粮油检验谷物中黄曲霉毒素B1的快速测定免疫层析法编制说明.docx

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粮油检验谷物中黄曲霉毒素B1的快速测定免疫层析法编制说明

《粮油检验谷物中黄曲霉毒素B1的快速测定—免疫层析法》

编制说明

标准起草组

2011年11月

《粮油检验谷物中黄曲霉毒素B1的快速测定

—免疫层析法》编制说明

一．制定本标准的必要性及意义

二．

黄曲霉毒素B1（AFB1）是目前已知致癌性和毒性极强的化学物质之一，能致癌、致畸、致诱变。

世界上很多国家都对AFB1设定了严格的限量标准。

当前国家标准中对黄曲霉毒素B1的检测手段主要有免疫亲和层析净化高效液相色谱法（HPLC法）和酶联免疫吸附法（ELISA法）。

但是HPLC法法设备费用昂贵难以普及，ELISA法检测时间长，因此不可能作为粮食现场收购的快速检测。

快速检测卡能够在较短的时间完成内对粮食谷物中的黄曲霉毒素B1的检测，可以对粮食谷物中黄曲霉毒素B1是否超标进行初筛。

但是检测卡操作步骤、样品提取方法和提取时间、以及方法的准确性等等还不够完善，有必要进一步研究试验、验证，制定规范、简单、高效的快速检测卡测定谷物中黄曲霉毒素B1的行业标准方法。

三．工作基本情况

四．

按照粮油标准化技术委员会和国家粮食局标准质量中心的要求，由湖北省粮油食品质量监测站、北京国家粮油质检中心、重庆粮油质检中心和广西粮油质检中心参与标准的制订研究工作，湖北省粮油食品质量监测站负责起草本标准。

该标准制定任务下达后，成立了标准起草工作小组，制定了工作计划，开展的主要工作如下：

1.查阅相关文献和与有关真菌毒素检测卡生产企业沟通，了解检测卡运用情况。

2.2008年6月中旬采集黄曲霉毒素B1的阳性稻谷和玉米样品，用国标方法对样品进行制备和定值。

3.2008年7月18-19日在国家粮食局标准质量中心的组织领导下，湖北省粮油食品质量监测站、北京国家粮油质检中心和2家检测卡厂家在湖北站召开了快速检测卡测定谷物中黄曲霉毒素B1的国家标准制订研讨会及检测方法研究实验，进行了“不同样品提取液的验证实验”、“样品不同粉碎颗粒的验证实验”、“探讨制备样品均一性问题和样品的定值方法”等实验。

广泛征求各方意见，完善操作方法。

4.2008年10月17-18日，在湖北站对上海快灵和德国拜发的快速检测卡进一步进行了验证试验，确定了检测卡操作方法、样品粉碎目数、阳性样品的制备方法和验证试验方案。

5.2009年3月在北京国家粮油质检中心，国家粮食局标准质量中心组织3家省级质监站、南京财经大学、厂家代表及相关专家，召开了“快速检测卡验证实验方法”讨论会，完善并制定了检测卡验证方案和高效液相色谱测定样品黄曲霉毒素B1的具体技术要求。

6.2009年4-9月，3家省级质监站依据验证方案进行了大量的验证试验，并汇总数据形成报告，基本确定了实验操作方法和相关技术要求，9月底形成标准草稿。

7.2009年11月，在湖北省粮油食品质量监测站对标准草稿进行讨论，根据讨论会上有关专家的意见，完善标准内容，补充了试验数据，形成了标准讨论稿。

8.2011年5月对目前国内市场上使用的主要品牌的国产和进口黄曲霉毒素B1快速检测卡进行验证实验。

9.2011年8月，在浙江省粮油质检中心召开了粮油标准基础研究项目快速测定法研讨会，会上对本标准方法文本进行研讨，提出完善方案。

三.标准编制原则

1.本标准在制订过程中遵循“科学性、适用性、规范性”的原则，与有关检测卡生产企业联合，在生产企业提供的方法上通过实验，不断完善黄曲霉毒素B1快速检测卡的检测方法，并用国标法规定的高效液相色谱法测定结果作为快速检测卡检测结果确认依据，使方法具有科学性；对易产生黄曲霉毒素B1的主要粮种稻谷、玉米进行方法验证实验，同时对目前国内市场上使用的国产和进口的黄曲霉毒素B1快速检测卡进行验证实验，使方法具有适用性；对检测方法的各个步骤、各项指标结合参考厂家提供的方法及实际运用要求进行改进，使标准方法具有快速和广泛的实用性。

2.本标准按照GB/T1.1-2009、GB/T20000.2-2009和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分化学分析方法》的规定和要求编写，在标准框架、结构和内容等方面符合这些标准的要求。

3.强制性国家标准《粮食卫生标准》规定了粮食中黄曲霉毒素B1的安全限量，且本标准所确定的检测方法能满足该标准的初步筛选测定。

四.标准的主要内容

本标准为推荐性标准，主要结构内容包括：

1.封面

2前言

3标准的主体内容：

范围、原理、仪器设备、试剂、操作步骤、结果判断和结果确认。

3.1范围：

本标准适用于稻谷、糙米、玉米等谷物的黄曲霉毒素B1是否超过国家标准允许限量值的快速筛选测定。

3.2原理：

对目前国内外已有的快速检测卡原理进行分析，其方法原理主要有两种：

一是采用非竞争结合的双抗体夹心法的免疫层析检测卡；二是采用竞争结合的胶体金法检测卡。

这两种检测卡都是基于特异性抗原抗体反应和免疫层析技术，但是，双抗体夹心法利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子（黄曲霉毒素B1）上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。

测试时，样品中黄曲霉毒素B1与固相载体上的抗体结合后再与检测带上的酶标抗体结合而显色，表明为阳性样品；反之，检测色带不显色，结果为阴性。

而胶体金法通过特异标记抗体竞争结合固定在硝酸纤膜上的AFB1-BSA（BSA,牛血清白蛋白）完全抗原和样品中被检测抗原分子（黄曲霉毒素B1）。

测试时，样品中的黄曲霉毒素B1在渗移过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素膜上AFB1-BSA完全抗原的结合，使测试区的检测色带不显颜色，结果为阳性；反之，检测色带显红色，结果为阴性。

3.3提取试剂：

乙酸乙酯或甲醇水。

3.4操作步骤：

制备有代表性的样品粉碎混匀，加入提取试剂提取，离心，取一定体积的上清液，吹干加入适量的稀释液或直接加入适量的稀释液，点样分析。

3.5结果判断：

检测卡中有两种色带，质控色带（controlline）和检测色带（testline）。

质控色带是用于证明检测条是否正常，显色表示检测卡是正常的。

检测色带的有无是用来定性判断样品是阴性还是阳性；或者显色时间的长短来半定量判断样品中黄曲霉毒素的含量多少。

3.5.1免疫层析检测卡的结果判断：

阴性：

如果只有质控色带清楚显现，说明样品中不含黄曲霉毒素B1或含量小于对应的检测限。

阳性：

如果质控色带和检测色带都显现，说明样品中含有黄曲霉毒素B1。

依据检测色带显色的时间段不同来确认样品中黄曲霉毒素B1含量大小。

比如拜发检测卡，如样品中含有黄曲霉毒素B1含量是20μg/kg则检测色带约4分钟后显色，含量是10μg/kg则检测色带约8分钟后显色，含量是4μg/kg则检测色带约16分钟后后显色。

3.5.2胶体金检测卡的结果判断：

阳性：

质控区显示出红色线条，检测区不显示出红色线条，判为阳性，即样品中黄曲霉毒素B1含量大于对应的国家标准允许限量。

阴性：

质控区显示出红色线条，检测区同时显示出红色线条，判为阴性。

即样品中不含黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B1含量小于对应的国家标准允许限量。

五.标准的验证测定实验及结果分析

1．试样制备的验证

本方法为快速检测法，考虑能否对整颗粒样品进行直接检测，尽量达到快速检测的目的。

对整颗粒样品、100%过20目筛的样品进行了实验，从表一中可知整颗粒样品检测结果的准确性小于65%，而过20目筛的样品就检测结果的准确性大于90%。

因此本标准方法要求待测样品必须粉碎，粉碎后100%过20目筛。

表一：

整颗粒样品的检测结果

样品

编号

检测卡判定结果

真实值/（μg/kg）

整颗粒糙米

1

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

0.85

2

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

5.1

3

阳性,>10μg/kg

阳性,>10μg/kg

8.4

4

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

19.8

5

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

0.85

6

阳性,>10μg/kg

阳性,>10μg/kg

25.4

7

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

0.85

8

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

4.1

9

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

13.1

10

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

15.7

11

阳性,>10μg/kg

阳性,>10μg/kg

30.5

整颗粒玉米

1

阴性,<20μg/kg

阴性,<20μg/kg

56.55

2

阳性,>20μg/kg

阳性,>20μg/kg

119.9

3

阴性,<20μg/kg

阴性,<20μg/kg

149.8

4

阴性,<20μg/kg

阴性,<20μg/kg

89.7

5

阳性,>20μg/kg

阳性,>20μg/kg

66.5

6

阴性,<20μg/kg

阴性,<20μg/kg

未检出

7

阴性,<20μg/kg

阴性,<20μg/kg

50.4

8

阴性,<20μg/kg

阴性,<20μg/kg

24.8

粉碎后过20目筛的样品检测结果

样品

编号

检测卡判定结果

真实值/（μg/kg）

糙米

1

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

0.85

2

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

5.1

3

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

8.4

4

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

19.8

5

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

0.85

6

阳性,>10μg/kg

阳性,>10μg/kg

25.4

7

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

0.85

8

阴性,<10μg/kg

阴性,<10μg/kg

4.1

9

阳性,>10μg/kg

阳性,>10μg/kg

13.1

10

阳性,>10μg/kg

阳性,>10μg/kg

15.7

11

阳性,>10μg/kg

阳性,>10μg/kg

30.5

玉米

1

阳性,>20μg/kg

阳性,>20μg/kg

56.55

2

阳性,>20μg/kg

阳性,>20μg/kg

119.9

3

阳性,>20μg/kg

阳性,>20μg/kg

149.8

4

阳性,>20μg/kg

阳性,>20μg/kg

89.7

5

阳性,>20μg/kg

阳性,>20μg/kg

66.5

6

阴性,<20μg/kg

阴性,<20μg/kg

未检出

7

阳性,>20μg/kg

阳性,>20μg/kg

50.4

8

阳性,>20μg/kg

阳性,>20μg/kg

24.8

2.阳性样品制备的验证

由于扦取不同浓度的阳性天然样品数量有限，而且验证实验要求进行梯度浓度的样品验证，所以采取通过称量不同质量的阳性样品和阴性样品，然后进行混匀的方法来配置不同浓度梯度的阳性样品。

首先，要保证用于配制样品的阳性样品中黄曲霉毒素B1含量的准确性，因此参加验证单位首先对配制样品用高效液相色谱法进行定值实验，定值的结果取得了一致（见表二）后再按照称取不同质量的阴性和阳性样品进行互混的方法，配制不同浓度样品。

再通过高效液相色谱法定值，并与互混配制的样品理论值比较，（见下表三、四）证明该方法是可行的。

表二：

样品的定值实验结果

样品

检测结果/μg/kg

备注

湖北

北京

重庆

用HPLC法测定，结果基本一致且符合方法的误差要求

玉米

32.9

32.8

32.5

玉米

56.55

57.07

56.41

糙米

1.4

1.5

1.7

糙米

110

106.5

105.4

表三：

玉米样品的配置实验数据

编号：

阳性样品（56.6μg/kg）称样量/g

阴性样品称样量/g

理论值/HPLC测定值/μg/kg

1

2.5199

22.4801

5.7/4.8

2

4.4392

20.6125

10/9.2

3

7.0757

17.9248

16/15.2

4

8.8418

16.1621

20/19.1

5

11.4926

13.50367

26/24.9

6

0

25

未检出

表四：

糙米样品的配置实验数据

编号：

阳性样品（110μg/kg）称样量/g

阴性样品称样量/g

理论值/HPLC测定值/μg/kg

1

1.4773

23.5227

6.5/5.1

2

2.1591

22.8409

9.5/8.3

3

2.5000

22.5000

11/10.6

4

3.4091

21.5909

15/14.2

5

4.5455

20.4545

20/21.4

6

0

25

未检出

3.试样提取试剂的选择

黄曲霉毒素易溶于甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙腈、苯、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺等有机溶剂，其中以甲醇作为提取试剂的方法已经广泛的应用。

但是考虑到各种试纸条的制作机理和提取试剂的提取效率，部分厂家选择乙酸乙酯作为提取试剂，方法的稳定性、准确性大于甲醇水作为提取试剂的方法（如下表五）。

因此针对不同的检测卡选用不同的提取溶液进行操作。

表五：

不同提取溶液的检测结果

样品

乙酸乙酯提取法

甲醇水提取法

所作样品数量

准确率/%

所作样品数量

准确率/%

糙米粉碎样

10

100

10

70

玉米粉碎样

10

90

10

60

4.对不同浓度梯度的样品进行快速检测卡的验证试验

依据国家粮食卫生标准GB2715-2005糙米的黄曲霉毒素B1的限量≤10μg/kg,玉米的黄曲霉毒素B1的限量≤20μg/kg，制备了不同浓度梯度的糙米和玉米样品。

糙米中黄曲霉毒素B1浓度含量梯度为小于5μg/kg，5-10μg/kg，10-15μg/kg，大于15μg/kg；玉米中黄曲霉毒素B1浓度含量梯度为小于10μg/kg，10-20μg/kg，大于20μg/kg。

湖北、北京和重庆3家质检机构分别用拜发和快灵检测卡共测定糙米样品21份和玉米粉碎样品21份，结果见附件1。

结合检测卡的检测误差范围，从三家质检机构的检测结果（见表六）中可判断糙米样品的结果判定准确率，快灵达到90.5%，拜发达到100%；玉米样品的结果判定准确率，快灵达到90.5%，拜发达到100%。

表六：

检测卡的检测结果分析表

样品

份数

AFB1含量区间/μg/kg

准确率/%

拜发

快灵

糙米

21

1.0-23.2

100

100※

85.7

90.5※

玉米

21

0.87-32.3

100

100※

81.0

90.5※

备注：

准确率打※，表示判定结果考虑了检测卡的检测误差

综合以上实验数据，快灵公司检测卡的准确性达到90.5%，拜发公司检测卡的准确性达到100.0%

5.检测卡稳定性验证

标准方法中快速检测卡检测双实验结果均要求一致，因此进行了同批次、不同批次检测卡的稳定性验证试验。

试验结果分析如下：

5.1同批次检测卡的测试结果分析

拜发和快灵检测卡分别对9份玉米样品和9份糙米样品进行测定（具体数据见附件2），糙米的黄曲霉毒素B1浓度含量区间8.0-17.6μg/kg，玉米的黄曲霉毒素B1浓度含量区间6.2-30.3μg/kg。

每份样品至少进行四次测定，对于糙米共检测54次，拜发的准确性达到100%，快灵的准确性达到96.3%；对于玉米共检测54次，拜发的准确性达到98.1%，快灵的准确性达到94.4%（见表七）。

表七：

同批次检测卡的稳定性验证试验结果分析表

样品

检测次数

AFB1含量区间/μg/kg

厂家

拜发

快灵

9份糙米

54

8.0-17.6

100

100※

94.4

96.3※

9份玉米

54

6.2-30.3

98.1

98.1※

94.4

94.4※

备注：

准确率打※，表示判定结果考虑了检测卡的检测误差

5.2不同批次检测卡的测试结果分析

两个厂家各三个不同批次的检测卡分别对7份玉米和5份糙米样品测定（具体数据见附件3），玉米的黄曲霉毒素B1浓度含量区间0.87-29.6μg/kg，糙米的黄曲霉毒素B1浓度含量区间1.0-19.8μg/kg。

每份样品均进行双测定，双测定的结果完全一致，同时三个批次间的判定结果也完全一致，重现性达到100%，准确性也达到100%（见表八）。

表八：

不同批次检测卡的稳定性验证试验结果分析表

样品

份数

AFB1含量区间/μg/kg

批次

重现性/%

准确性/%

糙米

5

1.0-19.8

3

100

100

玉米

7

0.87-29.6

3

100

100

6方法误差实验

标准方法中提出了方法的检测误差范围，规定糙米样品和玉米样品的检测误差范围分别是±2μg/kg和±4μg/kg，在误差范围内样品中黄曲霉毒素B1浓度超过国家标准限量范围只能判阳性，不能判阴性。

误差实验针对黄曲霉毒素B1含量在国家限量附近的样品，如下表九，判定结果准确性是90%（具体见附件四）。

表九：

方法的误差实验结果

样品

份数

AFB1含量区间/μg/kg

准确性/%

糙米

10

8.125-12.945

90

玉米

10

19.825-20.667

90

7.最低检出限实验

依据检测卡的最低检出限，制备相对应浓度的标准品溶液用检测卡进行快速测定。

测定结果如下表十和十一，快灵检测卡的最低检出限为5μg/kg，拜发检测卡的最低检出限为4μg/kg。

表十快灵检测卡的测定结果

样品溶液

判断结果

1

2

稀释液

阴

阴

稀释液

阴

阴

1ng/ml标准溶液

阴

阴

3ng/ml标准溶液

阴

阴

5ng/ml标准溶液

阳

阳

7ng/ml标准溶液

阳

阳

7ng/ml标准溶液

阳

阳

5ng/ml标准溶液

阳

阳

3ng/ml标准溶液

阴

阴

1ng/ml标准溶液

阴

阴

表十一拜发检测卡的测定结果

样品溶液

T线清晰度

质控色带显色

结果判断

4分钟后

8分钟后

16分钟后

稀释液

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

稀释液

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

1ng/ml

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

1ng/ml

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

1.5ng/ml

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

1.5ng/ml

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

2ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg

2ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg

2.5ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg—10μg/kg

2.5ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg—10μg/kg

3ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg—10μg/kg

3ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg—10μg/kg

稀释液

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

稀释液

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

1ng/ml

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

1ng/ml

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

1.5ng/ml

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

1.5ng/ml

无色带

无色带

无色带

清晰

<4μg/kg

2ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg

2ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg

2.5ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg—10μg/kg

2.5ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg—10μg/kg

3ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg—10μg/kg

3ng/ml

无色带

无色带

可见

清晰

4μg/kg—10μg/kg

8.国内外不同厂家快速检测卡的验证

2011年5月，在国家粮食局标准质量中心的统一组织下，在湖北站，由北京、河南、安徽、湖北等4省的检验人员及有关专家共同对目前国内销售的国内外不同品牌的黄曲霉毒素B1快速检测卡进行验证实验。

通过市场随机购买方式，共购得6个品牌、两个批次的黄曲霉毒素B1快速检测卡，检测了稻谷（碾成糙米）和玉米样品各4份（具体数据见附件5），其中中检维康和博欧实德是定量检测，其它四家是定性检测。

验证试糙米样品的黄曲霉毒素B1浓度含量区间5.2-14.4μg/kg，玉米样品的黄曲霉毒素B1浓度含量区间17.0-23.0μg/kg。

通过验证实验，表明6家检测卡厂家的快速检测结果均未取得理想结果。

其中分析助手（苏微）和中检维康的结果全部是阴性，应考虑检测卡的准确性和实用性。

其他的四家（快灵、博恒、华安和博欧实德）存在假阳性和假阴性并存的情况，检测的准确率均未达到80%。

同批次检测卡的平行实验、不同批次之间的稳定性试验检测结果不理想，一致性较差。

对于市场上自行购买的检测卡与前期比对试验厂家提供的检测卡的试验结果差异较大，说明检测卡的质量对检测结果准确判定影响很大。

通过这几年的验证实验，表明检测卡需进一步提高质量，保证检测结果的准确性。

六新旧国家标准的总体对比

无

七技术经济论证及预期的社会经济效果

国际上少数国家针对粮食黄曲霉毒素B1含量的检测制定了快速方法，但我国目前还未制定相关的快速筛选方法标准。

我国是农业大国，农产品种植区分布广泛，粮食在生产、收获、储存和流通过程中，均可能受到黄曲霉毒素B1的污染，特别是在高温高湿的粮食产区，若受灾害性天气影响，这一问题会更加突出。

处在粮食流通前沿的收购环节长期以来存在检不了、检不快的问题。

因此目前在粮食收购环节最需要解决的问题就是建立高效、快速、低成本的定性检测方法。

对于从源头上控制粮食黄曲霉毒素污染十分重要。

2011年8月18日

附件1:

检测卡对糙米和玉米的的快速测定结果

样品

理论值/μg/kg

验证单位

厂家

拜发

快灵

双试验结果

双试验结果

1

2

1

2

糙米1

1

湖北

<4μg/kg，阴

<4μg/kg，阴

阴

阴

糙米2

4.8

4—10μg/kg，阴

4—10μg/kg，阴

阴

阴

糙米3

16.6

10—20μg/kg，阳

10—20