整理紫外线诱变育种.docx

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整理紫外线诱变育种

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紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株

一、实验目的

1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。

2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。

二、实验原理

紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。

紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。

被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。

同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。

本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。

三、实验材料

1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌

2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10mL离心管、（1、5、10mL）吸管、250mL三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球

3.培养基和试剂

①无菌水、75%酒精

②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200mL，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。

③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，NaCl0.5g，琼脂2g，蒸馏水100mL，pH6.8～7.0，121℃灭菌20min。

④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，蒸馏水100mL，pH7.2～7.4，121℃灭菌20min。

四、实验步骤

1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20mL肉汤培养基的250mL三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。

2.菌悬液的制备取5mL发酵液于10mL离心管中，以3000r/min离心10min，弃去上清液。

加入无菌水9mL，振荡洗涤，离心10min，弃去上清液。

加入无菌水9mL，振荡均匀。

3.诱变处理将菌悬液倾于无菌培养皿中（内放一个磁力搅拌棒），置电磁力搅拌器上于超净工作台紫外灯下（距离30cm）照射0.5-1min。

4.取0.1-0.2mL诱变后菌悬液于选择培养基平板上，用涂布器涂匀。

置37℃暗箱培养48h。

5.在长出菌落的周围滴加碘液，观察并测定透明圈直径（C）和菌落直径（H），挑选C/H值最大者接入斜面保藏。

五、注意事项

1.紫外线对人体的细胞，尤其是人的眼睛和皮肤有伤害，长时间与紫外线接触会造成灼伤。

故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。

2.空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。

臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。

臭氧在空气中的含量不能超过0.1％-1％。

六、结果与讨论

1.利用紫外诱变育种，应注意哪些因素?

2.为什么诱变育种后要挑选C/H值最大者接入斜面保藏?

紫外线诱变处理的有效波长为200~300×10nm，最适为254nm（此为核酸的吸收高峰）。

dna和rna的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，dna分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响dna的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变。

诱变在暗箱中进行。

先将一定数量的种子用紫外线照射一段时间，然后再将种子培育出来，观察种子生长状况，发现产生了需要的性状后将该植株保留。

注意：

前期进行诱变的种子数量一定要多，因为种子发生突变的概率很小。

发酵工业是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢，从而获得某种产品。

现代发酵工业要求纯种培养，不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌，而且在需氧发酵中通入的空气也需经过除菌处理。

只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。

染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产。

工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。

发酵时感染杂菌，可引起下列后果：

1）       产生菌和杂菌同时在培养基中生长，结果丧失了生产能力；

2）       在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比产生菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主了；

3）       杂菌会污染最终产品，如生产单细胞蛋白时，从发酵液中分离出的细胞夹杂有杂菌；

4）       杂菌所产生的物质，使目的产物的提取发生困难；

5）       杂菌降解了所需要的产物；

6）       发酵时如污染噬菌体，可使产生菌发生溶菌现象。

二 染菌的检查、原因分析和防治措施

1 染菌的检查与判断

1）       显微镜检查：

通常用革兰氏染色法。

先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察是否有杂菌存在。

根据生产均与杂菌的特征区别，判断是否染菌。

必要时，可进行芽孢染色和鞭毛染色。

2）       平板划线培养或斜面培养检查法

3）       肉汤培养检查法：

此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。

此外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、pH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。

2 发酵染菌率和染菌原因分析

发酵染菌率：

指一年内发酵染菌的批数与总投料发酵批数之比。

发酵染菌率是在发酵罐中发生的染菌率，种子罐培养时发生的染菌若不接入发酵罐、不导致发酵染菌的不在计算之列。

由于各种发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件、设备和管理技术水平等不同，染菌率有很大差别。

3 杂菌污染途径及预防

杂菌污染途径及预防

1）     种子带菌。

原因主要有：

培养基及用具灭菌不彻底；菌种在移接过程中受污染；菌种在培养或保藏过程中受污染等。

2）     无菌空气带菌。

杜绝无菌空气带菌，必须从空气净化流程和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。

3）     培养基和设备灭菌不彻底导致染菌。

原因主要有：

原料性状影响灭菌效果；实罐灭菌时未能充分排出罐内空气；培养基连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而污染；设备、管道存在“死角”。

4）     设备渗漏引起染菌。

发酵设备、管道、阀门、的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。

5）     操作失误和技术管理不善也会引起染菌。

如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。

对噬菌体的防治措施

1）       定期检查噬菌体并采取有效措施消灭噬菌体。

当发酵生产中已经发现了噬菌体的危害后，应立即在车间的各个工段及发酵罐的空气过滤系统、发酵液和排气口、污水排放处以及车间周围的环境中进行取样检测，从中找出噬菌体较集中的地方继而采取相应的措施。

如对种子室和摇床间可采用甲醛熏蒸及紫外线处理的方法消灭噬菌体和杂菌。

对常用器皿及发酵罐体表面，可采用新洁而灭及石炭酸溶液喷雾或擦洗。

发酵系统则可采取改进空气过滤装置和蒸汽灭菌的方法。

2）       检查生产系统，消除各种不安全因素。

在发酵生产中，当连续发生噬菌体污染后，往往在空气过滤装置及发酵罐底部、内壁、夹层以及管道和阀门接口等处容易存在蒸汽不能直接进入灭菌的死角，必须及早查出隐患，定期更换空气过滤器中过滤材料并改进工艺和设备，杜绝发酵液中的活菌和可能存在的噬菌体向周围的环境排放，彻底消除各种不安全因素，保证生产的正常进行。

3）       选育抗噬菌体菌株和轮换使用生产菌株。

选育抗噬菌体菌株是一种有效的手段，所获得的抗性菌株既要有较全面的抗性，并能保持原有的生产能力。

对有的菌种在选育中很难做到既有抗性又能保持原有的生产能力。

在可能情况下，针对噬菌体对侵染寄主具有专一性的特点，采用轮换使用生产菌株的方法，也可防止噬菌体的蔓延和危害，使生产得以正常进行。

4）       应急的挽救措施。

在发酵生产中发现了噬菌体污染时，首先必须取样检查，并根据各种异常现象作出正确的判断，尽可能快地采取相应的挽救措施。

常用的应急方法有以下几种：

①     加入少量药物用以阻止噬菌体吸附或抑制噬菌体蛋白质的合成及增殖。

前者多系螯合剂如草酸及柠檬酸等；后者是一些抗生素，仅适用于耐药的生产菌株，由于成本较高，无法在较大的发酵罐中使用。

②     当生产进行中污染了噬菌体时，可补入适量的新鲜发酵培养基或促使菌种生长的生长因子（如玉米浆、酵母膏等），有利于菌种生长，抑制噬菌体的增殖，使发酵得以顺利进行。

③     大量补接种子液或重新接种抗性菌种培养液，以便继续发酵制终点，防止倒灌，尽可能地减少因噬菌体污染所造成的损失。

在补种之前也可对已感染了噬菌体的的发酵液低温灭菌。

第十一章工业发酵染菌的防治

第一节发酵染菌的危害

发酵染菌能给生产带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。

尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。

所谓“杂菌”，是指在发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。

几乎所有的发酵工业，都有可能遭受杂菌的污染。

染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者可能导致倒罐，甚至停产。

一，染菌对不同品种发酵的影响

青霉素

疫苗

柠檬酸

谷氨酸

肌苷、肌苷酸

酶制剂

二，不同种类的杂菌对发酵的影响

青霉素发酵：

污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大

链霉素发酵：

污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大

四环素发酵：

污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大

柠檬酸发酵：

最怕污染青霉菌

肌苷、肌苷酸发酵：

污染芽孢杆菌的危害最大

谷氨酸发酵：

最怕污染噬菌体

高温淀粉酶发酵：

污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大

三，不同染菌时间对发酵的影响

1，种子培养期染菌

菌体浓度低、培养基营养丰富

2，发酵前期染菌

杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成

3，发酵中期染菌

严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成

4，发酵后期染菌

如杂菌量不大，可继续发酵。

如污染严重，可采取措施提前放罐

四，不同染菌途径对发酵的影响

种子带菌：

种子带菌可使发酵染菌具有延续性

空气带菌：

空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐

培养基或设备灭菌不彻底：

一般为孤立事件，不具有延续性

设备渗漏：

这种途径造成染菌的危害性较大

五，染菌对产物提取和产品质量的影响

1，对过滤的影响

发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。

造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。

2，对提取的影响

（1）有机溶剂萃取工艺：

染菌的发酵液含有更多的水溶性蛋白质，易发生乳化，使水相和溶剂相难以分开

（2）离子交换工艺：

杂菌易粘附在离子交换树脂表面或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的交换量

3，对产品质量的影响

（1）对内在质量的影响：

染菌的发酵液含有较多的蛋白质和其它杂质。

对产品的纯度有较大影响。

（2）对产品外观的影响：

一些染菌的发酵液经处理过滤后得到澄清的发酵液，放置后会出现混浊，影响产品的外观。

六，染菌对三废处理的影响

使过滤后的废菌体无法利用，发酵染菌的废液，生物需氧量（BOD）增高，增加三废治理费用和时间。

七，发酵染菌的危害

1，直接经济损失

2，间接经济损失

第二节发酵过程中染菌的检查判断

一，杂菌的检查方法

借助适当的方法，才能正确而及时地发现发酵过过程是否污染杂菌和染菌的原因与途径。

检查杂菌的方法，要求淮确可靠和快速，这样才能在短时间内获得效果。

目前生产上常用的检查方法有：

①显微镜检查；②平板划线检查；③肉汤培养检查。

判断发酵是否染菌应以无菌试验结果为根据。

无菌试验的目的：

（1）监测培养基、发酵罐及附属设备灭菌是否彻底

（2）监测发酵过程中是否有杂菌从外界侵入

（3）了解整个生产过程中是否存在染菌的隐患和死角

二，各种检查方法的比较

3种方法各有优缺点，显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜捡取样少，视野的观察面也小，因此不易捡出早期杂菌。

平板划线法的缺点是需经较长时间培养（一般要过夜）才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能捡出更少的杂菌。

三，杂菌检查中的问题

1，检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据

2，平板划线和肉汤培养应做三个平行样

3，要定期取样

4，酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，确定为无菌时方可弃去

5，取样时防止外界杂菌混入的措施

四，检查的工序和时间

选择那些生产工序和时间的样品检查也是十分重要的问题。

科学合理的选择检查工序和时间，对于除去已污染杂菌的物料，避免下道工序再遭染菌，有着直接的指导意义。

有时即使由于检查时间较长，未能及时据导本批生产，但对于找出造成染菌事故的环节，分析染菌原因，杜绝染菌漏洞也是不可缺少的。

由于生产菌种相产品的不同，检查的时间也不完全一样：

但总的原则是一致的，即每个工序或经一定时间都应进行取样检查。

检查的一般时间或工序见下表。

发酵过程的杂菌检查

除了以上的方法外，在实际生产中还可以根据pH值、尾气中CO2含量和溶解氧等参数的异常变化来判断是否染菌。

第三节发酵染菌率和染菌原因的分析

发酵染菌能给生成带来严重危害，防止杂菌污染是任何发酵工厂的一项重要工作内容。

尤其是无菌程度要求高的液体深层发酵，污染防止工作的重要性更为突出。

发酵设备、空气除菌系统和培养基灭菌系统等的有关设备以及管道的配置都必须严格符合无菌要求。

如果设备结构和管道配置不合理，制造、安装不注意或在发酵过程中操作不慎就会使发酵液污染杂菌，导致产量下降甚至得不到产品。

在发酵前期或中期染菌，杂菌会很快消耗掉营养物质，使生产菌无法正常生长而引起倒罐。

在发酵后期染菌，虽然没有早期或中期染菌的影响大，一般会使产率下降并影响产物的提取，但如核苷酸等某些产品的发酵即使在后期染菌，也会使发酵产物被所染杂菌迅速消耗掉而得不到产品。

因此，染菌问题是影响产率和后工序操作的主要因素之一，必须予以重视。

认为染菌是不可避免的，这是一种错误看法。

“决定的因素是人不是物”。

只要我们思想上重视，对各个因素和环节周密考虑、严格掌握，是完全可以避免和减少污染的。

本节将根据以往工厂中发生染菌事故的经验教训来分析发酵系统中染菌的原因，来认识整个发酵过程中可能造成污染的各种途径并提出相应的防治措施。

由于发酵生产的连贯性强，在整个生产过程中各个环节的污染问题都不能忽视，所以本章除了着重讨论发酵设备方面的污染防止问题外，对于培养种子设备的要求和有关操作方法也作一般介绍。

一、发酵染菌率

1，总染菌率：

指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比乘以100得到的百分率。

2，设备染菌率：

统计发酵罐或其他设备的染菌率，有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因。

3，不同品种发酵的染菌率：

统计不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因。

4，不同发酵阶段的染菌率：

将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计其染菌率。

有助于查找染菌的原因。

5，季节染菌率：

统计不同季节的染菌率，可以采取相应的措施制服染菌。

6，操作染菌率：

统计操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的灭菌操作技术水平。

二、染菌原因的分析

避免在发酵生产中污染杂菌应以预防为主。

“防重于治”，事前防止胜于事后挽救。

如果一旦发生染菌现象就要尽快找出原因及时纠正、堵塞漏洞才能减少损失，并从中吸取经验教训，避免以后有类似情况发生，保持生产的正常进行。

但在发酵生产中，往往因为生产过程的环节很多，同时各工厂的生产设备、产品种类和管理措施不尽相同，引起染菌的原因比较复杂，有时不能及时找出而耽误了生产。

如果原因一经查出，解决的办法还是比较容易和迅速的。

所以，我们必须善于透过现象看本质，对染菌的情况作具体分析，不致盲目寻找而耽误了时间，也不致于将染菌的真正原因遗漏而造成连续染菌事故。

下面根据发酵工厂的生产经验，从一般染菌的现象来分析引起染菌的可能原因。

1，国外一抗生素发酵染菌原因的分析

染菌原因

百分率（%）

染菌原因

百分率（%）

种子带菌

接种时罐压跌零

培养基灭菌不透

空气系统带菌

搅拌轴密封泄漏

泡沫冒顶

夹套穿孔

9.64

0.19

0.79

19.96

2.09

0.48

12.36

蛇管穿孔

接种管穿孔

阀门泄漏

罐盖漏

其他设备漏

操作问题

原因不明

5.89

0.39

1.45

1.54

10.13

10.15

24.91

2，国内一制药厂发酵染菌原因的分析

染菌原因

百分率（%）

外界带入杂菌（取样、补料带入）

设备穿孔

空气系统带菌

停电罐压跌零

接种

蒸汽压力不够或蒸汽量不足

管理问题

操作违反规程

种子带菌

原因不明

8.20

7.60

26.00

1.60

11.00

0.60

7.09

1.60

0.60

35.00

上述资料是国内外抗菌素生产中统计了多年生产中发生染菌现象的各种原因所占的百分比，今列出以供参考。

从发酵工厂的生产经验来看，染菌原因是以设备渗漏和空气系统的染菌为主，其他则次之。

3，从染菌的规模来分析染菌原因

（1）大批发酵罐染菌

整个工厂中各个产品的发酵罐都出现染菌现象而且染的是同一种菌，一般来说，这种情况是由使用的统一空气系统中空气过滤器失效或效率下降使带菌的空气进入发酵罐而造成的。

大批发酵罐染菌的现象较少但危害极大。

所以对于空气系统必须定期经常检查。

（2）分发酵罐（或罐组）染菌

生产同一产品的几个发酵罐都发生染菌，这种染菌如果出现在发酵前期可能是种子带杂菌，如果发生在中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的。

通常同一产品的几个发酵罐其补料系统往往是共用的，倘若补料灭菌不彻底或管路渗漏，就有可能造成这些罐同时发生染菌现象。

另外，采用培养基连续灭菌系统时，那些用连续灭菌进料的发酵罐都出现染菌，可能是连消系统灭菌不彻底所造成的。

（3）个别发酵罐连续染菌和偶然染菌

个别发酵罐连续染菌大多是由设备问题造成的，如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损，特别是冷却管的不易觉察的穿孔等。

设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象，即第二批的染菌时间比第一批提早，第三批又比第二批提早。

至于个别发酵罐的偶然染菌其原因比较复杂，因为各种染菌途径都可能引起。

4，从染菌的时间来分析

发酵早期染菌，一般认为除了种子带菌外，还有培养液灭菌或设备灭菌不彻底所致，而中、后期染菌则与这些原因的关系较少，而与中间补料、设备渗漏以及操作不合理等有关。

5，从染菌的类型来分析

所染杂菌的类型也是判断染菌原因的重要依据之一。

一般认为，污染耐热性芽抱杆菌多数是由于设备存在死角或培养液灭菌不彻底所致。

污染球菌、酵母等可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的。

在检查时如平板上出现的是浅绿色菌落（革兰氏阴性杆菌），由于这种菌主要生存在水中，所以发酵罐的冷却管或夹套渗漏所引起的可能性较大。

污染霉菌大多是灭菌不彻底或无菌操作不严格所致。

综上所述，引起染菌的原因很多。

“世界上的事情是复杂的，是由各方面的因素决定的。

”我们不能机械地认为某种染菌现象必然是从某一途径引起的，应该把染菌的位置、时间和杂菌的类型等各种现象加以综合分析，才能正确判断从而采取相应的对策和措施。

第四节发酵染菌的防止

一、种子带菌的原因及防止

1，带菌的原因

（1）无菌室的无菌条件不符合要求；

（2）培养基灭菌不彻底；

（3）操作不当。

2，种子带菌的防止

种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。

在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。

种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。

（1）无菌室

接种、移种等无菌操作需要在无菌室内进行。

无菌室面积不宜过大，一般约4~6米2高约2.6米。

为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1~3个套间（缓冲过道）（参照下图）。

无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形，便于揩擦清洗以减少空气中微生物的潜伏场所，室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。

无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。

通常用30瓦紫外线灭菌灯照射20~30分钟即可。

紫外线杀菌的效率还与室内空气的性质有关；空气温度高杀菌效率高，空气中灰尘多杀调效率低，而相对湿度高则紫外线灯的使用寿命长。

紫外线能穿过石英但不能透过玻璃。

无菌室的立视图

配合使用的化学灭菌药剂有：

用作喷洒或揩擦的（以揩擦为主）有75%酒精、0.25%新洁而灭（季胺盐）、0.6~1%漂白粉、0.5%石炭酸、0.5%过氧乙酸、1%煤酚皂（来苏尔）、0.5%高锰酸钾、300单位/毫升土霉素、50单位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛（每立方米空间约用10毫升）或硫磺（每立方米空间约用2~3克）。

要根据不同情况采用不同的灭菌剂。

如检查出无菌室中潜伏的微生物中细菌较多，用石炭酸、土霉素等灭菌较好；如无菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌体则用甲醛、双氧水或高锰酸钾等较好。

无菌室内无菌度的要求是：

把无菌培养皿平板打开盖子在无菌室内放置30分钟，根据一般工厂的经验，长出的菌落在3个以下为好。

在种子的无菌条件不要求很高的情况下，可以不采用无菌室而直接用无菌箱进行操作，但无菌要求很高的情况下，即使在无菌室内还要用无菌箱操作。

无菌室的利用次数要恰当，每次使用时间也不宜过长。

用具要经蒸汽灭菌或用灭菌剂揩擦后才能带入使用。

（2）灭菌锅

灭菌锅是一种压力容器，作为培养种子及小型试验用具的灭菌之用，有立式和卧式两种。

灭菌操作时需要注意排气管是否畅通，因为灭菌锅的排气管较小，易被铁锈或瓶子破碎后的培养基等所堵塞。

如果排气管不道，锅内空气排不出去形成气团，蒸汽就不易渗入，从而使灭菌不彻底。

用某种较耐热的芽抱杆菌进行试验证明：

在排气不通畅的情况下，以1公斤/厘米2的蒸汽压力经30分钟灭菌后进行检查，发现某些部位的三角瓶中，灭菌前放入的芽抱杆菌没有被杀死。

如果不是采用蒸汽而是用锅内烧水的办法进行灭菌，那末排气的时间更要长一些，不然水蒸汽来不及驱出空气而使被灭菌的瓶中的冷空气排不尽。

通入蒸汽后使瓶内培养基温度达到121ºC所需的时间与瓶内培养基的体积有关，其试验结果见下表。

通入表压为1公斤／厘米2的蒸汽时，三角瓶中培养基的体积与升温时间的关系

实际上，使用蒸汽的压力一般大于1公斤/厘米2，所以上表的数据仅供对照参考，但根据上表的试验结果可以说明培养基