口腔粘膜细胞基因组DNA制备.ppt

口腔粘膜细胞基因组DNA制备.ppt

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分子医学技能实验分子医学技能实验分子医学技能实验分子医学技能实验袁袁洁洁生物化学教研室生物化学教研室实验一实验一口腔粘膜细胞基因组口腔粘膜细胞基因组DNA制备制备基基基基因因因因组组组组DNADNADNADNA的的的的提提提提取取取取通通通通常常常常用用用用于于于于构构构构建建建建基基基基因因因因组组组组文文文文库库库库、SouthernSouthernSouthernSouthern杂交（包括杂交（包括杂交（包括杂交（包括RFLPRFLPRFLPRFLP）及）及）及）及PCRPCRPCRPCR分离基因等。

分离基因等。

分离基因等。

分离基因等。

是一般的基因工程实验中是一般的基因工程实验中是一般的基因工程实验中是一般的基因工程实验中DNADNADNADNA操作的最初步骤。

操作的最初步骤。

操作的最初步骤。

操作的最初步骤。

一、基因组一、基因组DNA的提取与纯化的提取与纯化目的：

目的：

二、人基因组二、人基因组DNA的制备的制备v实验目的及意义：

实验目的及意义：

从人口腔上皮细胞中提取纯的基因从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组组DNA掌握基因组掌握基因组DNA抽提的方法，理解抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理核酸分离纯化的基本原理分离纯化基因组分离纯化基因组DNA的常用方法：

的常用方法：

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组不同生物（植物、动物、微生物）的基因组不同生物（植物、动物、微生物）的基因组不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNADNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异。

的提取方法有所不同，分离方法也有差异。

的提取方法有所不同，分离方法也有差异。

的提取方法有所不同，分离方法也有差异。

主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似，主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似，主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似，主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似，因此它们有共同的步骤：

因此它们有共同的步骤：

因此它们有共同的步骤：

因此它们有共同的步骤：

v裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞：

SDSSDS裂解细胞，裂解细胞，裂解细胞，裂解细胞，EDTAEDTA抑制核酸酶抑制核酸酶抑制核酸酶抑制核酸酶v除去蛋白质除去蛋白质除去蛋白质除去蛋白质：

蛋白酶：

蛋白酶：

蛋白酶：

蛋白酶KK水解蛋白质，酚和氯仿水解蛋白质，酚和氯仿水解蛋白质，酚和氯仿水解蛋白质，酚和氯仿/异异异异戊醇抽提、分离蛋白质；戊醇抽提、分离蛋白质；戊醇抽提、分离蛋白质；戊醇抽提、分离蛋白质；v析出析出析出析出DNADNA：

乙醇沉淀使：

乙醇沉淀使：

乙醇沉淀使：

乙醇沉淀使DNADNA从溶液中析出。

从溶液中析出。

从溶液中析出。

从溶液中析出。

细胞样品的核酸提取的主要步骤细胞样品的核酸提取的主要步骤破碎细胞破碎细胞去除细胞内的其它分子：

去除细胞内的其它分子：

蛋白质蛋白质多糖多糖脂类脂类去除盐类、有机溶剂等杂质去除盐类、有机溶剂等杂质实验材料及试剂实验材料及试剂v材料：

材料：

材料：

材料：

人口腔上皮细胞人口腔上皮细胞人口腔上皮细胞人口腔上皮细胞v试剂：

试剂：

试剂：

试剂：

抽提缓冲液：

抽提缓冲液：

抽提缓冲液：

抽提缓冲液：

Tris-ClpH8.0Tris-ClpH8.0，EDTAEDTA，NaClNaCl，RNAaseRNAase，SDSSDS，蛋白酶，蛋白酶，蛋白酶，蛋白酶KK水饱和酚水饱和酚水饱和酚水饱和酚氯仿氯仿氯仿氯仿/异戊醇（异戊醇（异戊醇（异戊醇（V/V=24:

1V/V=24:

1）70%70%乙醇、无水乙醇乙醇、无水乙醇乙醇、无水乙醇乙醇、无水乙醇TETE缓冲液：

缓冲液：

缓冲液：

缓冲液：

TrisTris，EDTAEDTA主要试剂的功能主要试剂的功能v抽提缓冲液抽提缓冲液：

由：

由SDS、EDTA、蛋白酶蛋白酶K组成组成SDS的作用是裂解细胞的作用是裂解细胞EDTA的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对酶对DNA分子的降解作用。

分子的降解作用。

蛋白酶蛋白酶K的作用是水解蛋白质。

的作用是水解蛋白质。

v酚和氯仿酚和氯仿/异戊醇异戊醇：

抽提分离蛋白质：

抽提分离蛋白质v乙醇乙醇：

沉淀：

沉淀DNAvTE：

溶解：

溶解DNA取材取材:

用生理盐水漱口后，口含生理盐水用生理盐水漱口后，口含生理盐水1015ml约约23min，用，用15ml离心管（离心管（4000rpm10min）收集细胞沉淀）收集细胞沉淀（离心机的使用，平衡）（离心机的使用，平衡）加入加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至，转移至1.5mlEP管管（微量移液器的正确使用）（微量移液器的正确使用）混匀，混匀，65温育温育30min加入等体积的加入等体积的【饱和酚饱和酚（0.25ml）：

氯仿：

氯仿/异戊醇异戊醇（0.25ml）】充分颠倒混匀充分颠倒混匀（不要剧烈震荡！

）（不要剧烈震荡！

）实验步骤及注意事项（一人一份）：

实验步骤及注意事项（一人一份）：

12000rpm5min，上层水相转移至，上层水相转移至新的新的EP管管（高速离心机的使用与安全意识）（高速离心机的使用与安全意识）加入等体积加入等体积【氯仿氯仿/异戊醇异戊醇】，颠倒混匀，颠倒混匀12000rpm5min，上层水相转移到，上层水相转移到新的新的EP管管加入加入2倍体积倍体积无水无水乙醇，颠倒混匀乙醇，颠倒混匀12000rpm10min弃上清，沉淀中加入弃上清，沉淀中加入300l70%乙醇乙醇12000rpm2min轻轻弃去上清，打开轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置盖，室温静置510min加入加入30-50l0.1TE溶液，充分混匀后检测结果溶液，充分混匀后检测结果核酸分离纯化的原则：

核酸分离纯化的原则：

保证核酸一级结构完整保证核酸一级结构完整保证核酸一级结构完整保证核酸一级结构完整排除其它分子的污染：

排除其它分子的污染：

排除其它分子的污染：

排除其它分子的污染：

细胞内：

蛋白质、脂类、糖、细胞内：

蛋白质、脂类、糖、细胞内：

蛋白质、脂类、糖、细胞内：

蛋白质、脂类、糖、RNARNARNARNA等等等等提取过程中：

有机熔剂、金属离子、外源提取过程中：

有机熔剂、金属离子、外源提取过程中：

有机熔剂、金属离子、外源提取过程中：

有机熔剂、金属离子、外源DNADNADNADNA核酸提取注意事项核酸提取注意事项v减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解减少化学因素对核酸的降解如过量酸碱如过量酸碱如过量酸碱如过量酸碱v减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解机械剪切力：

强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融机械剪切力：

强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融机械剪切力：

强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融机械剪切力：

强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融高温高温高温高温v防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解核酸酶的预防核酸酶的预防核酸酶的预防核酸酶的预防常见问题：

常见问题：

1、提取的、提取的DNA不纯不纯原因？

改进的方法？

原因？

改进的方法？

2、提取的、提取的DNA成涂布状成涂布状原因？

改进的方法？

原因？

改进的方法？

3、没有获得足够量的、没有获得足够量的DNA改进的方法？

改进的方法？

分子医学实验注意事项分子医学实验注意事项v微量移液器的正确使用微量移液器的正确使用v离心机的正确使用离心机的正确使用v上课纪律上课纪律v撰写实验报告的规范撰写实验报告的规范实验结果及其分析实验结果及其分析定性分析：

定性分析：

DNA琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳电泳HLA基因多态性基因多态性分析分析PCR下次实验课进行下次实验课进行预习v电泳的原理泳的原理v基因基因诊断、分子断、分子诊断断vPCR的原理的原理v乙肝乙肝病毒病毒临床床检测方法方法vHLA基因基因实验报告格式实验报告格式v实验目的和应用价值实验目的和应用价值v实验原理实验原理v样品与试剂样品与试剂v实验基本流程和注意事项实验基本流程和注意事项v实验结果和讨论实验结果和讨论v总结或感想总结或感想完成两部分的作业：

课后作业，实验报告完成两部分的作业：

课后作业，实验报告其其它它vhttp:

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