙门菌检查

2.1增菌培养

称取供试品1g，加到9ml灭菌胆盐乳糖增菌液中,培养18～24小时。

2.2特异培养

将上述增菌液摇匀，取0.1ml滴加到沙门、志贺属琼脂平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养24～48小时，观察菌落生长情况。

2.3结果判定

阳性沙门菌对照平皿应长出无色透明或半透明、圆形、光滑、稍隆起菌落，中心呈黑褐色。

阳性志贺菌对照平皿应长出无色、半透明、圆形、微突、光滑、的菌落。

供试品平皿培养24小时、48小时各观察结果1次，若未见菌落生长，判供试品未检出志贺、沙门菌；若有菌落生长，应与阳性对照的菌落比较，并作革兰染色镜检等适宜的鉴定试验，鉴别是否为制品中的目的菌或志贺、沙门菌。

3.铜绿假单胞菌检查

3.1增菌培养

称取供试品1g，加到9ml的NAC液体中,培养18～24小时。

3.2特异培养

将上述增菌液摇匀，取0.1ml滴加到NAC琼脂平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养18～24小时，观察菌落生长情况。

3.3结果判定

阳性对照平皿应长出产绿色色素的菌落，可使整个培养基呈绿色。

如平皿上无菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态特征不符，判供试品未检出铜绿假单胞菌。

如平皿生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。

取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验，鉴别是否为制品中的目的菌或铜绿假单胞菌。

氧化酶试验取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1％二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。

否则，应进行绿脓菌素试验。

绿脓菌素（Pyocyanin）试验取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加三氯甲烷3～5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。

静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，观察。

若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。

同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。

若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。

4金黄色葡萄球菌检查

4.1增菌培养

称取供试品1g，加到9ml灭菌的7.5％氯化钠肉汤中,培养18~24小时。

4.2特异培养

将上述增菌液摇匀，取0.1ml滴加到甘露醇高盐琼脂平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养18~24小时，观察菌落生长情况。

4.3结果判定

阳性对照平皿应长出产金黄色素的圆形、凸起，边缘整齐的菌落。

供试品平皿上若未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态不符，判未检出金黄色葡萄球菌；若平皿上生长的菌落与阳性对照品的菌落特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24小时。

取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18～24小时，作血浆凝固酶试验。

血浆凝固酶试验取灭菌小试管3支，各加入血浆和无菌水混合液（1∶1）0.5ml，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物（或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液）0.5ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml，即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。

将3管同时培养，3小时后开始观察直至24小时。

阴性对照管的血浆应流动自如，阳性对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。

如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。

若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，亦非制品中的目的菌，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

5.破伤风梭状芽孢杆菌

5.1增菌培养

取供试品1g或1ml2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。

上述2份供试液直接或处理后分别接种至9ml的梭菌增菌培养基中，置厌氧条件下培养48小时。

5.2特异培养

取上述每一培养物0.1ml，分别涂布接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平皿上，一式3份，置厌氧条件下培养48～72小时。

5.3结果判定

若供试平皿上无菌落生长，判供试品未检出破伤风梭状芽孢杆菌；若平皿上有菌落生长，应挑选2～3个菌落进行革兰染色等适宜的鉴定试验。

若上述疑似菌为革兰阳性梭状芽孢菌，应进行芽孢的位置、大小、形态的观察等适宜的鉴定试验，判断是否为破伤风梭状芽孢杆菌。

6.白色念珠菌（Candidaalbicans）

6.1增菌培养

取供试品1g或1ml，接种至9ml的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养24～48小时。

6.2特异培养

取上述培养物0.1ml，滴加到沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿上，以玻棒涂匀，一式3份，培养24～48小时（必要时延长至72小时）。

6.3结果判定

阳性对照平皿应长出乳白色偶见淡黄色的菌落，菌落表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。

若供试品平皿上未见菌落生长或生长的菌落与阳性对照菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。

如平皿上生长的菌落与阳性对照菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平皿上，培养24～48小时（必要时延长至72小时）。

若平皿上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。

若平皿上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉米琼脂培养基上，培养24～48小时。

取培养物进行革兰染色镜检及芽管试验。

芽管试验挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃、1～3h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。

若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚