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单核细胞增生性李斯特菌分离鉴定上海市疾病预防控制中心上海市疾病预防控制中心微生物室微生物室许学斌许学斌分类学单核细胞增生性李斯特菌（人兽共患病原菌）无害李斯特菌绵羊李斯特菌伊氏亚种（偶致动物发病）绵羊李斯特菌伦敦亚种威氏李斯特菌斯氏李斯特菌格氏李斯特菌默氏李斯特菌流行病学单核细胞增生性李斯特菌（简称LM）广泛存在于自然界中，不易被冻融，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有存在，易被禽畜类动物食入或在宰杀过程中污染胴体而形成人的食源性疾病污染源；乳及含乳类制品是另一大类较易被污染的食品，近年来，国外加强了对即食类食品（read-to-eat）的LM检测。

严防“病从口入”。

流行病学在临床上对成年人（非孕妇）主要引起脑膜炎、脑炎或败血症；老年人或免疫力低下者易感。

主要损伤中枢神经系统，死亡率（2050%），预后不良。

对孕妇能造成感冒样菌血症，治疗未及可危及胎儿。

潜伏期及感染剂量不明，可以从几天到23个月。

流行病学LM的易感对象重点以孕妇为主，也有新生儿脑膜炎病例和免疫力低下的全身（中枢）或局部症状发病报道。

由于该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，性接触也是一种潜在的传播途径。

流行病学食源性病例可以是散发或暴发流行，主要传播媒介是污染的食品，也有与食品无关的类似医院内的暴发，主要发生在托儿所。

在部分国家，其发病率为0.50.8例/10万人。

发病机理和体液免疫的作用尚不清楚。

致病性LM进入人体后发病与否和宿主的年龄及免疫状态有关，该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对其的清除主要依赖细胞免疫机制。

发病机制LM由寄生物介导的细胞内增殖，使它附着及进入肠细胞粘膜与巨细胞吞噬系统；抗活化的巨噬细胞，LM有细菌性过氧化物歧化酶，可使它抗活化巨噬细胞内过氧化物（杀菌的毒性游离基团）分解作用。

溶血素O，可以从培养物上清夜中获得，有和两种，为毒力因子。

LM的毒力因子李斯特菌溶解素（LLO）：

系由hly基因编码的Hly蛋白，是一种孔形成毒素，与破坏吞噬体，促进菌体进入胞液有关，是主要的毒力因子。

ActA蛋白磷脂酶CP60蛋白LM的毒力因子PrfA蛋白内化素表面蛋白P104：

除了内化素外，LM另一种表面蛋白P104也已被证实对于肠道细胞的粘附非常重要。

临床表现LM有嗜神经性质，所以患者表现以神经症状最为明显。

其中以李斯特性脑膜炎，神经系统性李斯特病、败血症、脓毒血症最为凶险，表现为起病急剧，发热（39以上），意识障碍、昏迷、肢体麻痹以及小脑功能障碍。

病人即使幸免遇难，也常常留下共济失调、失语、眼球麻痹、肢体瘫痪等后遗症。

病死率达2030%，使用抗生素治疗可降低病死率。

临床表现感染LM的孕妇多表现有宫内感染并可发生早产、流产、死胎，预后险恶。

产下的婴儿常在2472h内死亡。

有时可侵犯上呼吸道而呈现咽峡炎的症状，常伴有局部淋巴腺炎。

可引起人的心内膜炎，并可感染皮肤、眼睛、泌尿道而引起皮肤损伤、结膜炎、尿道炎等症状。

临床表现人和动物感染LM时，以血中单核细胞明显增多为重要特征，为此以前人们误以为本菌是传染性单核细胞增多症的病原菌。

发生LM的脑膜炎时，脑脊液的单核细胞和中型粒细胞极度增多，糖下降而蛋白升高。

LM脑膜炎的临床症状的多样性和血清检测无严格的特异性，为本病的诊断带来一定困难，本病确诊依赖细菌培养。

预防和干预措施LM在食品的一般热加工处理中能存活，热处理会杀灭竞争性细菌群，使LM在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到70持续2分钟以上。

由于可能存在二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。

冰箱中的食品可能增加LM食物中毒的危险，需要加热后食用。

加强食品从生产源头到产品流通的全程控制，提高安全评价标准。

临床标本采集、转运和保存无菌组织的标本（血、脑脊液、羊膜水、胎盘或组织）应立即培养或在4保存48h；粪便多以肛拭子采集，如不能马上增菌者需冷冻保存；其它非无菌性样品可在4保存12d。

长期保存样品推荐冷冻保存。

食品标本采集和菌株的转存食品标本：

不低于100g样品必须无菌采集至灭菌容器中，在冷冻条件下运输，尽量避免反复冻融。

菌种的转运：

在无糖的斜面（TSA）上保菌，注意实验室安全。

由于其感染剂量尚不明确，实验室人员应意识到潜在的危险性。

李斯特菌属生物学特征李斯特菌属为兼性厌氧菌，不产生芽孢，无分支，革兰阳性短杆菌，细胞单生或短链状。

最适生长温度为3037，但能在4缓慢生长。

一般培养和生化特征李斯特菌属在较老的或粗糙型培养物上可能呈620m的丝状菌体，在28培养的菌体有15根周鞭毛，可运动，在营养琼脂上37培养12d为12mm菌落，在45角透射光斜射下呈蓝灰色。

李斯特菌鉴定除个别菌外，触酶阳性，氧化酶阳性，水解七叶苷，不水解尿素、明胶，不产生H2S、吲哚。

发酵葡萄糖和其它种类糖产酸。

属的鉴定：

革兰染色，湿标本中的翻转运动试验，触酶阳性，发酵D-葡萄糖产酸，水解七叶苷，VP阳性，甲基红阳性。

李斯特菌鉴定种的鉴定：

窄的溶血环，CAMP表现和金黄色葡萄球菌有协同溶血作用，不发酵木糖，微量鉴定系统API-Listeria（法国生物梅里埃）和Micro-IDListeria（OrganonTeknika），菌落DNA探针杂交。

血清型分型确认。

致病力检测动物试验可用于分离的李斯特菌的潜在毒力，如小鼠腹膜内接种、兔眼结膜接种（Anton）试验、鸡胚绒毛膜尿囊接种。

但并非是常规的，因为大多数刚分离出的单核细胞增生性李斯特菌株都有毒力。

已经建立了一种敏感的免疫抑制小鼠模型，少量的有毒力菌即可导致小鼠在3d内死亡。

针对LM的实验室检查原则采自正常无菌部位的临床标本可直接接种在含5%羊、马、兔血的胰大胨琼脂平板（TSA）上；血标本接种到常规血培养瓶中；有菌部位的临床标本、食品及环境标本，在接种平板前应先选择性增菌。

LM的实验室检测方法传统分离培养检测及鉴定方法：

对于分离培养后的可疑菌落做生化反应试验、溶血试验、CAMP协同溶血试验、典型运动及动物试验等鉴定，被确定为李斯特菌后进一步进行血清分型；增菌和选择性增菌是不可缺少的步骤，增菌主要有冷增菌和快速增菌两种。

LM的实验室检测方法国际常用的增菌法主要有国际乳业联盟（IDF）、美国食品药品管理局（FDA）、美国农业部（USDA）的增菌法、欧盟通用的荷兰食品监察局（NGFIS）的增菌方法和国际标准化组织（ISO）的增菌法。

其中FDA制定的方法为国际公认的权威方法之一，许多检测都以FDA法作为参照。

LM的实验室检测方法我国使用的检测LM方法主要有国标法（GB4789.30-1994）和SN法（SN0184-93）。

国标法在LEB中增菌后划线接种MMA平板，再分别于SIM和TSI上作生化初筛，后于TSA-YE平板上纯化后做系统生化鉴定、报告结果。

不同LM的检测方法应用比较（文献）标本标本数量数量检出检出总计总计FDA法法NGFIS法法国标法国标法符合率符合率（%）PALOXALMBPAL（%）MMA（%）污水污水2042（50）2124（100）0食品用具食品用具50127（58）54611（91.67）3（25）生牛奶生牛奶8055（100）4544（80）3（60）盒装奶盒装奶2301414（100）12131210（71.4）11（78.5）生猪肉生猪肉5043（75）3323（75）2（50）各类熟食各类熟食501816（88.9）13121414（77.78）11（61.1）总计总计4785747（82.5）46（80.7）30（52.6）LM的实验室检测方法显色培养基快速鉴定技术：

针对LM的-D-葡萄糖苷酶和毒力因子PI-PLC酶，设计相应的底物，加入到常规选择性培养基中，利用酶对底物的分解，产生荧光物质或显色物质，使其菌落形态或颜色不同于其它李斯特菌属和非李斯特菌，从而实现对LM快速鉴定和菌落数目的快速定量。

这是当前开发新型显色或荧光鉴别培养基的基本原理。

CHROMagar/BD/Oxoid/ALOALM在哥伦比亚血平板、显色平板、MH血平板上24h的菌落形态绵羊李斯特菌在哥伦比亚血平板、显色平板、MH血平板上24h的菌落形态其它李斯特菌的24h平板形态特征LM在哥伦比亚血平板48h的溶血菌落LM在CHROMagar平板48h菌落形态绵羊李斯特菌哥伦比亚血平板48h菌落形态绵羊李斯特菌平板在CHROMagar平板48h菌落形态（右）其它李斯特菌在CHROMagar平板48h菌落形态一种添加了半胱氨酸和蛋氨酸的HTM培养基LM的实验室检测方法数值分类鉴定和新型计数技术最常用且普遍被认可的是API-Listeriatest。

共包括10个生化反应，通过查询代码表可以对LM和李斯特属内的菌作快速鉴定。

传统的计数以平板计数和MPN两种方法为主。

现在有一种经过改良的疏水网膜（HGMF）技术适用于好氧菌计数，它采用的ISO-GRIO系统，具有1600个小方格的网膜，能浓缩样品细菌，除去抑制物，同时利于细菌在培养基间转移时活力的恢复。

LM的实验室检测方法1987年首先报道了针对LM鞭毛抗原的单克隆抗体ELISA检验程序，可以在23d内从污染样品中检出LM。

1992年以特异的单克隆抗体建立的夹心ELISA方法能于2024h内检出810cfu/g，第一次做到以免疫学方法把LM与非病原性李斯特菌分开。

2004年报道了以免疫为基础的生物传感器可以在24h内检测10100cfu/g样品。

LM的实验室检测方法其它以抗原-抗体反应为基础的免疫学方法：

免疫胶体金技术免疫磁珠分离菌体和核酸提纯技术免疫磁珠PCR技术酶免疫发光技术快速检测商品化的用于食品标本中快速检测李斯特菌属的增菌肉汤都是基于免疫学原理的，应用单克隆抗体（比利时Organon-Teknika生产的Listeria-Tek）、Listeria免疫试剂盒（法国Transia产品）、VIDAS-LMO（法国生物梅里埃产品）、Listeria（英国Oxoid产品）这些方法具有属特异性，Listertest（VICAM，watertown，Mass.）及单核细胞增生性李斯特菌DNA探针（Gene-Tank，Framingham，Mass）有种特异性。

这些试剂盒不是为了临床标本的检验诊断或治疗而设计的。

脑脊液中及组织中单核细胞增生性李斯特菌的DNA能以PCR方法检测。

应该在专门的实验室中操作，方法的敏感性、特异性高，当抗生素的使用影响细菌的分离时尤其有用。

LM的实验室检测方法LM分子检测技术PCR检测技术：

用特异引物，一种依据LM的毒力基因序列设计，常以hlyA、iap、inl、Dth-18作为靶序列；另一种以LM的16S序列或16S/23S中间保守区域为靶序列设计引物。

此外，近年被发展的PCR-ELISA、realtime-PCR等技术是尝试以分子手段对LM作快速计数。

检测LM的hlyA、23SRNA多重PCR体系（上海CDC提供）LM多重PCR（上海CDC提供）单一或多重PCR检测LM特异基因其它和LM相关分子检测技术探针检测技术：

特异性好。

BAX-system：

自动PCR检测分析，2002年被英国农业食品和监测局（FSIS）采纳用来检测鲑鱼中的LM。

有报道利用改良的快速增菌法结合BAX可以在24h内检测样品的LM。

现阶段检测LM存在的问题虽然传统方法不适应当前卫生微生物快速、准确、灵敏、特异检测的要求，但在暴发流行的检测中仍是不可替代。

发展免疫学的快速方法检测LM需要克服对LM单克隆抗体制备的技术。

分子检测的阳性样品要以传统方法作参照，不能完全替代。

重视并做好对样品的前处理工作。

建议对商品化的检测LM的产品和技术进行评估分析。

加强对目前开展的检测LM方法的各类实验室的方法学比较研究和评估分析。

对分子检测技术，如PCR体系进行实验室认可或标准化体系的建立，规范统一使用，提高结果的可信度。

加强对临床病例的监测诊断，提高检出率。

LM分型技术血清分型噬菌体分型多位点酶切电泳DNA限制性图谱脉冲场凝胶电泳（PFGE）随机引物扩增多态性DNA目前分亚型的状况绝大多数能引起散发感染或暴发感染的单核细胞增生性李斯特菌株属于1/