3T3L1细胞诱导分化之欧阳史创编.docx
《3T3L1细胞诱导分化之欧阳史创编.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《3T3L1细胞诱导分化之欧阳史创编.docx(6页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
![3T3L1细胞诱导分化之欧阳史创编.docx](https://file1.bdocx.com/fileroot1/2023-6/9/4c669e95-cca1-4c36-85a1-1489adceb894/4c669e95-cca1-4c36-85a1-1489adceb8941.gif)
3T3L1细胞诱导分化之欧阳史创编
首先细胞数一定要够,接触抑制后,加诱导液,诱导液一(IBMX是SIGMA的,浓度我用0.5mmol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍,DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO溶,Ins我用的人用胰岛素,医院买的),最主要的是要细胞代数20代以内,换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.
时间:
2021.02.10
创作:
欧阳史
让细胞长满以后,接触抑制2天(是细胞退出生长周期),加入含有IBMX(一般使用浓度0.5mmol/L),DEX(地塞米松,一般使用浓度是1umol/L)和insulin(胰岛素,一般使用浓度1-10ug/ml)的培基2天,再换成只含胰岛素的培基2天,然后每两天换液(普通培基)。
这是分化的步骤,但是最关键的是细胞的传代次数,我现在就在做诱导,细胞传代次数较多,分化率很低。
一般说不能超过20代,最好在10代以内。
诱导分化中,细胞的传代数和状态是最重要的。
诱导剂的配制
IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):
分子量:
222.2(Sigma:
I5879)-20度保存
用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml(0.5mol/L)储存液
终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。
DEX:
分子量:
392.5(Sigma:
D4902)-20度保存
用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液
终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。
可用2年。
Insulin:
分子量:
6000,4度保存
原液为诺和灵R:
400IU/10ml
终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。
4度保存
3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化
1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板,用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5%CO2培养;
2)待细胞长满至80-90%,融合2天(融合的意思是指让细胞接触抑制,就是长满后换液让其再长两天)后,加含终浓度为0.5mmol/LIBMX(储存液浓度0.5mmol/L)、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h;(诱导剂临用时再加到培液中混匀)
3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h,48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养,2天后换培养液一次,诱导分化8~12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型,可用于实验。
诱导操作注意事项:
1、一共需诱导3次,每次诱导的时间点最好固定,保证诱导剂作用够48h,若时间冲突诱导的时间只可延长,不可短于48h。
2、诱导操作需注意:
以6孔板为例,每孔3ml培液,一个6孔板需18ml培液,则第一次诱导时诱导剂的剂量分别是:
IBMX18ul(储存液),DEX7.2ul储存液,胰岛素108ul(储存液)。
第一遍诱导时用200ul的移液枪先每孔加200ul配制好的诱导液,沿孔壁边缘来回横着划慢慢注下培液,动作一定要慢,不然细胞会飘起来,俗称卷边。
每孔加5遍200ul培液,合计1ml,第二、三遍则每孔1000ul加培液,方法同上,操作要慢、轻。
3、第2次诱导时,诱导剂的配制为:
18ml培液,加胰岛素108ul(储存液),混匀,操作步骤同前。
第一次和第二次诱导很重要,动作一定要慢。
第3次诱导诱导仅需换10%高糖DMEM培液,但操作步骤同前,一般结果好的话第三次诱导之前细胞内可见少量小脂滴,培液变黄,因为细胞里有脂滴了所以培液看起来就黄了。
4、第三次诱导以后,可见细胞内脂滴变大,但此时仍有细胞内的脂滴刚诱导出来,需要两天后再次换液,此时换液则可每次1ml的培液换,一般换液2天后几乎所有细胞内均可见脂滴,且脂滴较大,可用于加药处理。
细胞是否诱导成功细胞代数很重要,我们这边一般是13代以后的细胞就很难诱导出来了,代数越靠后,细胞状态越不好,越容易卷边。
3T3-L1细胞的诱导分化,在前两天的融合期的时候,确定你用的是DMEM高糖+小牛血清,在细胞高度融合以后才能开始进行第一阶段的诱导(MDI诱导,DMEM高糖+胎牛血清),第一阶段后,细胞中可以观察到细胞已经开始变圆,第二阶段的诱导(insulin诱导,DMEM高糖+胎牛血清),细胞中就可以观察到脂肪滴,进入第三个阶段的诱导的时候,脂肪滴的聚集更加明显。
诱导剂如地塞米松是需要乙醇溶解的,IBMX是在一定浓度的KOH溶解的,insulin是在一定浓度的HCL中溶解的,诱导分化的程度也和细胞有关,同为3T3-L1细胞,但是每种细胞的分化能力有很大的差异,在没有进入分化诱导的时候,一定不能用胎牛血清来养细胞!
在分化期有少量的细胞出现死亡是正常的!
两天进行一次换液,因此一定要小心被污染!
祝各位实验顺利!
共同学习!
因为3T3-L1加入诱导剂以后,收缩得很厉害,比较脆弱,很容易就飘起来。
所以加诱导剂的时候,手法要特别轻,最好用枪头加,不要用移液管,因为移液管家的时候很难控制流速,力度大。
用枪头加诱导剂的时候,一定要贴壁加,让液体慢慢留下,这样对细胞的冲击小。
我正在做诱导分化,感觉细胞飘起来一小部分的话,还是能用,没有什么大的影响,如果范围比较大的话最好重新诱导。
你的诱导剂的浓度与一般人用的浓度不太一样。
IBMX大家一般都是用0.5mmol/L,胰岛素一般都是1-10ug/ml,dex有用0.25,1,10umol/L的。
另外,不知道你买的胰岛素是水溶性的吗?
因为一般的胰岛素是不溶于水的,但是在酸性环境中溶于水,所以配液时需要加一点稀盐酸使胰岛素溶解。
其他两种诱导剂你的配液方法没有问题。
镜下观察细胞接触抑制什么形态?
这有什么可说的吗,不就是长满了吗,互相接触在一起了,如果你的细胞出现叠丛现象了,那么就是接触抑制过度了,那细胞就更容易飘起来了。
这就需要你自己把握好时机,因为要使接触抑制时间不够的话,细胞没有退出生长周期,诱导剂就不会起作用;如果接触抑制过度的话,细胞很容易就飘起来。
你自己需要自己摸索
一定要在细胞状态好的情况下诱导分化,3T3-L1长得非常快,如果长满以后不换液,会有大批细胞死亡,判断细胞好坏的标准是cellconfluent后,培养基中很少有漂浮的死亡细胞。
所以诱导前传代的细胞在接种时数量不要太大,最好在10*4数量级,这样让细胞长3天后铺满,再换液,再让细胞长2-3天,这时的细胞会退出生长周期,进入growtharrest状态。
2,IBMX的溶解方法有多种,不同文献有不同方法,DMSO,乙醇,浓盐酸,KOH溶液都可,针对你所说的出现结晶问题建议你用1MKOH试试,即0.0115gIBMX+940ulddhH2O+60ulKOH,
3,胰岛素浓度大一点只会促进分化,不会有抑制作用,因为Preadiopocyte细胞膜上胰岛素受体很少,所以需加超过生理浓度的insulin,以其激活细胞膜上的IGF1受体,通过IGF1通路来诱导分化。
我用的方法是美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细),现发给各位战友共享,呵呵.如果不能成功分化的话,只能质疑细胞的问题了.
3T3-L1DifferentiationProtocol
MATERIALS
Dulbecco'sModifiedEaglesMedium(DMEM;GibcoBRL-Cat#11965-084:
highglucose,withL-glutamine,withpyroxidineHCl,withoutsodiumpyruvate)
CalfSerum(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot#1060198)
FetalBovineSerum(GibcoBRL-Cat#10437-028/Lot#1026566)-filtersterilize(0.22umfilter)beforemixedintoDMEM
Isobutylmethylxanthine(IBMX;SigmaI-7018)
Dexamethasone(SigmaD-4902)
Insulin(Bovine;SigmaI-5500)
MEMSodiumPyruvate(100mM;GibcoBRLCat#11360-070)
Pen/Strep/Glutamine(100xP/S/G;GibcoBRLCat#10378-016)
SOLUTIONS
10%CalfSerum/DMEM
60mLCalfSerum
6mL100mMMEMSodiumPyruvate
6mL100xP/S/G
500mLDMEM
10%FBS/DMEM
60mLFetalBovineSerum(FilterSterilized)
6mL100mMMEMSodiumPyruvate
6mL100xP/S/G
500mLDMEM
IBMXSolution(makefresh)a)DissolveIBMXinasolutionmadeof0.5NKOHtoafinalconcentrationof0.0115g/mL.
b)Filtersterilizethrougha0.22mmsyringefilter.
InsulinStockSolution
167uM(1mg/mL)in0.02MHCl
Filtersterilizedthrough0.22mmfilter
Canstoreat-20Cforlongterm,4Cshortterm.DexamethasoneStockSolutions
FreezerStock:
10mMofDexin100%ethanol(storeat-20C)
WorkingStock:
DiluteFreezerstockto1mMinPBS
Filtersterilizeandstoreat4C.
MDIInductionMedia(10mL/10cmplate;5mL/6cmplate)
Torequiredvolumeof10%FBS/DMEMadd:
1:
100IBMX
1:
1000Insulin
1:
1000Dexamethasoneworkingstock
InsulinMedia(10mL/10cmplate;5mL/6cmplate)
Torequiredvolumeof10%FBS/DMEMadd:
1:
1000Insulin
METHOD
Preadipocytemaintenanceandpassage:
Weplatethecellsin10%CS/DMEMontreatedpolystyreneculturedishesfromCorning(Cat#430167)andincubatethemat37Cin10%CO2.Itisimportanttofeedthepreadipocyteseverycoupleofdaysandavoidlettingthemgettooconfluent(>70%),ifyouwanttocontinuetopassagethemanddifferentiatethematalaterdate.So,takecaretosplitthemappropriately.Theycanbesplitasfaras1:
15,thoughweusuallydo1:
10orlessdependingonneed.
AdipocyteDifferentiationProtocol:
1.Growpreadipocytestoconfluencyin10%calfserum/DMEM
2.Twodayspostconfluency(DAY0)stimulatethecellswithMDIinductionmedia.Youwillnoticeadistinctchangeinthemorphologyofthecells(becomemorespindly)inthenext2days.
3.TwodaysafterMDI(DAY2)changethemediatoInsulinMedia.Themediawillbegintogetmoreviscousasfreefattyacidsareproducedbythecellsandsecretedintothemedia.
4.Twodayslater(DAY4)changemediato10%FBS/DMEM.Feedcellswith10%FBS/DMEMeverytwodays.FulldifferentiationisusuallyachievedbyDAY8.
时间:
2021.02.10
创作:
欧阳史